李 麗,劉會香,宋淑香,郭先鋒*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,山東 泰安 271018

2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院,山東 泰安 271018

芍藥炭疽病是嚴重危害芍藥（Paeonia lactifloraPall.）生產(chǎn)的葉部病害[1,2]，病株葉片的病斑不僅導(dǎo)致葉片光合能力下降，影響植株當(dāng)年的正常生長及觀賞價值，而且還嚴重阻礙芍藥地下芽的發(fā)生及花芽分化，進而影響芍藥翌年開花數(shù)量及觀賞品質(zhì)。因此，準確鑒定芍藥炭疽病致病病原菌，篩選出高效抑菌劑，對于生產(chǎn)實踐中的科學(xué)防控具有重要研究意義。

關(guān)于芍藥病害研究，多停留于不同地區(qū)病害種類調(diào)查及品種抗病性研究方面[3-6]，而對病原較為系統(tǒng)的鑒定研究較少，僅藍瑩于上世紀80年代對芍藥灰霉病及紅斑病有過較為細致的形態(tài)學(xué)鑒定研究[7-8]。關(guān)于芍藥炭疽病病原方面的研究，一直缺乏深入細致的研究，僅有粗略的病癥描述和病原菌的簡單介紹[1,2,9]，而缺乏圖文數(shù)據(jù)的支持，為芍藥炭疽病有效防控造成障礙。因此，本研究擬通過植物病原真菌的分離及形態(tài)學(xué)特征、致病性檢測以及rDNAITS（Internal transcribed spacer region of the ribosomal DNA）序列分析，明確芍藥炭疽致病病原種類，篩選出能有效抑制菌絲生長的化學(xué)藥劑，為該病害的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病原分離的寄主植物材料采自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)實驗站芍藥種植資源圃，寄主芍藥品種主要有‘春曉’、‘大富貴’、‘大葉粉’、‘粉玉奴’、‘紅艷爭輝’、‘蝴蝶戲金花’、‘桃花飛雪’、和‘朱砂判’8 個品種，通過形態(tài)調(diào)查結(jié)合病害專家協(xié)同診斷，從其病葉上共分離245塊組織病塊。

1.2 病原菌的分離與純化

病原菌的分離采用常規(guī)組織分離法[10]，分離后菌株于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d，培養(yǎng)條件為28℃，光暗交替12 h/12 h。3次重復(fù)。病原菌的純化采用單孢分離法[11]。純化菌株于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病性測定

采用離體刺傷接種法，純化的病原物預(yù)先配制為病原菌的孢子懸浮液，濃度為1×106個·mL-1，清水作對照，同時采用無傷接種作為陽性對照[12,13]。每個病原物接種時，均選健康葉片30片，接種病原菌孢子懸浮液100 μL于傷口處，28℃，12 h/12 h光暗交替，保濕培養(yǎng)，2 d后觀察記錄發(fā)病情況，并重新分離發(fā)病組織，檢驗分離病原是否與接種病原一致。

1.4 致病菌的形態(tài)鑒定和分子鑒定

將分離純化后的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察記錄菌落的顏色、形狀、表面特征、生長速度等。在顯微鏡下觀察孢子的類型、大小、顏色、分生孢子梗特征等。

采用液體培養(yǎng)法培養(yǎng)菌絲；2×CTAB法提取其總DNA；PCR擴增采用真菌rDNA通用引物ITS1和ITS4[14]，均由北京華大基因合成，擴增產(chǎn)物經(jīng)檢測后純化回收，并送交北京華大基因研究中心有限公司進行測序；將測序完成的菌株序列提交到NCBI上，并用BlastTn進行同源性比對，確定菌株的分類地位。具體方法參照文獻[15]。

為構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，將已知種屬的序列（表1）與目標(biāo)序列以FASTA格式編輯成為一個文本文件，用MEGA5.05的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用自舉法（bootstrap）對系統(tǒng)發(fā)育樹進行檢驗，共1000次循環(huán)，以保證系統(tǒng)樹的可靠性。最后將所得系統(tǒng)樹以EMF的形式輸出保存。

表1 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的引用序列Table 1 The reference sequences used in phylogenetic analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 病害田間癥狀

芍藥炭疽病主要為害芍藥的葉片。發(fā)病初期的小病斑灰白色似燒焦?fàn)?，略下陷，長圓形至圓形，病斑邊緣有時呈紅褐色（圖1A）；之后病斑邊緣逐漸擴大，呈不規(guī)則形輪紋狀，病斑中央淺黃褐色，邊緣深褐色，病斑擴展一般不會跨過葉脈（圖1B），但有時會形成穿孔；發(fā)病后期，植株葉片布滿病斑，病斑上形成黑色小點，為病原菌的子實體，天氣潮濕時，黑色小點上溢出橙紅色的孢子團。芍藥炭疽病害嚴重時，植株會整株枯萎死亡。

2.2 病原菌的分離

經(jīng)組織分離，從245個病塊組織中共分離到2種疑似病原菌（表2）。病原菌A157個，分離率52.0%～76.0%，平均分離率64.1%；病原菌B共57個。此外，未長菌落和雜菌31個，雜菌主要指細菌。

表2 芍藥炭疽病病原物分離統(tǒng)計Table 2 Separation Statistics of pathogens from Paeonia lactiflora Pall.anthracnose

2.3 致病性測定

兩種疑似病原菌的致病性測定分老葉接種和新葉接種，分別在2013年8月和2014年4月進行。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疑似病原菌A接種在新葉上，無論有傷接種還是無傷接種，葉片全部發(fā)病，而且品種間沒有差異；接種在老葉時，有傷接種葉片的發(fā)病率為90～100%，無傷接種葉片的發(fā)病率為80～90%。接種后第2 d一般可觀察到輕微發(fā)病癥狀，7 d后癥狀加強，出現(xiàn)灰色病斑。發(fā)病癥狀與田間發(fā)病癥狀相同。相比之下，疑似病原菌B接種的300片葉片中，僅1片葉片發(fā)病，而高達99.7%的葉片無發(fā)病癥狀。將疑似病原菌A接種后的發(fā)病葉片進行病原物分離培養(yǎng)，可分離到該病原菌；而從疑似病原菌B接種后的唯一一張發(fā)病葉片中，分離到疑似病原菌A，因此推測該葉片接種前可能已感染病原菌A且消毒不夠徹底。根據(jù)柯赫氏法則，確定疑似病原菌A為芍藥炭疽病的致病菌，而疑似病原菌B是伴生的非致病菌。圖1C和圖1D分別表示將疑似病原菌A和疑似病原菌B有傷接種到健康新葉2 d后的發(fā)病癥狀。

圖1 芍藥炭疽病的發(fā)病癥狀及病原菌的形態(tài)特征Fig.1 The symptoms and morphological characteristics of Paeonia lactiflora Pall.anthracnose

2.4 致病菌的形態(tài)鑒定

純化培養(yǎng)的致病菌菌株形態(tài)特征一致，早期為白色（圖1E），之后轉(zhuǎn)變?yōu)榛野咨粱疑?，氣生菌絲密實，菌絲發(fā)達，毛絨狀，中央漸呈灰黑色（圖1F），有剛毛，一定條件下可產(chǎn)生閉囊殼，培養(yǎng)基背面有灰色色素產(chǎn)生。顯微鏡下，可觀察到炭疽病的病原菌分生孢子盤生于葉片表皮層下，無色或褐色，分生孢子梗不分枝，密集，孢子盤中間或邊緣有剛毛（圖1G），分生孢子橢圓形或圓柱形，單胞，無色，有隔膜，兩端鈍圓，大小為8～14 μm×2～5 μm（圖1H），附著孢褐色，圓形或不規(guī)則形，產(chǎn)生侵染菌絲，菌絲具有短分枝（圖1I）。由以上形態(tài)可基本鑒定改病原菌為膠胞炭疽菌。

2.5 致病菌的rDNA-ITS序列分析

以致病菌菌株HB的DNA為模板，采用通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，獲得一組長度為533 bp的ITS序列，在GeneBank登錄號為KR912222。所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行blast比對后發(fā)現(xiàn)，其5.8S rDNA及其兩側(cè)ITS序列與序列號為HQ264179.1的同源性最高，為99%。HQ264179.1序列長度為550 bp，為膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）。進一步構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹（圖2）可分為三大分支，其中炭疽菌屬（Colletotrichum）為第一大分支，而供試菌株序列緊密聚在其中，除與登錄號為KC790967.1、KP748201.1、HQ264179.1、KP900290.1、KT390193.1、KT319051.1、KP689241.1、KT953237.1的序列聚合尤其緊密外，還與草莓炭疽菌（C.fragariae）具有較高同源性；而與該屬其它種（如獨蒜蘭炭疽菌（C.karstii）、蘭屬炭疽菌（C.cliviae）、菜豆炭疽菌（C.lindemuthianum））等同源性較低，與葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）在不同分支上，充分說明供試菌株的ITS序列為膠孢炭疽菌。

根據(jù)病原菌的形體鑒定、致病性鑒定和分子鑒定結(jié)果，芍藥炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌。

圖2 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequences

3 討論

植物真菌病害的病原鑒定，傳統(tǒng)方法是采用顯微形態(tài)學(xué)鑒定為主，菌落培養(yǎng)特征為輔[15]。但大部分植物菌物的種類多、形態(tài)特征復(fù)雜，因而傳統(tǒng)方法極易受分類者的分類知識及經(jīng)驗等人為影響，常常導(dǎo)致分類鑒定的困難[17]。近年來，以PCR為基礎(chǔ)的rDNA-ITS序列分析由于特異性強、可靠性高，目前在許多植物病原菌鑒定中得到成功應(yīng)用[13,17-19]。形態(tài)特征與rDNA-ITS序列特征相結(jié)合，已發(fā)展為當(dāng)前許多植物病原菌分類和鑒定的常用手段。

已如前述，關(guān)于芍藥炭疽病的致病菌，已有文獻報道只記載發(fā)病癥狀或病原菌的簡單介紹，描述模糊，缺乏詳實的圖文數(shù)據(jù)支持，而且存在兩種分歧性說法。本研究在病原分離及致病性檢測的基礎(chǔ)上，通過形態(tài)鑒定及分子鑒定，一致確定了從芍藥炭疽病病部組織分離到的致病菌為半知菌類炭疽菌屬（Colletotrichum）的膠孢炭疽菌，該病原菌與碭山梨[18]、芒果[19]等其它園藝植物炭疽病的病原相同。研究結(jié)果明確了芍藥炭疽病的致病菌，該結(jié)果與喻璋（1987）研究報道中芍藥炭疽病病原為黑盤孢科盤圓孢屬Gloeosporiumsp的論述不同[9]。由于前人文獻報道中均缺乏詳實的圖文記錄，我們無從比較致病菌形態(tài)特征的異同。不過，由于炭疽菌類真菌在屬和種的命名上曾經(jīng)發(fā)生過重大變更，盤圓孢屬（盤長孢屬）是早期炭疽菌屬使用的異名之一[20]，因此二者有可能是同物異名。

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