張志珊 蔣燕成 陳紫萱 陳婉花 李愛祿 李純孝

·基礎(chǔ)研究·

基于RNA-seq技術(shù)的宮頸癌與癌旁組織差異表達(dá)基因分析

張志珊 蔣燕成 陳紫萱 陳婉花 李愛祿 李純孝

目的探討宮頸癌的發(fā)病機(jī)制。方法應(yīng)用RNA-seq技術(shù)分析3對(duì)宮頸癌及癌旁組織轉(zhuǎn)錄組，利用生物信息方法對(duì)差異基因進(jìn)行基因本體(GO)分析和通路富集性分析。結(jié)果在宮頸癌組織中發(fā)現(xiàn)1755個(gè)差異表達(dá)基因，其中758個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，997個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。功能富集分析表明，差異基因富集于細(xì)胞粘附、DNA損傷有關(guān)的信號(hào)通路上。且宮頸癌組織中發(fā)現(xiàn)RAB22A-BCAS1等融合基因。結(jié)論細(xì)胞粘附信號(hào)通路、RAB22A-BCAS1融合基因可能與宮頸癌的發(fā)生機(jī)制有關(guān)。

宮頸癌；RNA-seq；轉(zhuǎn)錄組；差異表達(dá)基因；融合基因

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，人乳頭狀瘤病毒(HPV)的感染是引起宮頸癌的重要因素，但并非所有感染HPV的患者都會(huì)發(fā)展為宮頸癌，只有HPV持續(xù)感染導(dǎo)致細(xì)胞的基因組異常才最終導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。本研究擬收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院婦科就診的宮頸癌患者3例，采用RNA-Seq技術(shù)分析宮頸癌組織與癌旁組織的轉(zhuǎn)錄組，篩選出差異表達(dá)基因，進(jìn)而分析差異表達(dá)基因所涉及的信號(hào)通路以及融合基因表達(dá)，有利于闡明宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找宮頸癌特異的分子標(biāo)志物，同時(shí)也為基因藥物的開發(fā)提供候選的藥物作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院婦科就診的宮頸癌患者3例，術(shù)前經(jīng)未經(jīng)放化療及藥物治療，經(jīng)病理組織學(xué)確診為宮頸癌ⅡB期，同時(shí)取癌組織和癌旁組織(距離宮頸癌癌灶邊緣>3 cm)，置于RNA保存液中-80 ℃保存。

1.2 RNA提取及質(zhì)檢

3對(duì)癌組織及癌旁組織分別用QIAGEN微量RNA提取試劑盒按操作說明書提取RNA。瓊脂糖凝膠電泳分析 RNA 的純度和完整性，Nanodrop 檢測(cè) RNA 的純度(OD 260/280 比值)，Qubit 2.0對(duì)RNA濃度進(jìn)行精確定量，Agilent 2100精確檢測(cè)RNA的完整性。

1.3 文庫構(gòu)建及測(cè)序

用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物 mRNA，加入 fragmentationbuffer 將 mRNA 打斷成短片段，以 mRNA 為模板，用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成一鏈 cDNA，加入緩沖液、dNTPs 和 DNA polymerase I 和RNase H 合成二鏈 cDNA，利用 AMPure XP beads 純化雙鏈 cDNA。純化的雙鏈 cDNA 先進(jìn)行末端修復(fù)、加 A 尾并連接測(cè)序接頭，再用 AMPure XPbeads 進(jìn)行片段大小選擇。采取PCR 擴(kuò)增，用 AMPure XP beads 純化 PCR 產(chǎn)物，得到文庫。文庫構(gòu)建完成后，先使用 Qubit 2.0 進(jìn)行初步定量，稀釋文庫，使用 Agilent 2100 對(duì)文庫的插入片段進(jìn)行檢測(cè)，使用 Q-PCR 方法對(duì)文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，保證文庫質(zhì)量。文庫檢測(cè)合格后，使用 Illumina 高通量測(cè)序平臺(tái)(HiSeq/MiSeq)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量主要分布在Q30以上，才能保證后續(xù)高級(jí)分析的正常進(jìn)行。將原始數(shù)據(jù)中包含的接頭(adapter)信息、低質(zhì)量堿基、未測(cè)出的堿基去除，得到最終的有效數(shù)據(jù)(clean data)。利用TopHat2軟件將獲得的數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)到指定的參考基因組上的Reads稱為Mapped Reads，利用Cufflinks軟件將Mapped Reads 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本拼接，利用Cufflinks軟件計(jì)算癌組織和癌旁組織基因表達(dá)量。

1.5 差異表達(dá)基因篩選

應(yīng)用CuffDiff軟件進(jìn)行分析，在不同樣本組差異表達(dá)RNA檢測(cè)過程中，將Fold Change≥2且FDR<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。差異倍數(shù)(Fold Change)表示兩樣品間表達(dá)量的比值。

1.6 差異表達(dá)基因通路富集及基因本體(GO)分析

應(yīng)用信號(hào)通路分析軟件(IPA)對(duì)2組樣本差異表達(dá)基因進(jìn)行信號(hào)通路富集、疾病功能富集分析，利用軟DAVID工具進(jìn)行GO分析。

1.7 融合基因分析

應(yīng)用TopHat fusion分析融合基因，tophat fusion通過將未能比對(duì)到參考基因組的reads打碎成25 bp的片段，然后采用Bowtie將25 bp的片段比對(duì)到基因組，從而找出比對(duì)到兩個(gè)染色體的片段或者比對(duì)到同一染色體不同位置的reads。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因分析

將癌組織和癌旁組織相比，共發(fā)現(xiàn)1755個(gè)差異表達(dá)基因，癌組織相對(duì)于癌旁組織樣本中有758個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)，997個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)。

2.2 GO及通路分析

1755個(gè)差異基因共富集到582條GO_BP，1755個(gè)差異表達(dá)基因共富集到378條通路。這些差異表達(dá)的基因主要涉及粘附、DNA損傷等通路。最有意義的前5條信號(hào)通路富集結(jié)果如表1所示。

表1 癌組織和癌旁組織差異表達(dá)基因前5條信號(hào)通路富集結(jié)果

2.3 融合基因

分析癌組織中存在的融合基因，分析結(jié)果及說明見表2。

表2 融合基因分析結(jié)果及說明

3 討論

雖然高危型HPV的持續(xù)感染是引起宮頸癌的根本原因，但僅有一小部分感染者發(fā)展為宮頸癌[1]。目前眾多研究證實(shí)宮頸組織基因水平上表達(dá)異常會(huì)誘發(fā)宮頸癌的發(fā)生[2]。RNA-Seq技術(shù)不僅能檢測(cè)組織已知基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，還能檢測(cè)未知基因[3]。

本研究中收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院婦科就診的宮頸癌患者3例，采取RNA-Seq技術(shù)，共發(fā)現(xiàn)1755個(gè)差異表達(dá)基因，共富集到582條GO種類和378條通路，這些差異表達(dá)的基因主要涉及粘附、DNA損傷等通路。排在前2位的通路均與細(xì)胞粘附和滲出有關(guān)，而細(xì)胞粘附分子在細(xì)胞的粘附與滲出中起重要的作用。研究顯示細(xì)胞粘附分子與宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。在宮頸癌的形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中，細(xì)胞粘附分子起著至關(guān)重要的作用[4]?；罨准?xì)胞粘附分子在不同惡變程度宮頸癌中的表達(dá)存在差異，并在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中表達(dá)量呈上升趨勢(shì)[5]。因此我們推測(cè)與細(xì)胞粘附相關(guān)的信號(hào)通路可能在宮頸癌的發(fā)生中起一定的作用。

融合基因是指兩個(gè)基因的編碼區(qū)首尾相連構(gòu)成的嵌合基因。融合基因編碼的蛋白通常具有致癌性，會(huì)影響細(xì)胞的正常生理功能，是導(dǎo)致癌癥的主要原因之一。目前，在肺癌、甲狀腺、乳腺癌等疾病中，都發(fā)現(xiàn)了融合基因的存在[6-7]，但是與宮頸癌的相關(guān)性尚未見報(bào)道。本研究通過RNA-Seq技術(shù)檢測(cè)宮頸癌組織和癌旁組織的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，3個(gè)宮頸癌組織中都存在不同程度的融合基因。其中RAB22A-BCAS1融合基因有2個(gè)宮頸癌樣本中同時(shí)存在。RAB22A是ras相關(guān)的小G蛋白家族成員，是囊泡運(yùn)輸重要的調(diào)節(jié)因子。RAB22A在包括肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、骨肉瘤在內(nèi)的多種腫瘤中過表達(dá)[8-9]。乳腺癌擴(kuò)增序列-1 (BCAS1) 位于20q13.2區(qū)域，BCAS1高表達(dá)在乳腺癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[10]，BCAS1還參與三陰乳腺癌的發(fā)生[11]。此外，有研究表明，BCAS1還與前列腺癌、胃食管連接處腺癌、胰腺癌相關(guān)[12]。RAB22A、BCAS1與宮頸癌的相關(guān)性尚未見報(bào)道，而RAB22A-BCAS1融合基因以及本研究中發(fā)現(xiàn)的其他融合基因是否為導(dǎo)致宮頸癌的潛在致癌基因，在后續(xù)的研究中，我們將擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

綜上所述，我們通過高通量RNA-Seq技術(shù)分析宮頸癌及癌旁轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)1755個(gè)差異表達(dá)基因，這些差異表達(dá)基因富集到與細(xì)胞粘附、DNA損傷等信號(hào)通路上，且發(fā)現(xiàn)了RAB22A-BCAS1等融合基因，推測(cè)可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，為后續(xù)進(jìn)一步研究宮頸癌的發(fā)生機(jī)制提供了新的方向和思路。

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AnalysisofDifferentlyExpressedGenesofTumorandAdjacentNon-tumorTissuesfromPatientswithCervicalCancerbyRNASequencing

ZHANGZhishan,JIANGYancheng,CHENZixuan,etal.

QuanzhouFirstHospital，F(xiàn)ujianMedicalUniversity,Quanzhou,362000

ObjectiveTo explore the possible pathogenesy of cervical cancer.MethodsRNA sequencing was performed to screen the differently expressed genes of 3 pairs of cervical carcinoma and matched adjacent non-tumor tissues.The differently expressed genes were identified with gene ontology (GO) analysis and pathway enrichment analysis.ResultsThere were a total of 1755 differently expressed genes in the samples,including 758 up-regulated genes and 997 down-regulated genes.These differently expressed genes were enriched in pathway related to cell adhesion and DNA damage.Moreover,RAB22A-BCAS1 fusion gene was found in cervical cancer tissues.ConclusionThe pathway of cell adhesion and RAB22A-BCAS1 fusion gene may be related to the tumorigenesis and development of cervical cancer.

Cervical carcinoma;RNA-seq;Transcriptome;Differently expressed gene;Fusion gene

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1915～1917)

福建省自然科學(xué)基金(編號(hào)：2014J01436)

362000 福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.12.001

R737.33

A

1001-5930(2017)12-1915-03

2017-06-22

2017-07-10)

(編輯：吳小紅)