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(1.蕪湖市第二人民醫(yī)院 藥劑科，安徽 蕪湖 241000；2.皖南醫(yī)學院 藥學院，安徽 蕪湖 241002)

·基礎醫(yī)學·

順鉑對T24膀胱癌細胞Keap1-Nrf2通路的影響

張少楠1,2，雍群1，劉曉平2

(1.蕪湖市第二人民醫(yī)院 藥劑科，安徽 蕪湖 241000；2.皖南醫(yī)學院 藥學院，安徽 蕪湖 241002)

目的：探討順鉑對人膀胱移行癌細胞(T24細胞)Keap1-Nrf2信號通路的影響。方法分別將對照溶媒及濃度為0.1、1、10、30、90 μg/mL順鉑溶液加入T24細胞進行培養(yǎng)24 h，用MTT法檢測順鉑對T24細胞增殖抑制作用及半數(shù)抑制濃度IC50；對順鉑處理24 h后T24細胞胞質蛋白和細胞核蛋白進行提取，Western blotting分析T24細胞核內(nèi) Nrf2蛋白表達情況，胞質Keap1蛋白表達情況和胞質典型二相酶GSTP1、NQO1的表達情況。結果順鉑可明顯抑制T24細胞增殖，半數(shù)抑制濃度IC50為37.74 μg/mL；加入順鉑共培養(yǎng)后的T24細胞胞質Keap1蛋白表達量降低，核內(nèi)Nrf2蛋白質、胞質內(nèi)二相酶GSTP1、NQO1的表達量升高。結論順鉑可激活Keap1-Nrf2信號通路，使T24細胞內(nèi)Nrf2介導典型二相酶的表達升高。

順鉑；Keap1-Nrf2通路；膀胱癌細胞；二相酶

作為當前發(fā)現(xiàn)的重要信號通路之一，Keap1-Nrf2在細胞氧化應激反應以及避免外毒物損害方面發(fā)揮著重要作用。Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2 )是細胞中一種重要的氧化應激轉錄因子,在正常的生理狀態(tài)下，Nrf2主要被蛋白伴侶分子Keap1(kelch-like ECH-associated protein 1)控制在細胞質中，Nrf2在Keap1的控制下在細胞質內(nèi)進行泛素化降解，因此在生理狀態(tài)下，細胞核內(nèi)Nrf2的表達量較少[1]。然而細胞被毒物、藥物、致癌物等攻擊時，Keap1的構象發(fā)生改變或功能降低，Nrf2從胞質進入胞核內(nèi)并結合抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)，啟動下游二相抗毒酶基因(如GSTP1、NQO1)的表達，從而保護細胞免受上述物質的侵害[2-4]，因此Keap1-Nrf2信號通路的激活是正常細胞自我保護的重要機制。

順鉑(cisplatin,DDP)是治療膀胱癌的一線藥物，但該藥物單用療效并不理想，腫瘤細胞對其抗藥是主要原因，因此探索該耐藥性產(chǎn)生的機制可為臨床合理用藥提供基礎。既然Keap1-Nrf2信號通路的激活是正常細胞自我保護的機制，那么腫瘤細胞的Keap1-Nrf2通路是否被順鉑激活來抵抗該藥物的作用？本文對此進行了研究。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 人膀胱移行癌細胞(T24細胞)，保存于弋磯山醫(yī)院中心實驗室。

1.2 主要材料與試劑 順鉑(cis-platinum，DDP)購自美國Sigma公司；1640培養(yǎng)液、優(yōu)級胎牛血清、0.25%胰酶/EDTA及抗生素 (100×)均購自GIBCO公司；核蛋白和胞質蛋白提取試劑盒購自南京凱基；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；一抗Nrf2、Keap1、Gstp1、Lamin B1(細胞核蛋白內(nèi)參)、β-actin(細胞質蛋白內(nèi)參)兔多克隆抗體；一抗NQO1山羊多克隆抗體；驢抗羊、羊抗兔二抗購自美國圣克魯斯公司。

1.3 藥物配制 用0.9%氯化鈉溶液分別配制終濃度為0.1、1、10、30、90 μg/mL的順鉑溶液，避光保存。

1.4 MTT法測定細胞增殖抑制率 用含有胎牛血清、抗生素的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)T24細胞，接種于96孔板繼續(xù)培養(yǎng)，取處于對數(shù)期生長的細胞，采用對照溶媒(0.9%氯化鈉溶液)和多種濃度順鉑(0.1、1、10、30、90 μg/mL)分別與T24細胞共同培養(yǎng)24 h后，MTT法檢測細胞增殖，測定OD值，計算細胞增殖抑制率及半數(shù)抑制濃度IC50，抑制率(%)=(1-實驗組OD/溶媒對照組OD)×100%。

1.5 Western Blotting測定蛋白水平 根據(jù)順鉑半數(shù)抑制濃度選取合適濃度的順鉑作用T24細胞24 h后，消化并破碎細胞，按照核蛋白和胞質蛋白提取試劑盒說明書提取胞質蛋白及細胞核蛋白并測定蛋白濃度。將各組蛋白電泳轉膜后經(jīng)一抗、二抗孵育，TBST洗滌等步驟后，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描分析T24胞質Keap1蛋白表達情況，核內(nèi) Nrf2蛋白表達情況和二相酶GSTP1、NQO1的表達情況。

2 結果

2.1 順鉑對T24細胞增殖的抑制作用 用不同濃度順鉑處理T24細胞24 h后，T24細胞增殖抑制率隨順鉑濃度升高而增加(表1),順鉑IC50為37.74 μg/ mL，選取濃度為0.1、1、10 μg/ mL的順鉑溶液用于Western Blotting實驗。

順鉑/(μg/mL)OD值抑制率/%0.001.35±0.07-0.101.19±0.07*11.851.001.02±0.15*24.4410.000.93±0.06**31.1130.000.73±0.12**45.9390.000.49±0.14**63.70F26.71-P0.000-

注：與溶媒對照組相比,**P<0.01。

2.2 順鉑對T24細胞核內(nèi)Nrf2影響 用不同濃度順鉑處理T24細胞24 h后，各組間Nrf2蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(F=308.38,P=0.000)；與對照溶媒處理后相比，順鉑濃度為0.1 μg/ mL時T24核內(nèi)Nrf2表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；然而順鉑濃度升高后，核內(nèi)Nrf2表達量增加(P<0.01)，此實驗結果初步表明順鉑處理后Keap1-Nrf2信號通路被激活。

注：A表示0.9%氯化鈉溶液對照組，B～D分別代表DDP濃度為0.1、1、10 μg/mL組；與溶媒對照組相比,**P<0.01。

2.3 順鉑對T24細胞質內(nèi)Keap1的影響 用不同濃度順鉑處理T24細胞24 h后，各組間Keap1蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(F=121.12,P=0.000),胞質內(nèi)Keap1表達降低(P<0.05或P<0.01)，并且呈一定的劑量依賴性(圖2)。

注：A表示0.9%氯化鈉溶液對照組，B～D分別代表DDP濃度為0.1、1、10 μg/ mL組；與溶媒對照組相比,*P<0.05,**P<0.01。

2.4 順鉑對T24細胞質內(nèi)藥物代謝二相酶NQO1、GSTP1的影響 用不同濃度順鉑處理T24細胞24 h后，各組間NQO1蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(F=98.86,P=0.000)，GSTP1蛋白表達差異也有統(tǒng)計學意義(F=234.57,P=0.000)；相比對照組，順鉑作用后，NQO1、GSTP1表達量升高(P<0.05或P<0.01)，同時表現(xiàn)出劑量效應，因此從下游基因表達情況再次驗證了Keap1-Nrf2通路由于順鉑的作用呈現(xiàn)一定的激活狀態(tài)(圖3)。

注：A表示0.9%氯化鈉溶液對照組，B～D分別代表DDP濃度為0.1、1、10 μg/mL組；與溶媒對照組相比,*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

正常細胞在受到損傷進行自我防御時，通常會激活Keap1-Nrf2通路，多項研究表明Keap1-Nrf2信號通路在癌癥預防、消化系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)等多方面發(fā)揮著重要的作用[5-7]。但在腫瘤的藥物治療中，如果腫瘤細胞Keap1-Nrf2信號通路激活，可能會導致抗藥性的發(fā)生，使腫瘤藥物療效降低，本研究選用膀胱癌一線治療藥物順鉑作用T24細胞后初步發(fā)現(xiàn)，T24細胞核內(nèi)Nrf2及其介導表達的二相抗毒酶NQO1、GSTP1的水平表達升高，這也表明Keap1-Nrf2信號通路激活可能是單獨使用順鉑治療膀胱癌效果不理想的一個重要原因。多項研究報道稱，Keap1-Nrf2通路相關基因表達量降低是改善腫瘤藥物療效的新途徑，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多天然來源物質可通過下調Keap1-Nrf2信號通路來增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[8-9]，但這些天然物質尚未真正應用于臨床。

Nrf2在細胞中生理水平主要依賴于細胞質中Keap1的水平及功能強弱。本研究還發(fā)現(xiàn)順鉑可降低T24細胞質中Keap1的蛋白水平，可能導致Nrf2泛素化降解減少，從而進入細胞核內(nèi)Nrf2的量增多，這可能是順鉑激活Keap1-Nrf2信號通路的一個重要原因。本研究只是驗證了順鉑可降低Keap1蛋白水平，但并無法證明Keap1的蛋白活性是否降低，Keap1的功能降低可使其在胞質與Nrf2結合減少，也可能導致Nrf2入核增多激活Keap1-Nrf2信號通路。誘導物如何激活Keap1-Nrf2信號通路是一個復雜的過程，尚需更多實驗進行研究。

總之，本研究進一步證明了Keap1-Nrf2信號通路的激活不僅是正常細胞自我保護的主要機制，腫瘤細胞也具有此保護機制。本研究尚需動物及臨床實驗的驗證。

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EffectsofcisplatinonKeap1-Nrf2pathwayinT24bladdercancercells

ZHANGShaonan,YONGQun,LIUXiaoping

Department of Pharmacy,Wuhu No.2 People′s Hospital,Wuhu 241000，China

Objective： To investigate the effects of cisplatin on Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1)-nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2)(Keap1-Nrf2) signaling pathway in T24 cells.Methods:T24 cells were co-cultured with solvent control and different concentrations of cisplatin[ (0.1,1,10,30 and 90) μg/mL ]for 24 hours. MTT assay was performed to detect the inhibitory effect and 50% inhibition concentration(IC50)of cisplatin on T24 cells. Nuclear and cytoplasmic protein were extracted from the cells treated with the drug. Western blotting assay was used to analyze the expression of nuclear Nrf2,cytoplasmic Keap1 and two typical phase Ⅱ enzymes (GSTP1 and NQO1).Results:The proliferation of T24 cells was significantly inhibited by cisplatin,and the IC50was 37.74 μg/mL. The expression of Nrf2,GSTP1 and NQO1 were increased,while Keap1 was decreased following different concentrations of cisplatin treatment.Conclusion:Keap1-Nrf2 pathway in T24 cells can be activated by cisplatin,and the expression of typical phase Ⅱ enzymes (GSTP1 and NQO1)mediated by Nrf2,is also enhanced by cisplatin.

cisplatin;Keap1-Nrf2 pathway;bladder cancer cells;Phase Ⅱ enzymes

1002-0217(2017)05-0421-04

國家自然科學基金項目(81272485)

2017-03-30

張少楠( 1989-)，男，碩士，主管藥師，(電話)18055316073，(電子信箱)zsnwhey@163.com；劉曉平，男，教授，博士，碩士生導師，(電子信箱)liuxiaoping@ wnmc.edu.cn，通信作者。

R 737.14

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2017.05.004