李文祥 魏 瑾 胡森焱 荀 江 馬 平 洪靈芝 龔建平

乳腺癌患者新輔助化療前后Topo Ⅱ蛋白變化及其對(duì)術(shù)后化療方案的指導(dǎo)意義

李文祥 魏 瑾 胡森焱 荀 江 馬 平 洪靈芝 龔建平

目的研究乳腺癌新輔助化療前后Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)及其對(duì)術(shù)后化療方案選擇的指導(dǎo)作用。方法對(duì)TNM分期Ⅱb及以上的乳腺癌患者行新輔助化療治療后，適合手術(shù)的患者行保乳手術(shù)治療。免疫組化法測(cè)定新輔助化療前后的Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)比化療前后、不同化療方案化療后的陽(yáng)性表達(dá)情況，記錄對(duì)比Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)患者的術(shù)后療效。結(jié)果CMF方案化療前后的Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；EC方案化療后Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于化療前(P<0.05)，且顯著高于CMF方案組(χ2=4.219，P=0.040<0.05)；ECT方案化療后Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于化療前(P<0.05)，且顯著高于CMF方案組(χ2=6.522，P=0.011<0.05)。EC方案組和ECT方案組化療后，Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.269，P=0.604>0.05)?；熐癟opo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)的患者，CR+PR率、中位TTF顯著高于陰性表達(dá)的患者(P<0.05)，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移低于陰性表達(dá)的患者(P<0.05)。結(jié)論含蒽環(huán)類(lèi)藥物的化療方案具有促進(jìn)Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)，提高術(shù)后療效的作用，在術(shù)后輔助化療方案中可以添加蒽環(huán)類(lèi)藥物，增加化療敏感性。

新輔助化療；Topo Ⅱα；術(shù)后化療

在影響女性生命健康的惡性腫瘤中，乳腺癌發(fā)病率最高，占所有女性惡性腫瘤的7%～10%，且近年來(lái)呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，并呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。乳腺癌作為一種全身性疾病，在早期即可發(fā)生全身擴(kuò)散，對(duì)其治療應(yīng)采用全身治療和局部治療相結(jié)合的綜合治療方法。新輔助化療作為乳腺癌綜合治療的重要組成部分，逐漸被重視，由于腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的存在，往往導(dǎo)致化療失敗，因此，研究腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性和敏感性是新輔助化療的目的之一。Topo Ⅱ是大多數(shù)蒽環(huán)類(lèi)藥物的作用靶點(diǎn)，對(duì)預(yù)測(cè)腫瘤細(xì)胞耐藥性和敏感性具有重要意義。本文測(cè)定接受新輔助化療前后乳腺癌患者Topo Ⅱ蛋白變化，并研究其對(duì)術(shù)后化療方案的選擇的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2013年5月至2016年5月，選取我院和南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院與江蘇省腫瘤醫(yī)院就診的乳腺癌女性患者103例，所有患者均經(jīng)病理檢查確診，年齡23～74歲，年齡中位數(shù)為45.2歲。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者68例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者35例；腫瘤>5 cm患者27例，>2～5 cm患者65例，≤2 cm的患者11例；TNM分期Ⅱb期及以上52例。所有患者均未接受過(guò)任何放療、化療或手術(shù)治療，無(wú)合并其他腫瘤。

1.2 方法

1.2.1 試劑一抗 鼠抗人Topo Ⅱα單克隆抗體、SP染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；其他試劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 Topo Ⅱα蛋白的免疫組化法測(cè)定 所有組織標(biāo)本修剪后，用10%福爾馬林溶液固定，清洗、脫水、透明后，石蠟包埋，保持4 μm厚連續(xù)切片，烘片。石蠟切片脫蠟、脫水、清洗，高溫修復(fù)冷卻至室溫后，清洗，并加入一抗，4 ℃孵育24 h后，取出，清洗，加入二抗，于37 ℃下孵育30 min，DAB顯色、沖洗后，蘇木精復(fù)染，沖洗、脫水，干燥后封片。于10×40高倍顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照組用正常PBS代替一抗，其他步驟均相同。操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3 結(jié)果判讀 Topo Ⅱα蛋白表達(dá)陽(yáng)性判讀：所有乳腺癌標(biāo)本染色后，由3位以上病理醫(yī)師通過(guò)雙盲法進(jìn)行讀片，最后討論統(tǒng)一。Topo Ⅱα染色位于細(xì)胞核，表現(xiàn)為清晰棕黃色或棕褐色。于高倍顯微鏡下觀察切片，每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行結(jié)果判定。陽(yáng)性細(xì)胞(核染色強(qiáng)度為+++)比例>10%為陽(yáng)性；或陽(yáng)性細(xì)胞(核染色強(qiáng)度為++)比例≥50%為陽(yáng)性。

1.2.4 化療方法 患者化療前血常規(guī)、肝腎功能及心電圖檢查均正常。采用隨機(jī)數(shù)表法，將TNM分期Ⅱb及以上患者分為3組，分別給予新輔助化療：CMF方案組(環(huán)磷酰胺600 mg/m2、甲氨蝶呤40 mg/m2、5-氟尿嘧啶600 mg/m2)、EC方案組(表柔比星60 mg/m2、環(huán)磷酰胺600 mg/m2)、ECT方案組(表柔比星60 mg/m2、環(huán)磷酰胺600 mg/m2、紫杉醇200/m2)。3組一般臨床資料相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有臨床可比性。見(jiàn)表1。化療2個(gè)周期后，對(duì)于適合保乳手術(shù)治療的患者行保乳手術(shù)治療。分別于新輔助化療前后，粗針穿刺取得患者腫瘤組織標(biāo)本，測(cè)定Topo Ⅱα，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性表達(dá)數(shù)。

1.2.5 療效評(píng)價(jià) 療效評(píng)價(jià)按照世界衛(wèi)生組織統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，完全緩解(CR)+部分緩解(PR)為有效；療效持續(xù)時(shí)間(TTP)：從本次治療開(kāi)始到腫瘤進(jìn)展的時(shí)間，TTF：治療開(kāi)始到病變進(jìn)展時(shí)間，包含任何原因中斷治療日期為止。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料以例表示，前后比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新輔助化療前后Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)對(duì)比

3組化療前，Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。CMF方案組化療前后對(duì)比，Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。EC方案組，Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)，化療前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；化療后陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)顯著增加，與CMF組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.219，P=0.040<0.05)。ECT方案組，Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)化療前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；化療后陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)顯著增加，與CMF方案組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.522，P=0.011<0.05)。EC方案組和ECT方案組，化療后，Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.269，P=0.604>0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 化療前Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)與臨床療效、預(yù)后及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系

化療前Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)的患者，CR+PR率、中位TTF顯著高于陰性表達(dá)的患者(P<0.05)，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移低于陰性表達(dá)的患者(P<0.05)。見(jiàn)表3。

3 討論

表1 3組一般臨床資料對(duì)比/例

表2 3組新輔助化療前后Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)對(duì)比/例

表3 化療前Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)與臨床療效、預(yù)后及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系

注：*為與Topo Ⅱα陰性比較，P<0.05。

新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy,NACT)又稱(chēng)術(shù)前化療、誘導(dǎo)化療和首次化療，是指對(duì)肺轉(zhuǎn)移性腫瘤在局部手術(shù)或放療前，應(yīng)用全身性、系統(tǒng)性的細(xì)胞毒藥物進(jìn)行治療[1-2]。

隨著循征醫(yī)學(xué)的發(fā)展，個(gè)體化化療逐漸應(yīng)用于乳腺癌的治療。新輔助化療作為個(gè)體化化療的第一步，一方面可以降低局部晚期乳腺癌分期，縮小原發(fā)腫瘤，提高早期乳腺癌患者保乳手術(shù)的成功率[3]；另一方面控制和殺滅全身微轉(zhuǎn)移癌、亞臨床擴(kuò)散病灶[4]；其次，作為體內(nèi)化療敏感試驗(yàn)，了解癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感度和耐藥性，為術(shù)后化療方案的選擇提供指導(dǎo)[5-7]。雌激素受體(estrogen receptor,ER)/孕激素受體(progesterone receptor,PR)[8]、Bcl-2凋亡基因[9]、HER-2基因[10-11]、Ki-67[12-14]是目前研究較多的新輔助化療療效預(yù)測(cè)因子。

DNA作為遺傳物質(zhì)，在細(xì)胞生長(zhǎng)及新陳代謝過(guò)程中起到至關(guān)重要作用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程涉及到DNA的結(jié)構(gòu)變化和修復(fù)。近年來(lái)，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα(topoisomerase Ⅱα,Topo Ⅱα)用于新輔助化療療效評(píng)估逐漸受到重視。TopoⅡα是原發(fā)性腫瘤細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，與腫瘤級(jí)別的增高成正相關(guān)關(guān)系。Topo Ⅱα是一種基本的細(xì)胞核酶，其編碼基因位于染色體17q21-22，具有改變DNA拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)的作用，其表達(dá)具有細(xì)胞周期依賴(lài)性的特點(diǎn)，通常在S期表達(dá)最多，在DNA的合成、轉(zhuǎn)錄、核分裂及染色體結(jié)構(gòu)形成、分離和濃縮過(guò)程具有重要作用[15-16]。位于二聚體酶2個(gè)亞基上的酪氨酸，在其殘基間的酯基轉(zhuǎn)移作用下，Topo Ⅱα剪切并打開(kāi)DNA雙鏈，使DNA雙螺旋松弛，雙螺旋缺口增大，缺口在第二股DNA雙螺旋通過(guò)后關(guān)閉，Topo Ⅱ與DNA鏈之間的共價(jià)連接被撤銷(xiāo)，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被擰緊而恢復(fù)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞分裂間期核基質(zhì)、有絲分裂期染色體配對(duì)、染色體分離、基因重組和轉(zhuǎn)錄及修復(fù)等過(guò)程緊密聯(lián)系[17]。研究顯示，Topo Ⅱα是許多細(xì)胞毒藥物的作用靶點(diǎn)，主要有蒽環(huán)類(lèi)、鬼臼堿類(lèi)、蒽醌類(lèi)等[18]。其耐藥機(jī)制表現(xiàn)為以下三個(gè)方面：①Topo活性降低；②磷酸化水平增加；③基因點(diǎn)突變或缺失，導(dǎo)致細(xì)胞毒藥物不能與該酶結(jié)合，抑制DNA斷裂，引起耐藥。Topo Ⅱα表達(dá)下調(diào)或性質(zhì)改變，形成DNA酶易解離復(fù)合物，降低化療藥物的敏感性，活性或含量的降低，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥的產(chǎn)生。肖海風(fēng)等[19]研究發(fā)現(xiàn)，蒽環(huán)類(lèi)化療藥物對(duì)Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)者的效率是陰性表達(dá)者的3.077倍，Topo Ⅱα表達(dá)降低嚴(yán)重影響蒽環(huán)類(lèi)藥物化療的敏感性。帥萍[20]在乳腺癌組織中Topo Ⅱα的研究中發(fā)現(xiàn)，Topo Ⅱα基因的擴(kuò)增可以有效改善蒽環(huán)類(lèi)化療藥物輔助治療效果。本文研究了不同新輔助化療方案治療前后的乳腺癌患者Topo Ⅱα變化，結(jié)果顯示：3種化療方案化療前，Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，化療后EC方案組及ECT方案組Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于CMF方案組，而EC方案組和ECT方案組化療后Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在對(duì)Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)患者的療效研究中，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)的患者的有效率、中位TTF和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著高于陰性表達(dá)的患者(P<0.05)，說(shuō)明Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)的患者對(duì)化療藥物，尤其是蒽環(huán)類(lèi)藥物的敏感性較高，提示我們?cè)谛g(shù)后輔助化療中，對(duì)陽(yáng)性表達(dá)的患者應(yīng)用含蒽環(huán)類(lèi)藥物的化療方案可以有效改善患者的療效。

綜上所述，含蒽環(huán)類(lèi)化療方案的新輔助方案化療后，患者Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)顯著增加，有利于提高患者術(shù)后的療效。對(duì)于新輔助化療后患者Topo Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)顯著增加的患者，為了提高術(shù)后輔助化療藥物的敏感性，提高療效，可以選用含蒽環(huán)類(lèi)藥物。

[1] Emil Feri.Clinical cancer research:An embattled species 〔J〕.Cancer,1982,50(10):1979-1992.

[2] 牟 鵬,厲紅元.乳腺癌新輔助化療的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2011,18(9):1011-1016.

[3] Charfare H,Limongelli S,Purushotham AD,et al.Neoadjuvant chemotherapy in breast cancer 〔J〕.Br J Surg,2005,92(92):14-23.

[4] 吳家豪,何勁松,倪 勇,等.乳腺癌新輔助化療療效評(píng)價(jià)方法進(jìn)展〔J〕.癌癥,2010,29(2):240-244.

[5] Von Minckwitz G,Raab G,Caputo A,et al.Doxorubicin w-ith cyclophosphamide followed by docetaxel every 21 days compared with doxorubicin and docetaxel every 14 days as preoperative treatment in operable breast cancer:the GEPARDUO study of the German Breast Group 〔J〕.J Clin Oncol,2005,23(12):2676-2685.

[6] Gianni L,Eiermann W,Semiglazov V,et al.Neoadjuvant c-hemotherapy with trastuzumab followed by adjuvant trastuzumab versus neoadjuvant chemotherapy alone,in patients with HER2-positive locally advanced breast cancer (the NOAH trial):a randomised controlled superiority trial with a parallel HER2-negative cohort 〔J〕.Lancet,2010,375(9712):377-384.

[7] 劉海鷗,張喜平.乳腺癌新輔助化療的研究進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述,2014,20(4):653-656.

[8] Berry DA,Cirrincione C,Henderson IC,et al.Estrogen receptor status and outcomes of modern chemotherapy for patients with nodepositive breast cancer 〔J〕.JAMA,2006,295(14):1658-1667.

[9] Warnbery F,Nordgren H,Bergkvist L,et al.Tumor markers in breast carcinoma correlate with grade rather than invasiveness 〔J〕.Br J Cancer,2001,85(6):869-874.

[10] Lee HJ,Seo JY,Ahn SH,et al.Tumor-associated lymphocytes predict response to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer patients 〔J〕.J Breast Cancer,2013,16(1):32-39.

[11] Chumsri S,Jeter S,Jacobs LK,et al.Pathologic complete response to preoperative sequential doxorubicin/cyclophosphamide and singleagent taxane with or without trastuzumab in stageⅡ/Ⅲ HER2-positive breast cancer 〔J〕.Clin Breast Cancer,2010，10(1):40-45.

[12] Nishimura R,Osako T,Okumura Y,et al.Clinical significance of Ki-67 in neoadjuvant chemotherapy for primary breast cancer as a predictor for chemosensitivity and for prognosis〔J〕.Breast Cancer,2010,17(4):269-275.

[13] Jones RL,Salter J,A,hern R,et al.The prognostic significance of Ki-67 before and after neoadjuvant chemotherapy in breast cancer〔J〕.Breast Cancer Res Treat,2009,116(1):53-68.

[14] Colleoni M,Bagnardi V,Rotmensz N,et al.A risk score to predict disease-free survival in patients not achieving a pathological complete remission after preoperative chemotherapy for breast cancer〔J〕.Ann Oncol,2009,20:1178-1184.

[15] 徐建芳,陳 焰,鄭春鵬,等.P-gp、GST-P、Topo-Ⅱ、HER-2在乳腺癌中的表達(dá)與含多西他賽化療方案療效的關(guān)系〔J〕.臨床合理用藥雜志,2010,3(19):7-9.

[16] 秦尚堯，袁一旻，胡 昕,等.拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的結(jié)構(gòu)、功能及作用機(jī)制研究進(jìn)展〔J〕.生理學(xué)報(bào),2016,68(1):98-106.

[17] 侯寶洲,孫劍經(jīng).β-catenin、Topo Ⅱ和ki 67在惡性腫瘤中的作用研究進(jìn)展〔J〕.河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2013,29(5):109-113.

[18] 岳玉函,曹海玲,袁 靜,等.乳腺癌組織中耐藥蛋白的表達(dá)及化療耐藥性的相關(guān)性研究〔J〕.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,36(3):211-216.

[19] 肖海風(fēng),于國(guó)華,劉淑真,等.Topo Ⅱα在乳腺癌中的表達(dá)與蒽環(huán)類(lèi)藥物敏感性 的分析〔J〕.中國(guó)醫(yī)藥科學(xué),2013,3(18):34-37.

[20] 帥 萍.乳腺癌組織中HER2和Topo Ⅱα的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2016,41(11):1143-1147.

ChangesofTopo-ⅡProteininPatientswithBreastCancerbeforeandafterNeoadjuvantChemotherapyandItsGuidingSignificanceforPostoperativeChemotherapy

LIWenxiang,WEIJin,HUSenyan,etal.

GaochunPeople’sHospital，Nanjing,211302

ObjectiveTo study the expression of Topo Ⅱα in breast cancer patients before and after neoadjuvant chemotherapy and its guiding significance in the selection of postoperative chemotherapy.MethodsBreast cancer patients with stage Ⅱb and above were treated with neoadjuvant chemotherapy.Patients who suit for surgery were treated with breast conserving surgery.The expression of Topo Ⅱα before and after neoadjuvant chemotherapy were detected by immunohistochemistry.Compared the positive expression of Topo Ⅱα before and after neoadjuvant chemotherapy and the effect between patients with positive and negative expression of Topo Ⅱα.ResultsThe expression of Topo Ⅱα in CMF regimen before and after chemotherapy was not statistically significant (P>0.05).The number of positive expression patients accepted EC chemotherapy was significantly higher than that before chemotherapy (P<0.05) and was significantly higher than that of CMF (χ2=4.219,P=0.040<0.05).The number of positive expression patients accepted ECT chemotherapy was significantly higher than that before chemotherapy (χ2=6.522,P=0.011<0.05).There was no significant difference between EC and ECT group in the positive expression of Topo Ⅱα(χ2=0.269,P=0.604>0.05).The CR+PR rate,median TTF were significantly higher in patients with Topo Ⅱα positive expression than those with negative expression (P<0.05)，axillary lymph node metastasis was lower(P<0.05).ConclusionChemotherapy regimen containing anthracycline can increase the expression of Topo Ⅱα and improve the curative effect.The anthracyclines can be added to the postoperative adjuvant chemotherapy regimen to increase the chemosensitivity.

Neoadjuvant chemotherapy;Topo Ⅱα;Postoperative chemotherapy

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1918～1921)

江蘇省南京市衛(wèi)生局科技項(xiàng)目(編號(hào):YKK12175)

211302 江蘇省南京市高淳人民醫(yī)院(李文祥，魏 瑾，胡森焱，荀 江，馬 平)；210029 南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院(洪靈芝)；210009 江蘇省腫瘤醫(yī)院(龔建平)

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.12.002

R737.9

A

1001-5930(2017)12-1918-04

2017-02-24

2017-10-25)

(編輯：甘艷)