陸雪

Delta特定蛋白分析儀檢測C-反應蛋白的性能驗證

陸雪

目的 對Delta特定蛋白分析儀檢測C-反應蛋白（CRP）的性能進行驗證。方法 參考美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）和參考區(qū)間行業(yè)標準（WS/T）文件對Delta特定蛋白分析儀的精密度、攜帶污染率、準確度、功能靈敏度、臨床報告范圍、抗干擾能力、參考區(qū)間進行驗證。結果 低、高兩個濃度水平樣本的批內變異系數(shù)（CV）分別為2.43%和2.57%，實驗室內總CV分別為3.24%和3.41%，精密度驗證均通過廠家聲明；攜帶污染率為0.65%，滿足臨床要求。兩個不同批號儀器校準品的準確度驗證相對偏差分別為6.09%和4.87%，參考物質的靶值在95%置信區(qū)間內。當功能靈敏度為1.375 mg/L；臨床可報告范圍為1.375～12 457 mg/L，滿足臨床需要。干擾試驗顯示含246.7 μmol/L總膽紅素的黃疸標本、含4.15 mmol/L三酰甘油的血脂標本和含2.50 g/L血紅蛋白的溶血標本對CRP檢測的影響度均＜5%，在可接受范圍內；參考區(qū)間的驗證結果均在廠家提供的范圍內。結論 Delta特定蛋白分析儀采用散射免疫比濁法測定CRP的分析性能符合廠商聲明的標準，滿足臨床檢測的要求。

Delta特定蛋白分析儀； C-反應蛋白； 性能驗證； 散射免疫比濁法

C-反應蛋白（CRP）是機體感染和組織損傷的急性時相反應蛋白，在多種疾病的診斷中發(fā)揮重要作用［1-2］，其臨床應用日漸廣泛。上海長征醫(yī)院檢驗科最近購置第二臺Delta特定蛋白分析儀，該儀器采用散射免疫比濁法進行CRP檢測。根據美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）和中國衛(wèi)生行業(yè)標準（WS/T）文件，結合實驗室自身情況，現(xiàn)對Delta特定蛋白分析儀的精密度、攜帶污染率、準確度、功能靈敏度、臨床報告范圍、干擾試驗和參考區(qū)間進行驗證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Delta特定蛋白分析儀及配套試劑（批號：20170609）、稀釋液（批號：20170609）、校準品（批號為20170522，濃度22.0 mg/L；批號為20170317，濃度 32.0 mg/L）。Randox質控品（批號：濃度2為402LPC；濃度3為455LPC）

1.2 標本 采集本院門診和住院患者乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血標本。標本無黃疸、溶血、脂血。

1.3 干擾物質 羅氏E601免疫分析儀檢測總膽紅素（TBil）含量為493.4 μmol/L的黃疸標本（無脂血、溶血）；三酰甘油（TG）含量為8.3 mmol/L的脂血標本（無黃疸、溶血）；按CLSI EP7-A2《臨床化學干擾試驗標準》文件附錄制備血紅蛋白（Hb）含量為5.00 g/L的溶血標本（無黃疸，無脂血）作為干擾物質。其CRP水平均在正常范圍內。

1.4 方法

1.4.1 精密度驗證 參考CLSI EP15-A《精密度和正確度性能的用戶驗證》和WS/T 492-2016《臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證》，對儀器的精密度進行驗證。方法：高、低兩個濃度CRP質控品，每天一個批次，連續(xù)檢測5 d，每天每個濃度水平同一樣品重復檢測4次。分別計算批內標準差（s批內）、實驗室內總標準差（s室內），與廠家聲明的批內標準差（σ批內）和總標準差（σ總）進行比較。

1.4.2 攜帶污染率驗證 選取高值和低值樣品各1例，先測定高值樣品 3次（H1、H2、H3），再檢測低值樣品 3次（L1、L2、L3）。攜帶污染率＝（L1－L3）/（H3－L3）×100%，其中 L1為低值標本中的測定高值，L3為低值標本中的測定低值，H3為高值標本中的測定高值）。結果應≤2%

1.4.3 準確度驗證 參考CLSI EP15-A《精密度和正確度性能的用戶驗證》和WS/T 492-2016《臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證》，選擇兩個不同批號的儀器配套校準品，其校準值可溯源至CRM470，重復檢測2次，連續(xù)檢測5 d，計算均值、標準差，與靶值進行比較，計算相對偏差。試驗期間保證機器狀態(tài)正常，保證試驗當日室內質控在控。

1.4.4 功能靈敏度 將校準品濃度（22 mg/L）倍比稀釋至接近廠家提供的檢測下限濃度0.42 mg/L，將每個濃度樣品裝入EP 管密封后-20 ℃保存。累積檢測10 d，記錄檢測數(shù)據，計算均值、標準差和變異系數(shù)（CV），CV最接近20%所對應的濃度即為功能靈敏度。

1.4.5 臨床可報告范圍 先進行最大稀釋度驗證試驗，選擇2份接近定標上限高值的CRP標本，原樣本用初始稀釋度1：40倍稀釋，檢測濃度為100.64 mg/L 和 116.52 mg/L，用稀釋液按 5、10、20、50、100倍稀釋，并將每個濃度梯度平行測定2次，計算出實測均值后與預期值做比較。計算回收率〔回收率＝（實測均值／預期值）×100%〕。回收率在80%～120%間的結果為可接受, 從而確定標本稀釋最大倍數(shù)。根據靈敏度和最大稀釋倍數(shù)，確定臨床可報告范圍。

1.4.6 抗干擾能力驗證 參考CLSI EP7-A2《臨床生化干擾測試》文件，選擇約80 mg/L新鮮血清（無溶血、黃疸和脂血）的CRP作為分析樣本，并 將 干 擾 物 分 別 以 10H、7.5H+2.5L、 5H+5L、2.5H+7.5L、10L的比例與分析樣本1：1混合，每個濃度重復檢測3次，計算CRP均值以及干擾效果〔干擾效果＝（加入后測定值－加入前測定值）／加入前測定值×100%〕。

1.4.7 參考區(qū)間驗證 參考CLSI C28-A2《臨床實驗參考值范圍的定義與確認》，選取本院體檢中心健康個體20例，要求所有指標正常，參考個體能合理的代表本實驗室選擇的健康總體。依照標準操作規(guī)程檢驗以上20個樣本后，剔除離群值，如有2個以下參考個體數(shù)據在參考區(qū)間外，則該區(qū)間為可接受。

2 結果

2.1 精密度驗證結果 低濃度水平質控品s批內和s室內分別為 1.29 mg/L和 1.72 mg/L，CV批內和 CV總分別為2.43%和3.24%；高濃度水平質控品s批內和 s室內分別為 1.98 mg/L和 2.63 mg/L，CV批內和CV總分別為2.57%和3.41%。

2.2 攜帶污染率驗證結果 攜帶污染率為0.652 8%（H1＝97.65，H2＝89.02，H3＝102.96；L1＝2.74，L2＝2.53，L3＝3.39），小于 2%，滿足臨床要求。

2.3 準確度驗證結果 兩個批號校準品的驗證值和靶值的相對偏差分別為6.09%和4.87%，計算的95%置信區(qū)間分別為21.05～25.63 mg/L和30.62～36.25 mg/L，包含靶值22.0 mg/L和32.0 mg/L，通過驗證。

2.4 功能靈敏度的確認 以日間CV 20%對應的檢出限濃度水平1.375 mg/L作為本實驗室Delta檢測系統(tǒng)檢測CRP的功能靈敏度。見表2。

表2 CRP功能靈敏度試驗

2.5 臨床可報告范圍驗證結果 稀釋倍數(shù)為5～100倍時，稀釋回收率在可接受范圍內。散射免疫比濁法儀器在初始稀釋度1：40時的分析測量范圍由定標品定值范圍決定，為1.36～124.57 mg/L。臨床可報告范圍為1.375～12 457 mg/L。見表3。

2.6 抗干擾能力驗證結果 加入不同濃度干擾物后CRP檢測結果及影響度的結果表明，總膽紅素（TBil）濃度范圍為0～246.7 μmol/L的黃疸標本，TG濃度范圍為0～4.15 mmol/L的血脂標本，Hb濃度范圍為0～2.50 g/L的溶血標本對Delta特定蛋白分析儀檢測CRP的影響均較小，影響度均＜5%。見表4。

表3 最大稀釋度驗證試驗結果

2.7 參考區(qū)間驗證結果 廠家提供的健康人群CRP參考區(qū)間為0～8 mg/L，20例樣本結果全部在該參考區(qū)間內。

3. 討論

CRP是一種急性時相反應蛋白，對感染、炎癥及組織損傷和壞死的鑒別和診斷、病情監(jiān)測、抗菌藥物療效觀察和預后判斷有重要臨床意義［3］。健康人群大規(guī)模的流行病學研究發(fā)現(xiàn)，超敏CRP（hs-CRP）有望成為未來心血管疾病風險強有力的獨立預測因子［4-5］，美國心臟病學會和疾病控制中心（AHA/CDC）制定的標準顯示，CRP在1 mg/L以下為低度危險，1～3 mg/L為中度危險，3 mg/L以上為高度危險［6］。而CRP水平亦能反映心血管疾病患者的病情，預測患者預后，研究表明，急性冠脈綜合征患者經積極治療后，CRP水平明顯降低［7］。

表1 兩種不同濃度CRP質控品的精密度驗證試驗結果

表4 加入不同干擾物后各標本CRP檢測結果及影響度

目前CRP檢測方法主要有免疫熒光法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫比濁法等，其中免疫比濁法包括透射免疫比濁和散射免疫比濁，因其較好的穩(wěn)定性、靈敏度、精確度，成為目前臨床廣泛應用的兩種方法。而hs-CRP檢測需要更高的靈敏度，通常采用膠乳增強的免疫比濁法，ELISA 可使其檢測低限達到 0.005～0.100 mg/L［8］。近幾年，出現(xiàn)了方法各異的即時檢測小型全血CRP測定儀，該類儀器操作簡單、快速，適合床旁檢測，顯示出良好的應用前景。有文獻表明，在基層醫(yī)療機構，即時檢測小型全血CRP測定儀的使用，能幫助減少呼吸道感染患者抗菌藥物濫用的情況，并提高患者質量調整生命年（QALY）［9］。

Delta特定蛋白分析儀采用散射免疫比濁法，在方案設計上先進行精密度驗證實驗和標本攜帶污染實驗，確認檢測系統(tǒng)有良好的重復性且無攜帶污染后，再進行準確度的驗證［10］。本試驗檢測系統(tǒng)的批內不精密度和批間不精密度均在廠家聲明的范圍內，精密度驗證實驗室總不精密度低于廠家聲明值，故精密度通過驗證。準確度評估一般可采用與參考方法比較、應用參考物質、回收實驗等方式進行。本實驗采用有溯源性的參考物質方法，參考物質指定值在95%置信區(qū)間內，說明準確度通過驗證。

功能靈敏度相對檢測下限（LOQ）更適合作為臨床可報告范圍的下限［11］。因本系統(tǒng)初始稀釋度設定為1：40，故本實驗測定初始稀釋度下的功能靈敏度為1.375 mg/L，當結果低于該濃度時，建議報告＜1.375 mg/L。

對于多點定標（至少3個）的檢測項目無需進行分析測量范圍（AMR）的驗證實驗，此時該系統(tǒng)的測量范圍由定標品定值范圍決定。對于臨床可報告范圍大于AMR的檢測項目，需進行最大稀釋度驗證實驗［10］。本試驗結果表明在分析測量范圍內驗證最大稀釋倍數(shù)100時稀釋回收率均在可接受范圍內，結合功能靈敏度決定本實驗室檢測CRP的臨床可報告范圍為1.375～12 457 mg/L。

關于抗干擾能力，有文獻表明，透射免疫比濁法的抗干擾能力較強，而散射免疫比濁法對較大顆粒的乳糜、嚴重溶血時的Hb的干擾存在不足［12］。本試驗結果表明，TBil濃度為246.7 μmol/L、TG濃度為4.15 mmol/L、Hb濃度為2.50 g/L時，對本系統(tǒng)檢測CRP影響均較小，說明本系統(tǒng)有一定的抗干擾能力，能夠基本滿足日常檢測的需求。但對低值CRP濃度范圍標本的抗干擾能力仍有待考察，對乳糜和嚴重溶血的抗干擾能力也有待進一步驗證。

研究表明，健康人群CRP濃度水平呈偏態(tài)分布，有學者表明健康人群CRP濃度分布與性別和年齡相關,建議根據不同性別和年齡建立相應的參考區(qū)間［13］。本實驗采用廠商給定的參考區(qū)間進行驗證，結果符合臨床要求。

綜上所述，Delta特定蛋白分析儀采用散射免疫比濁法測定CRP的主要分析性能符合廠商聲明的標準，能滿足臨床檢測的要求。

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Performance verification of analyzing C-reactive protein by Delta specific protein analyzer

Lu Xue. Department of Clinical Laboratory, Changzheng Hospital, Shanghai 200003, China
Corresponding author: Lu Xue, Email: luxue91120@foxmail.com

Objective To test and verify the performance of C-reaction protein (CRP) detected by Delta special protein analyzer. Methods The precision, carryover rate, accuracy, functional sensitivity, clinical reportable range, interference analysis and reference interval were verified according to American Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) and Chinese Healthcare Industry (WS/T) standards. Results The withinrun precision variable coefficient (CV) of low and high concentrations was 2.43% and 2.57% respectively, while the overall precision CV was 3.24% and 3.41% respectively. Precision has been demonstrated to be consistent with the manufacturer's claim. The carryover rate was 0.65%. It can satisfy clinical requirements. The relative bias of accuracy in two different batches was 6.09% and 4.87% respectively, the target values of reference materials were both within the 95% confidence interval. The functional sensitivity was 1.375 mg/L. The clinical reportable range from 1.375 to 12 457 mg/L, can meet the clinical needs. Interference analysis showed the effect of 246.7 μmol/L concentration of total bilirubin, 4.15 mmol/L concentration of triglyceride and 2.50 g/L concentration of hemoglobin on CRP detection was within acceptable range. The verification results of the reference interval were within the scope provided by the manufacturer. Conclusion The major performances of CRP detected by Delta special protein analyzer using nephelometry immunoassay, was in line with the manufacturer's statement. It can meet the clinical testing requirements.

Delta specific protein analyzer; C-reactive protein; Performance evaluation; Nephelometry immunoassay

200003 上海，上海長征醫(yī)院檢驗科

陸雪，Email：luxue91120@foxmail.com

10.3969/j.issn.1674-7151.2017.04.002

2017-10-25）

張耘菲 楊程伍）