薛曉彤 焦 敬 張倩倩 黃淑紅 黨寧寧

·論著·

RGS4表達上調(diào)對人惡性黑素瘤細胞的M14增殖和遷移的影響

薛曉彤1,2焦 敬3張倩倩3黃淑紅1黨寧寧2

目的明確體外RGS4基因表達上調(diào)對惡性黑素瘤M14細胞中增殖及遷移的影響。方法體外培養(yǎng)M14細胞，分為對照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒)和實驗組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RGS4質(zhì)粒)。RT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染后RGS4 mRNA和RGS4蛋白水平的表達，CCK-8和克隆形成實驗檢測RGS4上調(diào)對惡性黑素瘤M14細胞增殖的影響，劃痕實驗檢測RGS4高表達對M14細胞遷移的影響。結(jié)果實驗組細胞中RGS4 mRNA表達量是對照組的3.25×103倍(P<0.05)，蛋白表達量是對照組的6.73倍(P<0.05)。實驗組M14細胞OD值為1.33±0.07，低于對照組的1.61±0.11(P<0.05)，實驗組M14細胞克隆數(shù)為34±5.53，低于對照組的56±7.68(P<0.05)。實驗組M14細胞遷移能力低于對照組。結(jié)論RGS4高表達能夠抑制體外惡性黑素瘤細胞的增殖和遷移，RGS4在惡性黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。

G蛋白偶聯(lián)受體； RGS4基因； 惡性黑素瘤； 增殖和遷移

惡性黑素瘤是一種來源于皮膚黑素細胞的惡性腫瘤，早期可通過血液和淋巴循環(huán)轉(zhuǎn)移至全身各器官，是皮膚癌的主要死亡原因之一[1]。G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor，GPCR)廣泛存在于人體，其異常激活或過度表達與癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。G蛋白信號通路調(diào)節(jié)蛋白(regulator of G-protein signaling，RGS)是一組具有多種功能的蛋白質(zhì)大家族，在GPCR信號傳導(dǎo)中起重要作用。我們對RGS4 基因表達上調(diào)后惡性黑素瘤M14細胞增殖及遷移的影響做了初步研究，以探討RGS4 基因的表達在黑素瘤中的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 人惡性黑素瘤細胞株M14購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細胞庫。培養(yǎng)液DMEM和胎牛血清購自美國Gibco公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，CCK-8試劑購自北京Solarbio公司，Trizol reagent、qRT-PCR試劑盒、RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、蛋白抽提試劑盒以及RIPA裂解液購自北京康為世紀生物科技有限公司。兔抗人RGS4單克隆抗體和鼠抗人Tubulin單克隆抗體購自英國Abcam公司，RGS4特異性PCR引物由金唯智(蘇州)生物科技有限公司合成，pcDNA3.1-RGS4 vector購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。7300型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) M14細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天傳代1次，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)染 常規(guī)培養(yǎng)M14細胞，將處于對數(shù)生長期的M14細胞接種于6孔板中，次日當細胞融合度達70%～80%時進行轉(zhuǎn)染，分為對照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1)和實驗組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RGS4)。轉(zhuǎn)染采用Opti-MEM、無血清RMPI DMEM和LipofectamineTM2000，參照轉(zhuǎn)染說明書操作。轉(zhuǎn)染后于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，更換新鮮含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24 h。

1.2.3 熒光定量PCR檢測 RGS4 mRNA的表達轉(zhuǎn)染處理后，用Trizol法提取各組細胞的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Green熒光染料，實時熒光定量PCR檢測各組RGS4 mRNA的表達水平。PCR的擴增條件為:95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火+延伸31 s，40個循環(huán)。RGS4引物:正義5’-CTTTTTACAGGACGCAGGCAT-3’，反義5’-CAGCAGGAAACCTAGCCGAT-3’，產(chǎn)物大小139 bp。內(nèi)參β-actin引物:正義5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’，反義5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，產(chǎn)物大小205 bp。計算各組RGS4 mRNA的相對表達量:△CT=待測樣本(CT目的基因-CTβ-actin)，△△CT=△CT轉(zhuǎn)染組-△CT對照組，基因相對表達差異量=2-△△CT。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot檢測RGS4蛋白的表達 轉(zhuǎn)染處理后，提取細胞總蛋白并定量，每組取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入鼠抗人Tubulin單克隆抗體(1∶10000)，兔抗人RGS4單克隆抗體(1∶500) 孵育24 h，加入二抗，之后進行ECL顯影。應(yīng)用Image J軟件，通過與內(nèi)參Tubulin灰度的比值，對RGS4蛋白進行定量分析。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 CCK-8實驗檢測轉(zhuǎn)染前后M14細胞增殖的變化 6孔板培養(yǎng)M14細胞，24 h轉(zhuǎn)染處理后，對照組和實驗組分別接種于96孔板中，調(diào)整細胞密度為100個/孔(100 μL)。分別在24 h、48 h、72 h、96 h后加入10 μL CCK-8試劑，在37℃、5% CO2條件下孵育2 h后，酶標儀測定450 nm處光密度(OD)值。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 克隆形成實驗檢測轉(zhuǎn)染前后M14細胞增殖的變化 轉(zhuǎn)染處理后，將細胞以500個/孔的密度接種到6孔板中，并在37℃下孵育10天，每3天更換一次培養(yǎng)液。用甲醇固定菌落，用0.5%結(jié)晶紫(甲醇∶水=1∶1)染色。然后計數(shù)含有至少50個細胞的菌落數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.2.7 劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染前后M14細胞遷移能力的變化 轉(zhuǎn)染處理后，24 h之后，使用微小吸頭的尖端進行劃痕，產(chǎn)生無細胞的區(qū)域并在顯微鏡下拍照。將細胞在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，48 h后，在顯微鏡下拍照。兩次照片進行對比。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)染后M14細胞中RGS4 mRNA和蛋白水平的表達 pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)染促進M14細胞中RGS4 mRNA和蛋白的表達(圖1)。pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)染M14細胞24 h后，RT-PCR結(jié)果顯示，對照組(pcDNA3.1)RGS4 mRNA相對表達量為1，與對照組相比，實驗組(pcDNA3.1-RGS4)中RGS4 mRNA 的表達量明顯升高(P<0.01)。轉(zhuǎn)染處理24 h后，Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組的蛋白相對表達量(RGS蛋白量/Tubulin蛋白量)顯著升高(P<0.01)。

2.2 pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)染后對M14細胞增殖作用的影響 pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)染后抑制M14細胞的增殖(圖2)。pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)染M14細胞24 h后，CCK-8檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組可明顯抑制惡性黑素瘤M14細胞的增殖(P<0.05)。我們利用克隆形成實驗進一步驗證實驗結(jié)果，克隆形成實驗檢測結(jié)果顯示，與陽性對照組相比，pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)染可明顯抑制M14細胞的增殖(P<0.05)。

圖1 pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)染后M14細胞中RGS4 mRNA(1a)和蛋白(1b、1c)水平的相對表達量**vs pcDNA3.1組P<0.01

圖2 pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)染后抑制M14細胞的增殖。CCK-8實驗(2a)和克隆形成實驗(2b、2c)被用于檢測pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)染后對M14細胞增殖能力的影響。*vs pcDNA3.1組P<0.05

2.3 pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)染后對M14細胞遷移作用的影響 pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)染后抑制M14細胞的遷移見圖3。pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)染M14細胞24 h后進行處理拍照，再過48 h第二次拍照，兩次照片進行對比，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RGS4能夠使惡性黑素瘤M14細胞的遷移能力明顯降低。

圖3 pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)染后抑制M14細胞的遷移。細胞劃痕實驗被用于檢測pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)染后對M14細胞遷移的影響

3 討論

GPCR是一個龐大的七跨膜螺旋受體家族，它是細胞信號傳導(dǎo)中的重要蛋白質(zhì)。RGS作為GTPase激活蛋白，通過加速Gα亞基結(jié)合的GTP水解，恢復(fù)G蛋白失活狀態(tài)，從而抑制不同的GPCR信號傳導(dǎo)[2]。因此，RGS蛋白是GPCR重要的負性調(diào)節(jié)因子。近年來，RGS基因在癌癥中的表達及其作用的分子生物學(xué)機制成為研究熱點，包括RGS1-5,8,13,16,18和21在內(nèi)的R4 RGS蛋白亞家族。RGS2的異常表達與乳腺癌、前列腺癌、急性骨髓性白血病、卵巢癌和淋巴瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[3]。 RGS3的過表達促進白血病HL-60細胞的凋亡[4]。RGS4作為乳腺癌遷移和侵襲的新型抑制因子，對于控制乳腺癌轉(zhuǎn)移具有重要意義[5]。 RGS5可以抑制卵巢癌細胞的增殖和NSCLC細胞的遷移[6，7]。此外，RGS16可通過表皮生長因子(VEGF)介導(dǎo)抑制乳腺癌細胞增殖[8]，RGS16也與胰腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能是胰腺癌的重要預(yù)后指標[9]。由于R4 RGS蛋白亞家族在癌癥發(fā)展中作用重要，因此加強RGS家族的功能研究可能會在癌癥治療方面產(chǎn)生新的突破。

RGS4是R4 RGS蛋白亞家族的重要成員，除了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)中已得到廣泛研究外，RGS4在癌癥中的研究也已取得一些成果。研究表明，通過GAP介導(dǎo)，RGS4能夠顯著抑制乳腺癌細胞侵襲和遷移能力，蛋白酶抑制劑MG132誘導(dǎo)的內(nèi)源性RGS4蛋白增加有助于抑制乳腺癌細胞的侵襲和遷移[5]。同時，在NSCLC細胞中研究者們觀察到類似的結(jié)果[10]。惡性黑素瘤發(fā)病率逐年上升，其惡性程度高，進展迅速，目前缺乏非常有效的治療手段，目前對其發(fā)病機制的研究主要致力于基因表達及信號通路。因此，我們希望通過對RGS4基因的研究進一步了解惡性黑素瘤的增殖和遷移的發(fā)病機制，從而指導(dǎo)其治療和預(yù)防。

本研究在惡性黑素瘤M14細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RGS4質(zhì)粒，檢測RGS4在mRNA和蛋白水平的表達，結(jié)果顯示，pcDNA3.1-RGS4轉(zhuǎn)染后可以上調(diào)RGS4 mRNA和蛋白水平上的表達。為進一步探討RGS4基因?qū)盒院谒亓黾毎鲋车挠绊?，我們?yīng)用CCK-8和克隆形成實驗，結(jié)果表明RGS4基因上調(diào)明顯抑制惡性黑素瘤細胞的增殖。同時，我們運用細胞劃痕實驗驗證RGS4基因?qū)盒院谒亓黾毎w移的影響，結(jié)果顯示RGS4基因高表達顯著抑制惡性黑素瘤細胞的遷移。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RGS4能夠顯著促進RGS4基因在惡性黑素瘤M14細胞中的表達，并且上調(diào)RGS4基因能夠明顯抑制惡性黑素瘤細胞的增殖和遷移，這提示RGS4基因在惡性黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，從而為惡性黑素瘤病因?qū)W和靶向治療研究提供新的依據(jù)。

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Up-regulationofRGS4inhibitstheproliferationandmigrationofhumanmalignantmelanomacellsinvitro

XUEXiaotong1,2,JIAOjing3,ZHANGqianqian3,HUANGShuhong1,DANGNingning2.

1.SchoolofMedicine,ShandongUniversity,Jinan250012,China；2.DepartmentofDermatology,JinanCentralHospitalaffiliatedtoShandongUniversity,Jinan250013,China；3.DepartmentofDermatology,TheChinesePeople'sLiberationArmy88Hospital,Taian271000,China

DANGNingning，E-mail: 15318816250@163.com

Objective: To determine the influence of pcDNA3.1-RGS4 vector up-regulating RGS4 expression on the proliferation and migration of human malignant melanoma cells in vitro.MethodsThe cells were cultured in vitro, then divided into the control group (pcDNA3.1) and experimental group (pcDNA3.1- RGS4). The expression of RGS4 mRNA and protein in M14 cell was detected by RT-PCR and Western blot. The proliferation of M14 cell was detected by CCK-8 and colon formation assay. The migration of M14 cell was detected by wound healing assay.ResultsThe levels of RGS4 mRNA and protein in the experimental group were 3.25×103and 6.73 times more than that in the control group (Ps<0.05). The OD scores and clone number of M14 cells in the experimental group were 1.33±0.07 and 34±5.53, which was lower than that in the control group (1.61±0.11 and 56±7.68) (Ps<0.05). M14 cellular migration ability in the experimental group was weaker than that in the control group.ConclusionRGS4 up-regulation inhibits the M14 cell proliferation and migration in malignant melanoma. RGS4 may play an important role in the development of malignant melanoma.

GPCR; RGS4 gene; malignant melanoma; proliferation and migration

中國博士后科學(xué)基金特別資助(編號：2014M550370，2015T80740)

1山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院，山東濟南，250012 2山東大學(xué)附屬濟南市中心醫(yī)院皮膚科，山東濟南，250013 3中國人民解放軍第88醫(yī)院，山東泰安，271000

黨寧寧，E-mail：15318816250@163.com

(收稿：2017-08-27 修回：2017-11-15)