賈芳芳，孫思睿，孟祥晨*

（東北農(nóng)業(yè)大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

luxS基因介導乳酸菌益生特性研究進展

賈芳芳，孫思睿，孟祥晨*

（東北農(nóng)業(yè)大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

一些乳酸菌具有高腸道耐受性、高粘附腸上皮細胞和產(chǎn)具有抑菌活性的細菌素等益生特性。某些乳酸菌的細菌素合成量、耐受性及黏附特性可以被誘導物-2（autoinduction-2，AI-2）提高，AI-2是通過甲基循環(huán)合成的一種信號分子。luxS基因可以編碼合成LuxS蛋白，而LuxS蛋白是AI-2合成的關(guān)鍵酶，因此展開對luxS在細菌素合成量和耐受性、黏附特性方面的作用研究具有重要意義。該文通過討論luxS基因在乳酸菌益生特性的研究現(xiàn)狀，提出該研究領(lǐng)Ⅱ中存在的問題以及發(fā)展趨勢，從而為提高乳酸菌的益生特性提供理論依據(jù)。

AI-2/luxS；乳酸菌；細菌素；耐受性；黏附特性

乳酸菌是目前世界公認安全的食品級微生物（generally regard as safe，GRAS），已廣泛應用于食品相關(guān)技術(shù)中。為了能夠有效地適應變化的環(huán)境條件，乳酸菌需要群體感應（quorum sensing，QS）系統(tǒng)來檢測特定的環(huán)境信號[1]。

QS被稱為“依賴細胞密度的基因表達”，也被稱為“細胞與細胞之間的交流”[2]。信號分子和雙組分調(diào)控系統(tǒng)共同調(diào)控群體感應，群體感應是細菌之間通過化學信號分子進行信息傳遞的一種形式。信號分子分為三類：即自誘導肽（auto-inducing polypeptides，AIP）、 自體誘導物-1（autoin duction-1，AI-1）-酞基高絲氨酸內(nèi)酯類化合物和AI-2[3]。AI-2是G-和G+中共有的AI-2/LuxS QS系統(tǒng)的信號分子，由S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）轉(zhuǎn)化成的呋喃硼酸二酯，它是合成脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）和蛋白質(zhì)的重要輔助因子，經(jīng)至少三步酶促反應完成[4]。SAM作為甲基供體轉(zhuǎn)化生成S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH），然后被SAH核苷酸酶水解為S-核糖高半胱氨酸（S-ribosylhomocy-steine，SRH）和腺嘌呤，隨后，luxS基因編碼的LuxS蛋白催化SRH生成同型半胱氨酸和4,5-二羥基-2,3-戊二酮（4,5-dihydroxy-2,3-pentanedion，DPD），最后DPD進一步環(huán)化、重排形成AI-2[4]。

DNA數(shù)據(jù)庫分析顯示，包括大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等30多種G-和G+中都含有高度保守的luxS同源基因。luxS肩負著代謝和信號傳遞的雙重功能，迄今，luxS介導乳酸菌益生特性的研究內(nèi)容主要包括細菌素、抗脅迫能力和黏附能力三方面，本文綜述了luxS基因在乳酸菌細菌素、抗脅迫能力和黏附能力三方面的研究現(xiàn)狀，提出該研究領(lǐng)Ⅱ中存在的問題以及發(fā)展趨勢，以期為通過luxS基因的表達量改善乳酸菌的益生特性提供理論依據(jù)。

1 luxS基因介導乳酸菌細菌素產(chǎn)生特性的研究

1.1 細菌素的定義與分類

在21世紀，細菌素的定義為核糖體合成的具有生物活性的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復合物，有殺菌作用或抑菌功能，且抑菌譜中包含G-和G+[5]。乳桿菌屬、片球菌屬、肉桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬和鏈球菌屬都能產(chǎn)生細菌素。鑒定細菌素的方法多種多樣，如抑菌法、遺傳學法、分子質(zhì)量大小法和其生成方式法。細菌素的分類方法也多種多樣，包括依據(jù)末端氨基酸序列或基因簇的組織同源性、細菌屬和細菌素分子量進行分類[6]。目前，氨基酸理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)是乳酸菌細菌素進行分類的主要依據(jù)。根據(jù)KLAENHAMMER T R[7]提出并經(jīng)過其他學者修改，乳酸菌所產(chǎn)生的細菌素可分為四大類，具體內(nèi)容見表1。其中羊毛硫抗生素，即玉類細菌素，是被報道最多，工業(yè)應用也較為廣泛的一種。

表1 根據(jù)細菌素分子質(zhì)量的分類方法Table 1 Classification methods of bacteriocins according to molecular mass

1.2 AI-2/LuxS QS系統(tǒng)對細菌素產(chǎn)量的影響

當前研究表明，通過與某些G+共培養(yǎng)能夠誘導植物乳桿菌細菌素的合成，且共培養(yǎng)導致植物乳桿菌細菌素合成量增加可能是通過特定的群體感應系統(tǒng)來實現(xiàn)的[8]。BUCKBL等[9]發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）NC8純培養(yǎng)時，無法合成細菌素，當其與乳酸乳桿菌（L.lactis）MG1363共培養(yǎng)時，細菌素合成量可達2 560 IU/mL[10]，由此推測共培養(yǎng)物中自誘導體活性的提高，有利于促進細菌素的合成[11]。MAN L L等[12]將植物乳桿菌（L.plantarum）KLDS1.0391與瑞士乳桿菌（L.helveticus）KLDS 1.9207、屎腸球菌（Enterococcus faecium）KLDS 4.0352、羅伊氏乳桿菌（L.reuteri）KLDS1.0737和糞腸球菌（E.faecalis）KLDS 4.0313共培養(yǎng)，可以明顯升高L.plantarumKLDS1.0391所產(chǎn)細菌素-Plantaricin MG的產(chǎn)量，且L.plantarumKLDS1.0391的活菌數(shù)目達最高的時間短于單獨培養(yǎng)。MANLL等[13]進一步研究發(fā)現(xiàn)，L.plantarumKLDS1.0391與L.helveticusKLDS 1.9207共培養(yǎng)可以增加AI-2信號分子的積累，當其積累到一定程度，被雙組分調(diào)控系統(tǒng)中的組氨酸蛋白激酶識別，經(jīng)過磷酸化或去磷酸化，將信號分子傳遞給感應調(diào)節(jié)子，從而啟動細菌素編碼相關(guān)基因編碼合成細菌素。再者，張筠[14]研究發(fā)現(xiàn)，AI-2信號分子的添加可以誘導L.plantarum KLDS1.0391的細菌素合成量，且可顯著提高L.plantarum KLDS 1.0391細菌素編碼基因及群體感應相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達水平；另外蛋白質(zhì)組學研究結(jié)果表明，當在L.plantarum KLDS1.0391的培養(yǎng)過程添加AI-2信號分子時，該菌中涉及碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、雙組分調(diào)控代謝途徑的相關(guān)蛋白表達水平顯著上調(diào)。

2 luxS基因介導乳酸菌對抗胃腸道脅迫能力的研究

2.1 抗胃腸道脅迫能力

根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）及世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）（2002）的規(guī)定，在正式應用益生菌前，需對其進行一系列試驗以證實其對人體的安全性，并確保益生菌抵達腸道后仍能保持較好的存活力和定殖腸道的能力。具體包括耐酸和膽鹽試驗、黏附于人體上皮細胞或者黏液的能力、對病原菌的黏附抑制能力、水解膽鹽的能力和抑制致病菌的能力。由于體內(nèi)試驗昂貴且耗時，通過可靠的體外試驗，可在選擇新的益生菌株時預測其在體內(nèi)的益生效應[15]。

2.2 乳酸菌食用后可能面臨的環(huán)境脅迫

2.2.1 酸脅迫

由于在食用后，益生菌首先面臨胃部的酸性環(huán)境，因此人們?nèi)找嬷匾暼樗峋谙乐写婊畹哪芰?。已知胃的pH值從1～2可波動至4～5，大多數(shù)體外評價試驗都盡量選擇能夠承受極端低pH值的菌株。

除某些乳酸桿菌、明串珠菌和酒球菌，多數(shù)乳酸菌細胞屬于中性粒細胞（即最佳生長pH值為5～9）。酸應激對菌體生理上的具體影響還不清楚，目前已知的是，酸可以被動擴散通過細胞膜進入細胞質(zhì)，迅速分解成質(zhì)子和帶電的衍生物，使細胞膜不可滲透。胞內(nèi)積累的質(zhì)子可降低細胞內(nèi)pH，從而影響跨膜△pH值，進而有助于質(zhì)子動力勢的增加。內(nèi)部酸化還會降低酸敏感酶的活性并損害蛋白質(zhì)和DNA，游離有機酸陰離子部分在細胞質(zhì)中積累能和重要元素螯合，對細胞生理機能產(chǎn)生不利影響[16]，乳酸菌的酸脅迫反應機制以及質(zhì)子轉(zhuǎn)運與脫羧反應機制分別見圖1和圖2。

圖1 乳酸菌的酸脅迫反應[17]Fig.1 Reactions of lactic acid bacteria to acid stress

圖2 質(zhì)子的轉(zhuǎn)運與脫羧反應[18]Fig.2 Reactions of proton transport and decarboxylation

經(jīng)測試，大部分乳酸菌都存在對數(shù)增長適應性反應，這一反應能夠提高菌體對于致死酸濃度的存活率[15]，不僅有利于乳酸菌應對酸脅迫，也可應對其他應激反應如高溫、滲透壓或氧化應激等。多個關(guān)于對數(shù)增長適應性反應的蛋白質(zhì)組學研究表明，在乳酸菌的酸適應過程中誘導產(chǎn)生大量的蛋白，然而僅有少數(shù)的酸應激蛋白被證實[17]。

2.2.2 膽鹽脅迫

膽鹽是一種生物活性物質(zhì)，由膽固醇轉(zhuǎn)化而來。在正常的生理條件下，人體腸道中膽鹽濃度范圍為0.05%～2.00%。在肝臟中，游離的膽汁酸可在宿主酶的催化下與?；撬峄蛘吒拾彼嵘晒曹椖扄}，它們儲存在膽囊中，消化時釋放到十二指腸發(fā)揮其生理功能，溶解從飲食中吸收的脂肪。乳酸桿菌和雙歧桿菌等腸道細菌已經(jīng)進化出了特異性防Ⅸ機制，以抵抗膽鹽等化合物的有害作用。甾環(huán)的強親脂性干擾細胞膜上的脂質(zhì)和擾亂質(zhì)子動力，從而造成細胞死亡[19]。此外，游離形式的膽酸可以擴散進入細胞，膽酸分解從而導致細胞質(zhì)酸化[20]。膽鹽的其他副作用還包括誘導氧化應激反應和DNA修復機制、糖代謝的改變和蛋白質(zhì)的錯誤折疊[21]。

利用高通量技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，耐膽鹽反應是一種多因素現(xiàn)象，涉及對膽鹽的解毒和抵消對細菌結(jié)構(gòu)有害影響的過程。膽汁酸（鹽）的外排[22]、膽鹽的水解[23]和細胞膜、細胞壁的結(jié)構(gòu)或組成的變化[24]是目前普遍報道過的乳酸菌的耐膽鹽機制。此外，菌體暴露在膽鹽環(huán)境中產(chǎn)生的常見應激反應如抵抗氧化損傷，以及調(diào)整糖酵解途徑等，可能抵消某些由膽鹽化合物造成的細胞損傷[25]。

將積累在細胞質(zhì)中的膽鹽通過外排泵主動排出是菌體應對膽鹽毒性的常見機制[26]，而活性膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSHs）可通過早期解離膽鹽起到保護作用。BSHs可催化甘氨酸和牛磺酸共軛結(jié)合膽汁酸鹽后的解離反應，產(chǎn)生的相應的游離酸可進一步被其他腸道細菌利用進行代謝反應[27]（見圖3）。在乳酸菌和植物乳桿菌中，通過比較野生型菌株和BSHs突變型菌株可確定BSHs活性和膽鹽耐受性的緊密關(guān)系[21]。提高益生菌耐膽鹽特性可有助于發(fā)展對其他技術(shù)上或是胃腸道因素更有抵抗能力的優(yōu)秀菌株[28]。

圖3 膽鹽水解酶參與膽汁酸代謝Fig.3 Metabolic process of bile acid caused by bile salt hydrolase

2.2.3 其他脅迫

在胃腸道中，乳酸菌還會面臨胃腸道中其他物質(zhì)等的脅迫。在遭受各種脅迫過程中，菌體細胞會發(fā)生一系列變化，這些變化包括產(chǎn)生應激蛋白、細胞膜改變、基因表達差異化和改變代謝途徑等[26]。

2.3 AI-2/LuxS QS系統(tǒng)對抗胃腸道脅迫能力的影響

哈氏弧菌是檢測AI-2信號分子的一種報告菌株，SALOOMEH M J等[29]研究指出，在酸脅迫條件下，隨著pH值的降低，L.acidophilusNCFM和鼠李糖乳桿菌GG（L.rhamnosusGG，LGG）的AI-2活性顯著增高，表明微生物可以通過合成更多的AI-2信號分子來應對外界嚴峻的環(huán)境條件。此外，L.acidophilusNCFM和LGG中l(wèi)uxS基因轉(zhuǎn)錄水平顯示出和AI-2活性同樣的變化規(guī)律，一方面證實了luxS是合成AI-2的相關(guān)基因，另一方面說明某些乳酸菌可以通過提高luxS轉(zhuǎn)錄水平使得AI-2活性增高，這暗示出AI-2/LuxSQS系統(tǒng)可能與酸脅迫過程相關(guān)，能夠提高乳酸菌經(jīng)胃腸道后的存活率，并發(fā)揮與腸道內(nèi)其他菌群交流的重要作用[28]。通過全基因組芯片分析，AZCARATE-PERILMA等[30]發(fā)現(xiàn)，L.acidophilusNCFM雙組分信號分子轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的突變株與野生型菌株相比，對酸更為敏感，且酸脅迫會導致包含luxS在內(nèi)的80多個基因上調(diào)其表達量。同時，LEBEERS等[31]的研究指出，LGG的luxS缺失菌株在胃汁中的存活率降低，表明luxS基因在抗酸脅迫中發(fā)揮重要作用。而luxS基因與乳酸菌膽鹽耐受性的關(guān)系目前為止鮮有報道。

3 luxS基因介導乳酸菌黏附能力的研究

益生菌黏附腸道能夠發(fā)揮的重要益生作用有：改善腸道菌群以及對粘膜和上皮組織上病原菌競爭性黏附等[32]。益生菌抵達腸道后，必須及時在腸道中定殖才能避免腸道蠕動而脫落，使得其在腸道中能形成一層表面保護膜，抑制病原菌的黏附和侵襲。黏附能力還與免疫調(diào)節(jié)關(guān)系密切，由于通過體內(nèi)試驗研究乳酸菌的黏附特性較難，近年來發(fā)展出多種不同的體外模型用于評價乳酸菌的黏附能力，最廣泛應用的模型是從人體腸組織、糞便、回腸造口流出物分離的腸粘液或是組織培養(yǎng)細胞[33]。乳酸菌黏附作用通常依據(jù)在腸粘膜的目標（即黏液組分，細胞外基質(zhì)）、在細菌表面（即表面層蛋白）的定位和錨定到細菌表面的方式（即分選酶依賴性蛋白）進行分類。

（1）黏液結(jié)合蛋白

在大多數(shù)情況下，乳酸菌的粘附作用是由蛋白質(zhì)介導的[34]，也有報道稱糖基和脂磷壁酸也參與其中。目前，乳酸菌黏附的鑒定和功能分析包含三種：羅伊氏乳桿菌（L.reuteri）1063產(chǎn)生的胞外黏液結(jié)合蛋白（Mub）[35]、植物乳桿菌（L.plantarum）WCFS1的凝集素類的甘露糖特異性黏附蛋白（Msa）[34]，和嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）NCFM產(chǎn)生的黏液結(jié)合蛋白（mucin-binding protein）[36]。這3種黏液結(jié)合蛋白在革蘭氏陽性菌中具有相同的典型的Ⅱ[37]。

（2）作為黏附介質(zhì)的分選酶相關(guān)蛋白

細菌的表面蛋白與菌體的黏附、侵襲、信號分子和與宿主免疫系統(tǒng)或環(huán)境的相互作用等重要功能息息相關(guān)[38]。在革蘭氏陽性菌中，某些表面蛋白包含可被分選酶識別的C-末端錨定基序（LPxTG），它分開了T-和G-殘基之間的共價連接，蘇氨酸羧基通過細胞壁肽聚糖前體的橫橋連接至氨基。分選酶反應的產(chǎn)物（一種連接至肽聚糖的表面蛋白）會并入殼層進而展示在細胞表面，然后顯示在微生物表面。因此，這些表面蛋白通常被稱為分選酶相關(guān)蛋白。現(xiàn)已確定了4種乳酸菌分選酶相關(guān)蛋白的功能特征：羅伊氏乳桿菌1063黏液結(jié)合蛋白Mub、植物乳桿菌WCFS1中Msa和嗜酸乳桿菌NCFM中黏液結(jié)合蛋白（mucin-binding protein），第四種是唾液乳桿菌UCC118的LspA蛋白，有研究表明此蛋白能夠介導菌體黏附于人體上皮細胞[37]。

（3）表層黏附蛋白

乳酸桿菌S-層蛋白通常表現(xiàn)出形態(tài)相似的分子晶體陣列，斜點陣結(jié)構(gòu)，占細菌細胞壁蛋白質(zhì)的10%～15%。部分乳酸桿菌的編碼S-層蛋白的基因已經(jīng)成功克隆，測序并登陸在GeneBank中。然而除4株乳酸桿菌S-層蛋白之外，這些蛋白質(zhì)的生物學功能有待驗證[39]。一些已被鑒定的S-層蛋白有相似的結(jié)構(gòu)，如CsbA和Slp的含有細菌S-層蛋白結(jié)構(gòu)Ⅱ[37]。有報道指出這些蛋白與調(diào)節(jié)黏附腸上皮細胞和細胞外基質(zhì)等的能力有關(guān)。此外，這些蛋白被證明在防止病原菌黏附上皮細胞過程中有重要作用[40]。

（4）其他蛋白

除了某些乳酸桿菌，研究表明乳酸菌表面蛋白的黏附能力與對各種胞外基質(zhì)的黏附性有關(guān)，如介導黏附于細胞外基質(zhì)的蛋白。此外，乳酸菌中還存在介導黏附的特異性乳酸菌蛋白，在黏附作用中發(fā)揮著重要作用[37]。

（5）非蛋白介導的黏附作用

脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）是強負電荷的多醇磷酸酯聚合物，在約氏乳桿菌NCC 533中該分子與黏附Caco-2細胞有關(guān)。除了LTA，由乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖也影響對腸的黏附作用，其可以松弛地附著于細胞表面或被分泌到環(huán)境中[41]。在嗜酸乳桿菌CRL639中，其黏附能力被證實與能夠合成不同類型的胞外多糖有關(guān)[42]。

目前為止，關(guān)于AI-2/LuxS QS系統(tǒng)與乳酸菌在腸道中黏附和定殖能力之間關(guān)系的研究很少。BUCK B L等[9]通過研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌的luxS基因突變株與野生型菌株相比，完全失去了合成AI-2的能力，且突變株黏附于Caco-2細胞的能力較野生型菌株下降了58%。由此推測，AI-2/LuxSQS系統(tǒng)可能在乳酸菌發(fā)揮黏附能力的過程中扮演著重要角色。

4 結(jié)論與展望

luxS基因的表達量直接或間接影響著乳酸菌細菌素合成量、耐受性及黏附特性，且其表達量與特性作用為正相關(guān)關(guān)系。重要的是，該文從一定程度上揭示細胞間信號傳遞的機制，為luxS基因在乳酸菌代謝途徑中的功能作用提供理論依據(jù)。但是迄今，luxS基因介導乳酸菌益生特性的研究內(nèi)容主要包括細菌素、抗脅迫能力和黏附能力三方面，且其在每類乳酸菌菌種中的每一方面的具體研究機制仍不明確，因此今后對luxS基因在具體的乳酸菌菌種每一條代謝途徑中具體的功能機制是熱門研究，從而在基因工程方面為乳酸菌益生特性更好的表達提供理論依據(jù)。

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Research progress on probiotic characteristics of lactic acid bacteria mediated byluxSgene

JIA Fangfang,SUN Sirui,MENG Xiangchen*
（Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

Some lactic acid bacteria （LAB）have a variety of probiotic characteristics,such as high intestinal tolerance,high adhesion intestinal epithelial cells and producing bacteriocin that exhibits the antimicrobial activity against pathogenic bacteria.The bacteriocin synthetic amount,tolerance and adhesion characteristics of certain LAB can be increased by autoinduction-2 （AI-2）,which is a signal molecule synthesized by methyl cycle.LuxS protein enzyme,which is encoded byluxSgene,is the key emzyme for AI-2 synthesis.Therefore,it is important to study the role ofluxSgene in bacteriocin synthesis,tolerance and adhesion characteristics.By discussing the research progress ofluxSgene on probiotic characteristics of LAB,the existing problems and development trend in this field were put forward.Thus it provided a theoretical basis for improving the probiotic characteristics of LAB.

AI-2/luxS;lactic acid bacteria;bacteriocin;tolerance;adhesion characteristic

Q939.95

0254-5071（2017）12-0005-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.002

2017-07-12

國家自然科學基金項目（3167101455）

賈芳芳（1990-），女，碩士研究生，研究方向為乳品微生物及乳酸菌代謝產(chǎn)物。

*通訊作者：孟祥晨（1970-），女，教授，博士，研究方向為乳品微生物及乳酸菌代謝產(chǎn)物。