王 艷，邱樹毅，王 嘯，胡 娜，唐佳代，吳鑫⒈*

（1.貴州大學 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

紫色紅曲霉FBKL3.0018液態(tài)發(fā)酵產紅曲色素條件的優(yōu)化研究

王 艷1，2，邱樹毅1，2，王 嘯1，2，胡 娜1，2，唐佳代1，2，吳鑫⒈1，2*

（1.貴州大學 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

以分離自貴州某濃香型酒廠中溫大曲的紫色紅曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018為研究對象，以發(fā)酵液中紅曲色素色價為考察指標，對紫色紅曲霉FBKL3.0018產紅曲色素的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化。考察了碳源、氮源、無機鹽、生長因子及初始pH值對紅曲色素生產的影響，選取對紅曲色素生產影響較顯著的蛋白胨、FeSO4和初始pH進行響應面優(yōu)化試驗。得到最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖60 g/L、蛋白胨26 g/L、FeSO40.9 g/L、L-谷氨酸2 g/L和初始pH 4.5。在此優(yōu)化條件下，紅曲色素色價為105.22 U/mL，比優(yōu)化之前（33.62 U/mL）提高了3.13倍。同時，通過驗證試驗，實際值105.22 U/mL與預測值108.82 U/mL相對誤差為0.97%，說明所建立的回歸模型可靠。

紫色紅曲霉；紅曲色素；液態(tài)發(fā)酵；響應面法；優(yōu)化

紅曲色素是紅曲霉代謝過程中形成的一系列聚酮類混合物[1]，由黃色素、桔黃色素和紅色素組成，是微生物生產的純天然色素，主要成分有紅曲素、紅曲黃素、紅斑胺、紅曲紅胺、紅斑素及紅曲紅素[2]。紅曲色素具有抑菌和增強免疫力[3]的功效，已成為醫(yī)藥衛(wèi)生[4-5]、防腐保健和食品著色[6-10]、紡織[11-16]等領Ⅱ研究開發(fā)的熱點。

紅曲色素可通過固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵的方法獲得，但傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵產紅曲色素的方法因生產過程繁雜、得率較低、生產周期長等缺點滿足不了市場需要，嚴重制約了紅曲色素的工業(yè)化生產及應用[17]。而液態(tài)發(fā)酵產紅曲色素具有生產安全、穩(wěn)定、生產周期短等特點，但紅曲色素色價偏低。有學者通過研究紅曲霉菌的發(fā)酵工藝[18-20]、發(fā)酵條件[21-23]和培養(yǎng)基成分[24-25]來促進紅曲色素產量增加。

紫色紅曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018分離自貴州某濃香型酒廠中溫大曲[26]，其來源安全，實用價值高。本試驗通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗設計和響應面分析對其紅曲色素研究，通過考察發(fā)酵培養(yǎng)基組分、生長因子以及初始pH對其產紅曲色素的影響，以期為提高該菌在白酒生產及其他方面的實用價值奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色紅曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018：篩選自貴州某濃香型酒廠中溫大曲。

磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、無水氯化鈣（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨：上海博微生物科技有限公司；L-谷氨酸（L-glutamic acid，L-Glu）（純度≥99%）：上海源葉生物科技有限公司，純度≥99%；無水乙醇：天津市富于精細化工有限公司；FeSO4：成都金山化學試劑有限公司；B族維生素：北京奧博星生物技術有限責任公司。

斜面培養(yǎng)基采用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（malt extract agar，MEA）；種子培養(yǎng)基：麥芽糖40g/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，KH2PO42g/L，pH自然，用蒸餾水配制，121℃濕熱滅菌20 min；基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨20 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，pH自然，用蒸餾水配制，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

ThermoFisher臺式高速冷凍離心機：美國ThermoFisher公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；723型可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司制造；PHS-3CpH計：上海鴻蓋儀器有限公司；HH數顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇市中大儀器廠；ZQPL-200振蕩培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

（1）菌種活化

將轉接好的菌種斜面放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱，斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)活化5～7 d。

（2）種子培養(yǎng)

將活化好的菌種用接種環(huán)刮至裝有玻璃珠的無菌生理鹽水中，30℃，160 r/min，振蕩1 h，經無菌脫脂棉過濾后鏡檢，制成1×107～108個/mL的孢子懸液。接種體積分數9%的接種量將孢子懸液至裝液量為50 mL/250 mL種子培養(yǎng)液中30℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)18 h。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)

接種體積分數9%的種子培養(yǎng)液至裝液量為50 mL/250 mL基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、160r/min搖瓶培養(yǎng)96h。

1.3.2 紫色紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)產紅曲色素的試驗設計

（1）單因素試驗設計

在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基基礎上，通過改變碳源（乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖）及碳源質量濃度（20g/L、40g/L、60g/L、80 g/L、100 g/L）、氮源（氯化銨、硝酸鈉、蛋白胨、全脂奶粉、脫脂奶粉）及氮源質量濃度（10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L）、無機鹽、生長因子、發(fā)酵液初始pH值，以紅曲色素色價為考察指標，對發(fā)酵培養(yǎng)基組成進行單因素試驗，每組試驗重復3次，試驗結果取其均值。

（2）Plackett-Burman試驗設計

采用Design-Expert軟件中N=12的Plackett-Burman試驗設計，以紅曲色素色價（Y，U/mL）響應值，對培養(yǎng)基中的碳源、氮源、無機鹽、生長因子及初始pH進行篩選，每個因素設置+1和-1水平，為了避免遮掩其他因素的重要性，+1水平取-1水平的1.25倍進行試驗，每組試驗重復3次，試驗結果取其均值。

（3）響應面分析法

根據Plackett-Burman試驗設計結果，選取對紅曲色素生產影響較顯著的蛋白胨、FeSO4、初始pH 3個因素為自變量，以紅曲色素色價（Y）為響應值，采用Box-Behnken進行中心組合設計，進行3因素3水平試驗，每組試驗重復3次，試驗結果取其均值。

1.3.3 測定方法

色價測定：根據林元山等[27-28]的色價測定方法改進如下，取1 mL發(fā)酵液加入裝有9 mL體積分數90%的乙醇水溶液的試管中，加塞、搖勻，靜置18 min后，取上清液，用體積分數90%的乙醇水溶液稀釋250倍數，體積分數90%乙醇水溶液作對照。采用可見光分光光度計，檢測波長350 nm處黃色素吸光度值、470 nm處橙色素吸光度值和510 nm處紅色素吸光度值。吸光度值乘稀釋倍數即為發(fā)酵液色價，最后將3組色素色價疊加，即為胞外紅曲色素色價。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 碳源對產紅曲色素的影響

以基礎發(fā)酵培養(yǎng)作對照，考察不同碳源（添加量40g/L）對產紅曲色素的影響，試驗結果如圖1所示，相同試驗條件下，不同濃度的葡萄糖對紅曲色素產量的影響如圖2所示。

圖1 不同碳源對紫色紅曲霉FBKL3.0018產紅曲色素的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

由圖1可知，葡萄糖作為單糖能更快被菌體利用，對紅曲色素分泌影響最大，產物積累最多，紅曲色素色價為41.5 U/mL；其次為蔗糖，紅曲色素色價為37.5 U/mL；可溶性淀粉或乳糖作為碳源時紅曲色素的色價較低，分別為20.5U/mL、15U/mL。

由圖2可知，當葡萄糖含量為60 g/L時，紅曲色素色價最高，為45.9 U/mL；其次為葡萄糖含量為40 g/L、80 g/L，紅曲色素色價分別為41.6 U/mL、39.2 U/mL；葡萄糖含量為20g/L、100g/L時紅曲色素的色價較低，分別為26.2 U/mL、27.1 U/mL。

圖2 不同葡萄糖含量對紫色紅曲霉FBKL3.0018產紅曲色素的影響Fig.2 Effects of different glucose contents on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

2.1.2 氮源對產紅曲色素的影響

以基礎發(fā)酵培養(yǎng)作對照，考察不同氮源（添加量2g/L）對紅曲色素產量的影響，試驗結果如圖3所示。由圖3可知，蛋白胨對紅曲色素影響最大，紅曲色素色價為59.25U/mL。

圖3 不同氮源對紫色紅曲霉FBKL3.0018產紅曲色素的影響Fig.3 Effects of different nitrogen source on pigment production by M.purpureusFBKL3.0018

相同試驗條件下，不同濃度的蛋白胨對紅曲色素產量的影響如圖4所示。由圖4可知，當蛋白胨含量為25 g/L時，紅曲色素產量最高，紅曲色素色價為65 U/mL。

圖4 不同蛋白胨含量對紫色紅曲霉FBKL3.0018產紅曲色素的影響Fig.4 Effects of different peptone contents on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

2.1.3 無機鹽對產紅曲色素的影響

以基礎發(fā)酵培養(yǎng)作對照，考察不同無機鹽（添加量2g/L）對紅曲色素產量的影響，試驗結果如圖5所示。由圖5可知，FeSO4對紅曲色素的促進作用較為明顯，紅曲色素色價為74.25U/mL。

圖5 不同無機鹽對紫色紅曲霉FBKL3.0018產紅曲色素的影響Fig.5 Effects of different mineral salts on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

相同試驗條件下，不同濃度的FeSO4對紅曲色素產量的影響如圖6所示。由圖6可知，1g/L的FeSO4對代謝物紅曲色素分泌影響最大，紅曲色素色價為93.75U/mL。

圖6 不同FeSO4含量對紫色紅曲霉FBKL3.0018產紅曲色素產量的影響Fig.6 Effects of different FeSO4contents on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

2.1.4 生長因子對產紅曲色素的影響

圖7 不同生長因子對紫色紅曲霉FBKL3.0018產紅曲色素的影響Fig.7 Effects of different growth factors on monascus pigment production byM.s purpureusFBKL3.0018

以基礎發(fā)酵培養(yǎng)作對照，不同生長因子（添加量3g/L）對紅曲色素產量影響結果如圖7所示。由圖7可知，L-谷氨酸對紅曲色素的形成影響最大，紅曲色素色價為41.5U/mL。

相同試驗條件下，不同濃度的L-谷氨酸對紅曲色素產量的影響結果如圖8所示。由圖8可知，L-谷氨酸含量為2g/L條件下，紅曲色素色價最高為44.5 U/mL。

圖8 不同L-谷氨酸含量對紫色紅曲霉FBKL3.0018產紅曲色素的影響Fig.8 Effects of different L-Glu contents on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

2.1.5 初始pH對產紅曲色素的影響

以基礎發(fā)酵培養(yǎng)基作對照，不同初始pH對紅曲色素產量影響結果，如圖9所示。

圖9 不同初始pH值對紫色紅曲霉FBKL3.0018產紅曲色素的影響Fig.9 Effects of different pH values on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

由圖9可知，不同起始pH對紅曲色素形成的差異較大。當發(fā)酵液初始pH 4.8時，紅曲色素產量最大，紅曲色素色價為48.1 U/mL。

2.2 培養(yǎng)基Plackett-Burman試驗設計及結果

Plackett-Burman試驗設計及結果見表1，各因素主效應分析見表2。

表1 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 1 Design and results of Plackett-Burman experiments

續(xù)表

表2 Plackett-Burman因素水平及主效應分析Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman experiments and main effects analysis

由表2可知，在95%水平以上的影響因素有：蛋白胨、FeSO4、初始pH值。所以本研究選取這3個差異比較顯著的因素進行下一階段的響應面分析。

2.3 紫色紅曲霉FBKL3.0018產紅曲色素響應面優(yōu)化結果

（1）響應面優(yōu)化結果及回歸模型方差分析

在Plackett-Burman試驗設計和主效應分析的基礎上，根據Box-Behnken中心組合設計進行3因素3水平試驗，中心組合試驗設計因素與水平見表3，試驗設計及結果見表4。

表3 中心組合試驗設計因素與水平Table 3 Factors and levels of central composite design

表4 Box-Behnken試驗設計及結果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments

續(xù)表

表5 回歸方程方差分析Table 5 Variance analysis of regression equation

對回歸模型進行方差分析，由表5可知，P＜0.01，失擬項P＞F值＞0.05，說明回歸模型極顯著，失擬檢驗不顯著，即該模型在所研究區(qū)Ⅱ內擬合性較好。

利用中心組合試驗設計，用Design-Expert 8.06軟件對試驗結果進行多元回歸分析，得到紫色紅曲霉FBKL3.0018所產紅曲色素對蛋白胨（X1）、FeSO4（X2）、初始pH（X3）的擬合回歸方程為：Y=105.54-0.31X1-1.44X2+1X3+1.29X1X2-4X1X3+0.34X2X3-3.28X12-2.99X22-6.21X32。

針對擬合的回歸方程進行誤差統(tǒng)計分析，分析結果見表6。

表6 回歸方程誤差統(tǒng)計分析Table 6 Statistical analysis of regression equations

由表6可知，R2=0.979 3，R2Adj=0.952 8這兩個值高且接近，表明回歸模型足以解釋生產紅曲色素的培養(yǎng)基優(yōu)化過程，能夠解釋97.93%試驗所得紅曲色素產量的變化，所以方程擬合較好；變異系數（coefficient of variation，CV）＜10%，說明試驗可信度強及精確度較高。綜上說明該回歸方程給紫色紅曲霉FBKL3.0018生產紅曲色素提供了一個良好的模型。

（2）相應曲面和等高線圖率

根據回歸方程分別做出兩兩試驗因素間交互作用三維立體響應曲面圖和等高線如圖10所示，它們分別反⒊了初始pH值、蛋白胨、FeSO4這3個因素間兩兩交互作用對響應值的影響。由回歸方程知，二次項系數都為負值，表明所表征的拋物面向下，出現有極大值。采用Design-Expert8.06軟件進行分析，得到形成紅曲色素的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為蛋白胨26.2 g/L、FeSO40.9 g/L、初始pH 4.51。

圖10 蛋白胨、初始pH和FeSO4交互作用對紫色紅曲霉FBKL3．0018產紅曲色素影響的響應曲面及等高線Fig．10 Response surface plots and contour line of effects of interaction of peptide，initial pH and FeSO4on monascus pigment production byM．purpureusFBKL3．0018

（3）回歸模型驗證試驗

為了方便實際操作，修改培養(yǎng)基配方為蛋白胨26 g/L、FeSO40.9 g/L、初始pH 4.5。驗證響應面所建模型的預測值，用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行3次重復試驗，3次試驗結果均值為105.22 U/mL，與預測值108.82 U/mL較接近，相對誤差為0.97%。表明預測值與實際值具有較好的擬合性，優(yōu)化模型切實可靠。同時，優(yōu)化后的紅曲色素色價（105.22 U/mL）是優(yōu)化前（33.62 U/mL）的4.13倍，說明本試驗設計的優(yōu)化方案合理可行，得到的培養(yǎng)基能明顯提高紅曲色素的產量。

3 結論

在單因素試驗基礎上，采用Plackett-Burman試驗設計，利用響應面對紫色紅曲霉FBKL3.0018產紅曲色素的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化，建立產紅曲色素回歸模型，經驗證試驗證明該模型切實可行。確定紫色紅曲霉FBKL3.0018代謝產紅曲色素的最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖60 g/L、蛋白胨26 g/L、FeSO40.9 g/L、L-谷氨酸2 g/L和初始pH 4.5，在此條件下，紅曲色素色價為105.22 U/mL，是優(yōu)化前的4.13倍。

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Optimization of submerged fermentation conditions ofMonascus purpureusFBKL3.0018 for monascus pigment production

WANG Yan1,2,QIU Shuyi1,2,WANG Xiao1,2,HU Na1,2,TANG Jiadai1,2,WU Xinying1,2*
（1.Guizhou Key Lab of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China）

UsingMonascus purpureusFBKL3.0018 isolated from medium temperature Daqu of Guizhou Luzhou-flavor distillery as research object,the monascus pigment color value of fermentation broth as investigation index,the medium formula ofM.purpureusFBKL3.0018 fermentation for pigment production was optimized.The effects of carbon source,nitrogen source,inorganic salt,growth factors and initial pH on the production of monascus pigment were investigated,and the factors（peptone,FeSO4and initial pH）significantly affecting the pigment production were optimized by response surface methodology.Results showed that the optimal medium formula was glucose 60 g/L,peptone 26 g/L,FeSO40.9 g/L,L-Glu 2 g/L and initial pH 4.5.Under the optimized medium,the color value of the monascus pigment was 105.22 U/ml,which was 3.13 times that of before optimization （33.62 U/ml）.At the same time,through validation experiments,the relative error between the actual value （105.22 U/ml）and the predicted value （108.82 U/ml）was 0.97%,which indicated that the established regression model was reliable.

Monascus purpureus;monascus pigment;submerged fermentation;response surface methodology;optimization

TQ929.2

0254-5071（2017）12-0057-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.012

2017-10-09

貴州省科技計劃項目黔科合LH字（【2014】7675）

王 艷（1990-），女，碩士研究生，研究方向為微生物與發(fā)酵技術。

*通訊作者：吳鑫⒈（1975-），女，副教授，碩士，研究方向為酶工程。