吳春，單金峰，丁辰龍

牛膝提取物對(duì)大鱗鲃生長(zhǎng)、部分非特異性免疫指標(biāo)及抗病性的影響

吳春，單金峰，丁辰龍

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院宿遷農(nóng)科所，江蘇宿遷223800)

為研究牛膝提取物對(duì)大鱗鲃Barbus capito生長(zhǎng)性能、部分非特異性免疫指標(biāo)和抗病性的影響，采用單因子試驗(yàn)方法，選取450尾體質(zhì)量為 (98.92±2.25)g的大鱗鲃，隨機(jī)分成5組，分別投喂牛膝提取物水平為0(對(duì)照)、0.05%、0.10%、0.20%、0.40%的5種試驗(yàn)飼料，養(yǎng)殖周期為60 d。結(jié)果表明:在飼料中添加0.20%的牛膝提取物，能夠顯著提高大鱗鲃體質(zhì)量、增重率和特定生長(zhǎng)率；添加0.10%的牛膝提取物，可顯著增加大鱗鲃的頭腎體指數(shù)和脾體指數(shù) (P＜0.05)；與對(duì)照組相比，0.20%、0.40%牛膝提取物添加組大鱗鲃血清溶菌酶 (LZM)和酸性磷酸酶 (ACP)活力均有顯著提高 (P＜0.05)；用嗜水氣單胞菌攻毒后，0.20%牛膝提取物添加組大鱗鲃存活率最高。研究表明，牛膝提取物可提高大鱗鲃生長(zhǎng)性能、非特異性免疫力和抗病性，建議飼料中牛膝提取物的添加水平為0.20%。

牛膝；大鱗鲃；非特異性免疫；生長(zhǎng)性能

牛膝Achyranthes bidentata是中國(guó)的傳統(tǒng)中藥，屬于覓科植物，廣泛分布于中國(guó)的山西、山東、河南等地。牛膝藥用部分為其塊根，塊根味苦、甘、酸，性平。牛膝的化學(xué)成分主要有皂苷類、甾酮類和糖類等，它們是牛膝藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。皂苷類主要以齊墩果酸型三萜皂苷類化合物為主。甾酮類化合物種類較多，目前已分離到近20種，包括蛻皮甾酮、牛膝甾酮和漏蘆甾酮B等。糖類化合物包括牛膝多糖、寡糖和多種糖類化合物。此外，牛膝中還含有有機(jī)酸、生物堿、黃酮和甾醇等活性成分。對(duì)畜禽和小鼠等動(dòng)物的試驗(yàn)表明，牛膝具有提高機(jī)體免疫力[1－3]、促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)[4]、治療關(guān)節(jié)炎[5－6]、 鎮(zhèn)痛[7]、 抗衰老[8]、 抗炎[9]、 抗腫瘤[10]和抑菌[11]等作用，而牛膝提取物在水產(chǎn)動(dòng)物中的應(yīng)用主要集中在免疫調(diào)節(jié)和抗氧化功能方面[12－13]。

大鱗鲃Barbus capito隸屬于鯉科、鲃屬，是名貴的經(jīng)濟(jì)魚類，具有耐鹽堿、抗病性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、肉質(zhì)嫩等特性[14]，2003年首次從烏茲別克斯坦引入中國(guó)，現(xiàn)已經(jīng)在全國(guó)多個(gè)地方推廣，特別是在中國(guó)蘇北地區(qū)已開展大規(guī)模養(yǎng)殖，是蘇北地區(qū)的特色水產(chǎn)品，對(duì)推動(dòng)蘇北地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)起到了非常重要的作用。隨著大鱗鲃養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，各種病害也日趨嚴(yán)重。傳統(tǒng)的防治手段主要依靠抗生素和化學(xué)類藥物，給水產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來(lái)潛在危害。因此，急需尋找安全性較高的添加劑替代抗生素類藥物，而中草藥應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖完全符合發(fā)展無(wú)公害水產(chǎn)、生產(chǎn)綠色水產(chǎn)品的病害防治準(zhǔn)則。目前，有關(guān)大鱗鲃的人工繁殖、馴化、養(yǎng)殖、生理和病理等研究已取得相應(yīng)進(jìn)展[15－17]。但關(guān)于大鱗鲃飼料營(yíng)養(yǎng)方面尤其是飼料添加劑的研究尚未見報(bào)道，這限制了大鱗鲃的規(guī)?；B(yǎng)殖。為此，本研究中初步探討了牛膝提取物對(duì)大鱗鲃生長(zhǎng)性能及免疫力的影響，以期為牛膝作為免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用大鱗鲃取自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院宿遷農(nóng)科所水產(chǎn)養(yǎng)殖中心，健康且規(guī)格一致。牛膝提取物(多糖含量≥50%)購(gòu)自陜西澳源生物技術(shù)有限公司，分別按照0(對(duì)照)、0.05%、0.10%、0.20%、0.40%比例添加到大鱗鲃基礎(chǔ)飼料中，用攪拌機(jī)混勻，經(jīng)平模飼料顆粒機(jī)制成硬顆粒沉性飼料，粒徑為2 mm，自然晾干后備用，各試驗(yàn)組的飼料配比及營(yíng)養(yǎng)成分見表1、表2。

表1 試驗(yàn)飼料配方 (風(fēng)干基礎(chǔ))Tab.1 Ingredients of the diet used in the expriment(air dry basis) w/%

表2 飼料營(yíng)養(yǎng)成分 (風(fēng)干基礎(chǔ))Tab.2 Appoximate composition of the diets used in the experiment(air dry basis) w/%

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取450尾體質(zhì)量為 (98.92±2.25)g的大鱗鲃，隨機(jī)分成5組，分別投喂添加0(對(duì)照)、0.05%、0.10%、0.20%、0.40%牛膝提取物 (ABE)的飼料，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放30尾魚。

1.2.2 飼養(yǎng)管理 養(yǎng)殖試驗(yàn)在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院宿遷農(nóng)科所水產(chǎn)養(yǎng)殖基地循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中完成。飼養(yǎng)過(guò)程中定時(shí)監(jiān)測(cè)水質(zhì)，維持內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定，水溫為 (25±1)℃，pH為 6.5～7.5，氨基氮＜0.01 mg/L，水交換量為5 L/min，DO＞6 mg/L。每日于8:00、12:00、17:00各投喂1次，前20 d投飼率為8%，剩余養(yǎng)殖期投飼率為10%，每10 d調(diào)整1次投喂量。每天換水1/3，并做好記錄，養(yǎng)殖試驗(yàn)周期為60 d。

1.2.3 樣品的采集與指標(biāo)的測(cè)定

(1)生長(zhǎng)指標(biāo)。養(yǎng)殖試驗(yàn)正式開始之前，將試驗(yàn)魚馴養(yǎng)15 d，用電子天平稱量每尾魚的初始體質(zhì)量 (精確到0.01 g)，并隨機(jī)分組。養(yǎng)殖結(jié)束后，用同樣的方法逐條稱量各組試驗(yàn)魚的終末體質(zhì)量，并計(jì)算各組試驗(yàn)魚的增重率和特定生長(zhǎng)率。計(jì)算公式為

(2)血清免疫指標(biāo)。養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，從每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取3尾魚 (每組9尾)，使用5 mL一次性無(wú)菌注射器從尾靜脈取血。將所抽取的全血于4℃條件下靜置過(guò)夜，吸取血清，保存于冰箱(－20℃)中備用。采用空白對(duì)照法測(cè)定溶菌酶(Lysozyme，LZM)活性，采用微量酶標(biāo)法測(cè)定堿性磷酸酶 (Alkaline phosphatase，ALP)活性，采用化學(xué)比色法測(cè)定酸性磷酸酶 (Acid phosphatase，ACP)活性。測(cè)定步驟均按照南京建成生物工程有限公司試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

(3)器官指數(shù)。將取完血的試驗(yàn)魚迅速置于冰盤上解剖，分離其頭腎、中腎和脾臟，用生理鹽水稍加沖洗，吸干水分，立即稱重，并計(jì)算免疫器官指數(shù)。計(jì)算公式為

頭腎體指數(shù)＝頭腎質(zhì)量/體質(zhì)量×1000‰，

中腎體指數(shù)＝中腎質(zhì)量/體質(zhì)量×1000‰，

(4)抗病性指標(biāo)。將嗜水氣單胞菌接種于普通LB液體培養(yǎng)基中，用0.65%生理鹽水調(diào)節(jié)菌濃度至108cfu/mL，經(jīng)計(jì)算，半數(shù)致死量濃度為4×107cfu/mL。飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，用嗜水氣單胞菌對(duì)試驗(yàn)魚進(jìn)行攻毒，從每個(gè)重復(fù)選取20尾魚，每尾注射4×107cfu/mL濃度的嗜水氣單胞菌，注射后48 h內(nèi)觀察并記錄試驗(yàn)魚的死亡情況，并計(jì)算存活率。計(jì)算公式為

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析 (One－way ANOVA)和多重比較 (Duncan法)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛膝提取物對(duì)大鱗鲃生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，在飼料中添加0.10%、0.20%和0.40%牛膝提取物能夠提高大鱗鲃的體質(zhì)量、增重率和特定生長(zhǎng)率。其中，0.20%牛膝提取物添加組大鱗鲃終末體質(zhì)量最高，為235.68 g，且顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)；0.10%和0.20%牛膝提取物添加組大鱗鲃的增重率、特定生長(zhǎng)率均顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)，增重率分別為128.63%和137.81%，特定生長(zhǎng)率分別為1.33%和1.41%；而0.05%牛膝提取物添加組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異 (P＞0.05)。

表3 牛膝提取物對(duì)大鱗鲃生長(zhǎng)性能的影響Tab.3 Effects of ABE on growth performance of bulatmail barbel Barbus capito

2.2 牛膝提取物對(duì)大鱗鲃?lì)^腎、中腎和脾臟體指數(shù)的影響

由表4可知，飼料中添加牛膝提取物對(duì)大鱗鲃中腎體指數(shù)影響不顯著 (P＞0.05)，對(duì)大鱗鲃?lì)^腎體指數(shù)和脾體指數(shù)有顯著性影響 (P＜0.05)。牛膝提取物添加組大鱗鲃的頭腎體指數(shù)較對(duì)照組均有所增長(zhǎng)，其中0.10%和0.40%添加組分別為0.303‰和0.292‰，顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)；與對(duì)照組相比，0.10%、0.20%和0.40%牛膝提取物添加組大鱗鲃的脾體指數(shù)分別增加6.48%(P＜0.05)、9.38%(P＜0.05) 和 3.46%(P＞0.05)。

2.3 牛膝提取物對(duì)大鱗鲃部分血清免疫指標(biāo)的影響

由表5可知，飼料中添加牛膝提取物對(duì)大鱗鲃血清LZM、ALP和ACP活力有顯著性影響 (P＜0.05)。與對(duì)照組相比，0.20%和0.40%牛膝提取物添加組大鱗鲃血清LZM活力分別增加51.00%(P＜0.05) 和36.12%(P＜0.05)，ACP分別增加20.34%(P＜0.05) 和 19.42%(P＜0.05)； 大鱗鲃血清中ALP活性隨著牛膝提取物添加量的增加呈增加的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，0.10%、0.20%、0.40%添加組的ALP分別增加34.44%(P＜0.05)、39.12%(P＜0.05) 和57.30%(P＜0.05)。

表4 牛膝提取物對(duì)大鱗鲃免疫器官指數(shù)的影響Tab.4 Effects of ABE on immune organ indices of bulatmail barbel Barbus capito ‰

表5 牛膝提取物對(duì)大鱗鲃血清免疫指標(biāo)的影響Tab.5 Effects of ABE on serum immune indices of bulatmail barbel Barbus capito

2.4 牛膝提取物對(duì)大鱗鲃抗病性的影響

用嗜水氣單胞菌攻毒后，牛膝提取物對(duì)大鱗鲃成活率的影響如圖1所示。0.20%牛膝提取物添加組的抗病性最好，大鱗鲃存活率最高，為67.78%，且0.20%、0.40%牛膝提取物添加組存活率顯著高于其他組 (P＜0.05)。

圖1 牛膝提取物對(duì)大鱗鲃成活率的影響Fig.1 Effects of ABE on the survival rate of bulatmail barbel Barbus capito

3 討論

3.1 牛膝提取物對(duì)大鱗鲃生長(zhǎng)性能的影響

經(jīng)過(guò)60 d的養(yǎng)殖試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼料中添加牛膝提取物可提高大鱗鲃的生長(zhǎng)性能，這在其他中草藥和水產(chǎn)動(dòng)物中也有類似的報(bào)道。例如，飼料中添加滸苔能夠顯著提高大菱鲆的增重率和特定生長(zhǎng)率[18]。另外，蘆筍、薄荷葉、山楂等復(fù)方中草藥能顯著降低中華絨螯蟹的飼料系數(shù)，其中1.0%添加量促生長(zhǎng)效果最佳[19]。適量的虎杖和肉桂對(duì)尼羅羅非魚幼魚均具有促生長(zhǎng)效果，但過(guò)量或者長(zhǎng)期食用會(huì)對(duì)魚體腸道造成一定程度的損害[20]。此外，將黃芪、甘草、板藍(lán)根等發(fā)酵中草藥添加到鯉飼料中，可提高鯉肥滿度，促進(jìn)鯉生長(zhǎng)[21]。添加量為3%和5%的海帶渣能夠顯著促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)[22]。一般認(rèn)為，中草藥飼料添加劑的促生長(zhǎng)機(jī)理主要是改善魚體免疫功能，提高其抗病能力，增加食欲，改善消化吸收，從而促進(jìn)其生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中，添加0.10%和0.20%牛膝提取物的大鱗鲃體質(zhì)量、增重率和特定生長(zhǎng)率較高，且與對(duì)照組相比有顯著性差異。

3.2 牛膝提取物對(duì)大鱗鲃非特異性免疫力的影響

魚類作為低等脊椎動(dòng)物中的一種，其非特異性免疫系統(tǒng)發(fā)育較早，在免疫防御中具有重要意義[23]。免疫器官指數(shù)是反映免疫器官發(fā)育程度和免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)，一般認(rèn)為，免疫器官指數(shù)越大，免疫器官發(fā)育越完善，機(jī)體的免疫力就越強(qiáng)。胸腺、脾臟和腎臟是機(jī)體中重要的免疫器官，在非特異性免疫反應(yīng)中起到重要作用。研究表明，中草藥能促進(jìn)機(jī)體免疫器官的發(fā)育，增加免疫器官重量和指數(shù)，提高機(jī)體的免疫力。

王志敬等[24]在基礎(chǔ)日糧中添加玉屏風(fēng)多糖，結(jié)果顯示，添加量為0.8～1.6 g/kg時(shí)，草魚頭腎和脾臟體指數(shù)隨添加量的增加而升高，當(dāng)添加量達(dá)到1.6 g/kg時(shí)，顯著高于對(duì)照組。林旋等[25]研究認(rèn)為，當(dāng)黃芪多糖濃度達(dá)到500 mg/kg時(shí)，可以促進(jìn)羅非魚免疫器官發(fā)育，提高免疫器官指數(shù)。王紅權(quán)等[13]研究表明，牛膝多糖能顯著增加草魚脾體指數(shù)。本試驗(yàn)中有類似結(jié)果，飼料中添加0.10%和0.20%牛膝提取物可顯著增加大鱗鲃?lì)^腎體指數(shù)和脾體指數(shù)。

血清生化指標(biāo)可以反映機(jī)體在生理、病理和毒理方面的變化，常用來(lái)評(píng)價(jià)魚類健康和營(yíng)養(yǎng)狀況。血清中LZM、ALP、ACP作為非特異性免疫系統(tǒng)的組成元素，其含量變化可反映機(jī)體免疫水平。溶菌酶是一種低分子堿性蛋白，可以水解細(xì)菌細(xì)胞壁N－乙酰氨基葡萄糖和N－乙酰胞壁酸間β－1，4糖苷鍵，從而使細(xì)菌溶解死亡。溶菌酶廣泛存在于魚類肌肉、血清、各種體液和淋巴細(xì)胞中，主要參與炎癥反應(yīng)和修復(fù)再生等病理過(guò)程[26－27]。堿性磷酸酶是溶酶體酶系的標(biāo)志酶，參與機(jī)體磷、RNA、DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等的代謝，與動(dòng)物的生產(chǎn)性能和生長(zhǎng)速度有關(guān)。魚類血清中堿性磷酸酶在免疫防御過(guò)程中發(fā)揮重要作用，酸性磷酸酶是一種可參與信號(hào)傳導(dǎo)和能量轉(zhuǎn)化并能夠調(diào)節(jié)機(jī)體非特異性免疫和營(yíng)養(yǎng)代謝的水解酶。本研究結(jié)果表明，飼料中添加牛膝提取物能夠提高大鱗鲃血清LZM、ALP和ACP活力。這3種酶活力在牛膝提取物濃度為0.20%和0.40%時(shí)，顯著高于對(duì)照組，效果最佳。這與對(duì)草魚[28]、血鸚鵡[12]、大菱鲆[29]、中華絨螯蟹[19]和凡納濱對(duì)蝦[30]等的研究結(jié)果基本一致。

3.3 牛膝提取物對(duì)大鱗鲃抗病性的影響

吳斌[31]利用嗜水氣單胞菌對(duì)福瑞鯉進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果顯示，濃度為0.5%和0.3%的太子參多糖免疫保護(hù)率均為54.55%，顯著高于其他組，表明太子參多糖能夠提高福瑞鯉抗病力。秦志華等[32]認(rèn)為，紫錐菊提取物能夠降低大菱鲆死亡率，40 mg/mL濃度效果最佳。俞軍等[33]研究表明，投喂姜黃素后，大黃魚抵抗溶藻弧菌感染的能力顯著增強(qiáng)，大黃魚累積死亡率顯著降低。牟紹霞等[34]研究報(bào)道，黃連須和小檗堿可提高草魚對(duì)嗜水氣單胞菌的抗病性，其中0.50%的黃連須組試驗(yàn)魚存活率最高，比對(duì)照組增加44%。耿昕穎等[35]在鳙飼料中分別添加0.50%、1.00%和2.00%的醇提五倍子，試驗(yàn)魚的抗病性均有不同程度提高。本研究中同樣發(fā)現(xiàn)，飼料中添加牛膝提取物可提高大鱗鲃抗病性，其中，0.20%和0.40%添加組大鱗鲃成活率較高，顯著高于對(duì)照組。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在大鱗鲃飼料中添加牛膝提取物，可以提高大鱗鲃生長(zhǎng)性能、免疫器官發(fā)育和抗病性，增加大鱗鲃血清LZM、ALP和ACP酶活力，從而提高大鱗鲃的生長(zhǎng)性能和免疫力。建議大鱗鲃飼料中牛膝提取物的最佳添加水平為0.20%。

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Effects of Achyranthes bidentata extracts on growth performance，partial non－specific immunity and disease resistance of bulatmai barbel Barbus capito

WU Chun， SHAN Jin－feng， DING Chen－long
(Suqian Institute of Agricultural Sciences， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Suqian 223800， China)

A total of 450 individuals of bulatmai barbel Barbus capito with body weight of(98.92±2.25)g were randomly allocated into a circulating water system and fed diets containing Achyranthes bidentata extracts(ABE)at a rate of 0%(a control group)，0.05%，0.10%，0.20%，and 0.40%at water temperature of(25±1)℃ for 60 d to investigate effects of ABE on growth performance， partial non－specific immunity and disease resistance of bulatmai barbel.The results showed that significantly higher body weight，weight gain ratio(WGR)and specific growth rate(SGR)were found in the fish fed the diets containing 0.2%of ABE，and that significantly higher head kidney－somatic index and spleen－somatic index were observed in the fish fed the diets containing 0.1%of ABE(p＜0.05).There were significantly higher activities of acid phosphatase(ACP)and lysozyme(LZM)in the fish fed the diets containing 0.20%and 0.40%of ABE than in fish fed the control diet(p＜0.05).A challenge test of bulatmai barbel by pathogen Aeromonas hydrophila revealed that the maximal survival rate was observed in the infected fish fed the diet containing 0.20%of ABE.The findings indicate that ABE leads to significantly promote growth performance， partial non－specific immunity and disease resistance of bulatmai barbell， with appropriate ABE content of 0.20%.

Achyranthes bidentata； Barbus capito； non－specific immunity； growth performance

S965.1

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.06.007

2095－1388(2017)06－0676－06

2017－08－12

宿遷市農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目 (SQCX2017－02)；江蘇省水產(chǎn)三新工程項(xiàng)目 (Y2016－15)

吳春 (1990—)，女，碩士，助理研究員。E－mail:youyouwuchun＠126.com

丁辰龍 (1977—)，男，副研究員。E－mail:wuchun9080＠163.com