李珍柱,焦必寧,王 敏,周 劍,蘇學(xué)素*

(1.西南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院/西南大學(xué)柑桔研究所，農(nóng)業(yè)部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶 400712；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081)

高純橙皮素的制備及HPLC純度分析

李珍柱1,焦必寧2*,王 敏3,周 劍3,蘇學(xué)素1*

(1.西南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院/西南大學(xué)柑桔研究所，農(nóng)業(yè)部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶 400712；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081)

建立了一種基于反相硅膠純化的高純橙皮素制備方法，充分優(yōu)化了上樣量、流速及洗脫液極性等因素，采用紅外光譜法和核磁共振對純化后產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，高效液相色譜法檢測純化前后橙皮素的純度，最終產(chǎn)物的純度達(dá)99.87%。該方法快速簡便、制備量大、分離效率高，每天制備效率可達(dá)到克級，為制備橙皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提供了技術(shù)支撐。

橙皮素；反相硅膠；純化；定性分析；高效液相色譜

橙皮素(Hesperetin)是一種天然黃酮類化合物，屬于二氫黃酮，是蕓香科柑橘屬植物果實(shí)的主要藥效成分，具有抗氧化[1]、抗炎、抗腫瘤抗癌[2]、降血脂、抗病毒[3]等多種生理功能，廣泛應(yīng)用于食品保健藥物及保健品和化妝品添加劑等領(lǐng)域。國內(nèi)外對于橙皮素藥物及其相關(guān)類黃酮活性物質(zhì)在各種水果基質(zhì)和藥物中的分析檢測及其生理功能的研究非常多，但是由于相關(guān)領(lǐng)域一直缺少純度高的純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，導(dǎo)致不同國家、不同實(shí)驗(yàn)室及不同人員開展的相同測量內(nèi)容的分析結(jié)果缺少可比性，因此迫切需要具有良好計(jì)量學(xué)特性的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以甄別分析測量的可靠性和有效性。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[4-5]是指具有一種或多種足夠均勻和很好確定了的特性值[6]，用以校準(zhǔn)設(shè)備、評價(jià)測量方法或給材料賦值的材料或物質(zhì)[7-10]，可以直接將特性量值與國際基本單位(SI單位)聯(lián)系，將測定結(jié)果直接溯源到SI 單位，對分析檢測結(jié)果的可比性具有重要意義。研制橙皮素等類黃酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，不僅可應(yīng)用于相關(guān)柑橘產(chǎn)品溯源與真實(shí)性檢測，還可對添加有相關(guān)類黃酮活性物質(zhì)的保健品、化妝品和醫(yī)藥產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控提供技術(shù)支撐。但標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制需要大量高純原料進(jìn)行均勻性及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，要求純度越高越好，原料純度至少在99%以上。然而市售的原料及合成的原料很難達(dá)到此純度，因此亟需一種可以快速簡便制備大量高純原料的方法。

目前制備高純有機(jī)化合物的方法主要有制備型高效液相色譜法(PHPLC)[11-13]和柱層析法。制備型HPLC會消耗大量流動相，費(fèi)時(shí)，上樣量少，成本高。而反相硅膠[14]具有預(yù)處理簡單、裝柱方便、可重復(fù)利用及分離效率高的優(yōu)點(diǎn)。反相硅膠的制備是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團(tuán)[15]，反相硅膠柱層析是指用非極性固定相和極性流動相組成的色譜體系[16]。因此本研究以橙皮素為原料，反相C18硅膠為柱層析填料，紅外光譜法、核磁共振法及液質(zhì)聯(lián)用[17]為定性方法，采用高效液相色譜法檢測純度，通過單因素多水平試驗(yàn)考察了上樣量、流速及洗脫液比例對于反相硅膠純化橙皮素純化效果的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

美國Waters系列HPLC色譜儀；紫外檢測器；UMX2 型電子天平(分度值為0.1 μg，瑞士梅特勒公司)；Avance Ⅲ型核磁共振儀(瑞士布魯克公司)；NE-1101S旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化Eyela公司)；202型電熱恒溫干燥箱(上?？坪愎?；液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀Agilent 6545 Q-TOF LC/MS；DL 32型卡爾費(fèi)休水分測定儀；DTG-60AH熱重分析儀(日本島津公司)。Shimadzu氣相色譜儀(GC-2010)；Agilent 7500a電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS，美國安捷倫公司)。

橙皮素原料(日本TCI公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國默克公司)；RP-C18硅膠(孔徑：90 ?，美國Sigma公司)；乙酸(中國百靈威公司)；標(biāo)準(zhǔn)水樣Apura-Water Standard，含水0.1%(美國默克公司)。

1.2 定性分析

對于所購原料，首先采用紅外光譜法與核磁共振法(H譜)進(jìn)行定性分析，確證原料是否為橙皮素物質(zhì)。其中，紅外光譜法采用溴化鉀壓片法，核磁共振法(H譜)是將樣品溶于d6-DMSO溶劑中分析。對于純化后產(chǎn)品，采用核磁共振法(H譜)和液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC-Q-TOF)兩種方法鑒定純化后產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)是否改變，進(jìn)行定性確證。

1.3 橙皮素純化實(shí)驗(yàn)

反相硅膠預(yù)處理及裝柱：用甲醇浸泡150 g的C18反相硅膠，過夜，對其進(jìn)行預(yù)處理。濕法裝柱，裝成內(nèi)徑為4 cm、高度為21 cm的反相硅膠柱，甲醇反復(fù)沖洗反相硅膠，加壓除氣泡，并用一定比例的流動相水-甲醇(30∶70)平衡柱子后上樣。

樣品純化及收集：稱取約500 mg的橙皮素原料，用少量甲醇溶解樣品后，加水使之與甲醇比例為30∶70，混勻后用滴管上樣，潤洗2次，加流動相過柱，用20 mL玻璃管接溶液。薄層色譜法(TLC)點(diǎn)板，紫外燈下檢測，將有熒光的玻璃管內(nèi)溶液合并后旋蒸，收集樣品并置于4 ℃冰箱中保存。上樣結(jié)束后，用甲醇沖洗柱子，流動相平衡柱子后，可以繼續(xù)上樣，重復(fù)利用。

1.4 橙皮素純度檢測

1.4.1主成分含量檢測稱取純化好的產(chǎn)物15 mg于50 mL容量瓶中，用甲醇充分溶解混勻并定容，配成300 mg/L的溶液。取1 mL該溶液于進(jìn)樣小瓶中，上機(jī)檢測，比較主成分與雜質(zhì)的含量比。色譜條件：色譜柱：Agilent SB-C18(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)；流動相：0.2%乙酸水溶液-甲醇(45∶55)；檢測波長：287 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4.2水分測定開啟卡爾費(fèi)休庫侖滴定儀，儀器自動滴定水分至終點(diǎn)，保持滴定池中沒有水分。用微量注射器吸取40 μL標(biāo)準(zhǔn)水樣，準(zhǔn)確稱量其質(zhì)量，經(jīng)墊片的針孔注入滴定池，輸入質(zhì)量進(jìn)行滴定并校準(zhǔn)。由于標(biāo)定過程未進(jìn)入空氣，因此不需要扣除背景。稱取5～7 mg的樣品，迅速打開滴定池上塑膠蓋，將樣品加入反應(yīng)瓶進(jìn)行滴定，輸入稱量質(zhì)量，待滴定結(jié)束，系統(tǒng)自動顯示計(jì)算出的含水量，重復(fù)測定5次。為了消除空氣中水分對測定結(jié)果的影響，模擬加樣過程、質(zhì)量及時(shí)間，但是不加樣進(jìn)行測定，計(jì)算空氣中的水分空白值，扣除空白后得到最終結(jié)果。

1.4.3有機(jī)揮發(fā)性雜質(zhì)測定采用頂空進(jìn)樣氣相色譜法測定。氣相色譜/氫火焰離子化檢測器(GC/FID)儀器條件：色譜柱DB-624(0.32 mm ×1.8 μm，30 m)，載氣：氫氣流量：40 mL/min、空氣流量：400 mL/min，檢測器溫度：260 ℃；程序升溫條件：初始45 ℃保持5 min，以7 ℃/min的速率升溫至60 ℃，再以15 ℃/min的速率升溫至190 ℃。進(jìn)樣量：1 mL，分流比：5∶1。恒溫爐溫度：90 ℃；樣品流路溫度：115 ℃；傳輸線溫度：120 ℃。

1.4.4非揮發(fā)性雜質(zhì)的測定采用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定非揮發(fā)性雜質(zhì)的含量。ICP-MS儀器工作參數(shù)：射頻功率1 450 W；等離子體氣流速16 L/min；載氣流速1.23 L/min；采樣深度7.8 mm；蠕動泵轉(zhuǎn)速0.3 r/s；霧化室溫度2 ℃；同位素駐留時(shí)間0.1 s。

1.4.5除水實(shí)驗(yàn)將樣品平鋪在玻璃器皿中，設(shè)置烘箱溫度100 ℃，烘干24 h 后，取出放入干燥器中，待溫度降至室溫時(shí)，再次測定水分。用烘箱烘干樣品前，做熱重分析(TGA)實(shí)驗(yàn)，防止樣品烘干過程中分解變質(zhì)。用烘箱烘至樣品中水分不再變化時(shí)，再用冷凍干燥法除水，將樣品放入-80 ℃冷凍0.5 h后進(jìn)行冷凍干燥。

圖1 橙皮素樣品的紅外譜圖Fig.1 Infrared spectrum of hesperetin sample insert:standard infrared spectrum of hesperetin

圖2 橙皮素樣品的核磁氫譜Fig.2 Nuclear magnetic resonance spectrum of hesperetin sample insert:standard nuclear magnetic resonance spectrum of hesperetin

2 結(jié)果與討論

2.1 原料定性

2.2 高效液相色譜條件優(yōu)化

紫外全掃描實(shí)驗(yàn)表明，橙皮素的最大吸收波長為287 nm。在此基礎(chǔ)上，優(yōu)化了SB-AQ、SB-C18及ODS-2 HYPERSIL 3種色譜柱，同時(shí)比較了甲醇和乙腈分別作為有機(jī)相時(shí)雜質(zhì)的色譜出峰情況。在最優(yōu)色譜柱和流動相的條件下，考察了流動相不同比例、梯度洗脫條件及不同波長下的色譜行為，最終確立的最優(yōu)色譜條件如“1.4.1”所示。

結(jié)果表明，橙皮素純度為98.66%，低于99%，主峰出峰時(shí)間為9 min，相對含量較大的兩個(gè)雜質(zhì)出峰時(shí)間為16 min和25 min，距離主峰較遠(yuǎn)，因此可以根據(jù)液相色譜分離的原理，以液相色譜優(yōu)化的方法為基礎(chǔ)，使用反相硅膠柱層析法除掉雜質(zhì)以提高橙皮素的純度。

2.3 反相硅膠純化橙皮素條件優(yōu)化

反相硅膠純化結(jié)果的影響因素主要有硅膠柱的內(nèi)徑、上樣量、流速及洗脫劑比例等，因此實(shí)驗(yàn)對比了不同內(nèi)徑的反相硅膠柱對純化效率的影響，使用100 g反相硅膠，內(nèi)徑2 cm，柱高為28 cm的反相硅膠柱時(shí)最大流速太慢，上樣量太少，上樣200 mg即出現(xiàn)了嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象。因此改用內(nèi)徑4 cm，150 g反相硅膠，裝成柱高21 cm的反相硅膠柱，純化速率提高了3倍，上樣量明顯提高。同時(shí)考察了上樣量、流速及不同洗脫劑比例對回收率及產(chǎn)物純度的影響。

2.3.1橙皮素上樣量的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)考察了橙皮素上樣量為100、300、500 mg時(shí)的純化效率，如表1所示，樣品上樣量越多，回收率越高，產(chǎn)物的損失最少，上樣量為500 mg時(shí)，產(chǎn)物回收率最高，但純度開始降低，說明硅膠柱純化過程中開始出現(xiàn)拖尾，為保證純度，不再進(jìn)行更高上樣量的實(shí)驗(yàn)。最終選擇500 mg為上樣量。

表1 上樣量因素考察Table 1 Effects of sample loading

2.3.2上柱流速的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)考察了不同流速對橙皮素純化效率的影響。如表2所示，流速為15.5 mL/min時(shí)，產(chǎn)物回收率最高，產(chǎn)物純度與其他條件所測純度相差不大。繼續(xù)增大流速時(shí)，回收率開始下降，考慮到后期要大量純化樣品，既需節(jié)約時(shí)間又需保證純度，最終選擇流速為15.5 mL/min。

表2 流速因素考察Table 2 Effects of flow rate

圖3 純化前后橙皮素及其雜質(zhì)的色譜圖對比Fig.3 Comparison of chromatograms of hesperetin and its impurities before and after purification

2.3.3洗脫劑極性的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)考察了洗脫劑極性對純化效果的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)水-甲醇的體積比為30∶70時(shí)，回收率最高，產(chǎn)物純度也最高，15 min之后的雜質(zhì)基本除去，3～4 min的雜質(zhì)含量也有所降低；當(dāng)水-甲醇的體積比為40∶60時(shí)，純度最低，16 min和26 min的兩個(gè)雜質(zhì)含量很高，是影響橙皮素純度的主要雜質(zhì)，純化效率最低，可能是因水相太高，導(dǎo)致上樣的橙皮素溶解性太差，與反相硅膠并不能很好的吸附，從而影響產(chǎn)物純度及回收率。當(dāng)水-甲醇的體積比20∶80時(shí)，16 min處的雜質(zhì)較高，可能是因?yàn)榧状急壤^高，流動相極性大，產(chǎn)物易從反相硅膠上洗脫，沒有足夠的時(shí)間吸附平衡，因此純化效率和純度降低。最終選擇水-甲醇(30∶70)為洗脫劑。

反相硅膠最佳純化條件確定為：反相硅膠用量150 g，上樣量500 mg，洗脫劑水-甲醇(30∶70)，流速15.5 mL/min。圖3為純化前后橙皮素色譜圖的對比圖，可以看出3～4、16、25 min左右的雜質(zhì)明顯減少，純化效果顯著，純化后橙皮素的純度從98.66%提高到99.87%。

2.4 純度分析

橙皮素?zé)嶂胤治鰧?shí)驗(yàn)如圖4所示，曲線b代表程序升溫過程中橙皮素質(zhì)量的變化，橙皮素的質(zhì)量在熔點(diǎn)(230～234 ℃)沒有發(fā)生變化，表明橙皮素的熱穩(wěn)定性高，不易分解，因此可以采用烘干法去除橙皮素中的水分。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用烘箱干燥法和冷凍干燥法的除水效果均不理想，因此需結(jié)合這兩種方法來達(dá)到除水目的。在100 ℃烘箱中烘干24 h后，水分由1.245 5%降至0.534 7%，繼續(xù)烘干，水分沒有明顯降低，后續(xù)采用冷凍干燥法除水24 h，水分降至0.235 0%，繼續(xù)使用冷凍干燥法除水24～48 h，水分沒有明顯變化。

圖4 橙皮素的熱重分析圖Fig.4 Thermogravimetric analysis of hesperetin

圖5 橙皮素純化后樣品的核磁氫譜Fig.5 H-NMR spectra of purified hesperetin

圖6 橙皮素純化后樣品的質(zhì)譜圖Fig.6 Mass spectrum of purified hesperetin

同時(shí)采用ICP-MS測定了純化后500 mg樣品中的非揮發(fā)性雜質(zhì)含量，結(jié)果為0.001 9%，含量較少，可忽略不計(jì)。采用頂空進(jìn)樣氣相色譜法測定了55 mg樣品中的揮發(fā)性雜質(zhì)含量，主要溶劑殘留有甲醇、丙酮和異丙醇，含量為0.181 1%。采用反相硅膠純化的橙皮素在扣除水分和其他雜質(zhì)后，純度在99.4%以上，說明反相硅膠純化橙皮素后純度顯著提高，此法是一種快速、簡便和高效的純化方法。

2.5 純化后產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定

最終產(chǎn)物通過核磁共振法和液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜兩種方法定性。圖5為純化除水后高純橙皮素樣品的核磁氫譜，與AIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫中核磁氫譜圖中主要?dú)湓拥幕瘜W(xué)位移值一致。采用液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)一步定性確認(rèn)，圖6為純化后橙皮素的質(zhì)譜圖，分子離子峰[M+H]+的質(zhì)荷比m/z為303.085 6，碎片離子m/z為153[1,3A0+H]+、177[1,4B0+H-H2]+、285[M+H-H2O]+，與文獻(xiàn)[18]一致。因此可以確認(rèn)純化后橙皮素的結(jié)構(gòu)未改變。

3 結(jié) 論

本文以紅外光譜、核磁共振氫譜及液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜為定性方法鑒定橙皮素的結(jié)構(gòu)，HPLC檢測純化前后橙皮素的純度，熱重分析實(shí)驗(yàn)考察了橙皮素的熱穩(wěn)定性，烘箱-冷凍干燥法除水，卡爾費(fèi)休水分滴定儀測定水分，采用反相硅膠純化。純化后橙皮素的純度由98.66%提高到99.87%，該方法每天制備效率能達(dá)到克級，方法快速簡便、制備量大，分離效率高，為制備高純有機(jī)化合物及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的深入研究提供了技術(shù)支撐。

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Preparation of Hesperetin Based on Reversed Phase Silica Gel Purification and Its Purity Analysis by HPLC

LI Zhen-zhu1,JIAO Bi-ning2*,WANG Min3,ZHOU Jian3,SU Xue-su1*

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Southwest University，Chongqing 400715，China；2.Laboratory of Quality and Safty Risk Assessment for Citrus Products，Citrus Research Institute，Southwest University/Chinese Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 400712，China；3.Institute of Quality Standards & Testing Technology for Agri-products，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China)

In this study,a method for the preparation of high purity hesperetin based on reversed-phase silica gel purification was established.The factors such as loading volume,flow rate and eluent polarity were optimized.Structure of the product was identified by infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance,and the purity of the analyte was 99.87%.The daily preparation efficiency of the method could reach to gram-grade.With the advantages of high efficiency,large preparation and high separation efficiency,the method could provide a technical support for the preparation of certified reference material of hesperetin.

hesperetin; reverse phase silica gel; purification; qualitative analysis; high performance liquid chromatography

2017-07-11；

2017-10-17

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(柑桔)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-26)；國家重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)(2016YFF0201105-2)；國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估重大專項(xiàng)(GJFP2017004，GJFP2017015)

*

蘇學(xué)素，副教授，研究方向：生物有機(jī)藥物合成，E-mail：suxuesu@163.com

焦必寧，研究員，研究方向：果品質(zhì)量安全與檢測技術(shù)，E-mail：jiaobining@cric.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.12.014

O657.7

A

1004-4957(2017)12-1500-06