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        衛(wèi)氣虛相關(guān)血漿代謝標(biāo)志物的季節(jié)性變化研究

        2017-12-27 06:30:33閆翠環(huán)王亞利王鑫國(guó)張明泉劉湘李博林曹文利
        關(guān)鍵詞:衛(wèi)氣組學(xué)氣虛

        閆翠環(huán),王亞利,王鑫國(guó),張明泉,劉湘,李博林,曹文利

        1.河北中醫(yī)學(xué)院,河北 石家莊 050200;2.河北醫(yī)科大學(xué),河北 石家莊 050017;3.河北省中醫(yī)院,河北 石家莊 050011

        衛(wèi)氣虛相關(guān)血漿代謝標(biāo)志物的季節(jié)性變化研究

        閆翠環(huán)1,王亞利2,王鑫國(guó)1,張明泉1,劉湘3,李博林3,曹文利1

        1.河北中醫(yī)學(xué)院,河北 石家莊 050200;2.河北醫(yī)科大學(xué),河北 石家莊 050017;3.河北省中醫(yī)院,河北 石家莊 050011

        目的 觀察春、夏、秋、冬不同季節(jié)衛(wèi)氣虛證SD大鼠的血漿代謝組學(xué)特征,尋找與衛(wèi)氣虛相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ),探討衛(wèi)氣虛的本質(zhì)。方法 分別于春分日、夏至日、秋分日、冬至日前7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)SD雄性大鼠各20只,與各季節(jié)氣候同步控制條件,按隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組通過(guò)疲勞加寒熱交替法復(fù)制衛(wèi)氣虛大鼠模型。于各節(jié)氣當(dāng)日12:00取血,采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)血漿代謝物,通過(guò)偏最小二乘判別分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,比較各季節(jié)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的數(shù)據(jù)和圖譜,探尋體現(xiàn)組間差異的代謝物,推測(cè)與衛(wèi)氣虛相關(guān)的生物標(biāo)志物。結(jié)果 在春、夏、秋、冬不同的季節(jié)中,各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠間代謝譜呈現(xiàn)明顯差異。在4組比較中,同型半胱氨酸在春、夏、秋季實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異顯著,神經(jīng)酰胺在夏、冬季實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異顯著,睪酮在春、夏季實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異顯著,環(huán)鳥(niǎo)甘酸在秋、冬季實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異顯著,肌氨酸在春、夏、冬季實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異顯著,這些物質(zhì)的生理功能涉及機(jī)體的脂代謝、氨基酸代謝、神經(jīng)遞質(zhì)以及激素水平的調(diào)節(jié)。結(jié)論 伴隨季節(jié)變化,衛(wèi)氣虛的生物標(biāo)志物也發(fā)生相應(yīng)變化,主要體現(xiàn)在氨基酸代謝、脂類代謝、神經(jīng)遞質(zhì)以及激素調(diào)節(jié)水平等方面。

        衛(wèi)氣虛;代謝組學(xué);季節(jié)變化;生物標(biāo)志物;大鼠

        《靈樞?禁服》有“審察衛(wèi)氣,為百病母”,衛(wèi)氣功能失常是多種疾病的主要病機(jī),衛(wèi)氣的溫養(yǎng)、固護(hù)肌表和抗御外邪功能失??蓪?dǎo)致汗證、痹證、失眠或多寐、善忘、癰疽腫瘍等多種疾病的發(fā)生。關(guān)于衛(wèi)氣虛的實(shí)質(zhì),有學(xué)者從白細(xì)胞相關(guān)抗原的角度認(rèn)為人類白細(xì)胞抗原-DR4是衛(wèi)氣虛人群對(duì)外感疾病易感的免疫遺傳學(xué)基礎(chǔ)[1];或認(rèn)為衛(wèi)氣虛與機(jī)體黏膜免疫及神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)相關(guān)[2-3]。本課題組前期研究表明,衛(wèi)氣虛證周期性變化可能與能量代謝密切相關(guān),同時(shí)還伴隨著細(xì)胞、激素及神經(jīng)調(diào)節(jié)[4];衛(wèi)氣及衛(wèi)氣虛的季節(jié)變化與淋巴細(xì)胞生物鐘基因Clock密切相關(guān)[5]。衛(wèi)氣虛的實(shí)質(zhì)研究為衛(wèi)氣虛相關(guān)疾病的預(yù)防、治療及療效判定提供了客觀依據(jù),但仍未達(dá)成統(tǒng)一的意見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)利用代謝組學(xué)技術(shù),從生物標(biāo)志物的角度觀察衛(wèi)氣虛證在不同季節(jié)的血漿代謝組學(xué)變化,進(jìn)一步探討衛(wèi)氣虛的本質(zhì)。

        1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1 動(dòng)物

        雄性SD大鼠80只,SPF級(jí),6~8周齡,體質(zhì)量(180±30)g,河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號(hào)1309031、1312049、1403037、1406027。飼養(yǎng)于光照周期12 h/12 h的環(huán)境中。

        1.2 主要試劑與儀器

        乙酸、乙酸銨均為色譜純,Dikmapure(中國(guó))公司;乙腈、甲醇均為色譜純,美國(guó)Fisher Scientific公司;蒸餾水,屈臣氏公司;其他試劑均為分析純。高效液相色譜儀(ULTRIP-LC-100),美國(guó)AB公司;色譜柱,美國(guó)phenomenex公司,型號(hào)Hypersil Golda Q C18(2.1 mm×100 mm,3 μm);高速臺(tái)式冷凍離心機(jī),湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司,型號(hào)TGL-16M;超低溫保存箱,日本三洋公司,型號(hào)MDF-382E。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 造模和分組

        大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過(guò)疲勞加寒熱交替法制造衛(wèi)氣虛大鼠模型[6]。將大鼠置于20 ℃水中游泳約30 min,常規(guī)條件飼養(yǎng)30 min后,放入恒溫箱(40±1)℃中15 min進(jìn)行熱刺激,密切關(guān)注大鼠變化,每5 min觀察1次,造成玄府開(kāi)泄、衛(wèi)表不固。大鼠取出后,常規(guī)條件飼養(yǎng)30 min,再放入-20 ℃冰箱10 min進(jìn)行冷刺激,密切關(guān)注大鼠變化,每2 min觀察1次。每只大鼠每日9:00疲勞加寒熱刺激1次,連續(xù)7 d。大鼠癥狀表現(xiàn):扎堆、蜷縮、發(fā)抖,被毛凌亂,汗出明顯,出現(xiàn)鼻腔分泌物,活動(dòng)減少,輕度腹瀉等;血常規(guī)檢查白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高。符合以上表現(xiàn)為造模成功[7-8]。按隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為春分實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組,夏至實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組,秋分實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組,冬至實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組,每組10只。對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng),不做任何干預(yù)。

        2.2 取樣

        大鼠分別于春分(2014-03-21)、夏至(2014-06-21)、秋分(2013-09-23)、冬至(2013-12-22)當(dāng)日12:00取血,肝素鈉抗凝,3500 r/min離心10 min,上清液移至凍存管-80 ℃保存。

        2.3 血漿樣本預(yù)處理

        2.3.1 檢測(cè)樣品制備 乙腈、蒸餾水4 ℃過(guò)夜預(yù)冷。按乙腈/水(3∶1)混合液沉淀蛋白,混勻,14 000 r/min離心10 min;取上清液,按1∶1比例加入蒸餾水稀釋,14 000 r/min離心10 min,移上清液入液相加樣瓶中待測(cè)。

        2.3.2 質(zhì)量控制樣本制備 各組血漿樣品4 ℃復(fù)融,分別取10 μL血清,渦旋震蕩混勻,按每管100 μL分裝于EP管中,即為質(zhì)量控制樣本(QC),其余處理同檢測(cè)樣品處理方法。

        2.4 HPLC-MS檢測(cè)

        應(yīng)用ULTRIP LC-100和AB SCIEX Q-Triple 4500 System檢測(cè)和采集數(shù)據(jù)。色譜條件:流動(dòng)相A溶劑為水(0.05%乙酸,2 mmol乙酸銨溶液),B溶劑為乙腈(0.05%乙酸,2 mmol乙酸銨溶液);流速0.3 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜條件:采用正離子(ESI+)模式檢測(cè);質(zhì)荷比(m/z)50~850 Da;Curtain Gas:30 psi;Gas1:55 psi;Gas2:55 psi;DP:60 V;EP:10 V;CE:5 eV;ISP:5500 V;Tem:500 ℃。

        3 統(tǒng)計(jì)分析

        3.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

        利用Markerview1.2.1代謝組學(xué)分析軟件將數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,包括數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換、導(dǎo)入;圖譜查看、對(duì)比(TIC、2D、3D、MS);去噪音;提取質(zhì)譜峰;反卷積處理;峰排列、對(duì)齊、合并;列表去噪音;縫隙填補(bǔ)處理;數(shù)據(jù)導(dǎo)出獲得二維數(shù)據(jù)陣。

        3.2 數(shù)據(jù)分析

        采用SIMCA13.0.3統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多變量分析,采用偏最小二乘判別分析(PLS-DA),結(jié)合代謝組學(xué)分富馬酸二甲酯、膽固醇酯、神經(jīng)酰胺、肌氨酸、環(huán)鳥(niǎo)甘酸5種差異代謝物為冬季衛(wèi)氣虛可能標(biāo)志物(見(jiàn)表4)。同型半胱氨酸在春、夏、秋季實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異性比較中顯著表達(dá),神經(jīng)酰胺在夏、冬季實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異性比較中顯著表達(dá),睪酮在春、夏季實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異性比較中顯著表達(dá),環(huán)鳥(niǎo)甘酸在秋、冬季實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異性比較中顯著表達(dá),肌氨酸在春、夏、冬季的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異性比較中顯著表達(dá)。

        表1 春分實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異代謝標(biāo)志物

        表2 夏至實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異代謝標(biāo)志物

        表3 秋分實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異代謝標(biāo)志物

        表4 冬至實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異代謝標(biāo)志物

        5 討論

        衛(wèi)氣虛是機(jī)體衛(wèi)外不足,肌表失于固護(hù),易于感受外邪的一種病機(jī),容易導(dǎo)致表虛證?!秲?nèi)經(jīng)》通過(guò)“天溫日明,則人血淖澤而衛(wèi)氣浮,故血易瀉,氣易行;天寒日陰,則人血凝泣而衛(wèi)氣沉”指出衛(wèi)氣隨季節(jié)變化的特征。以此推測(cè)以衛(wèi)氣生理功能失常為主要表現(xiàn)的衛(wèi)氣虛證也應(yīng)該存在季節(jié)性變化特征。代謝組學(xué)描述的是生物體的內(nèi)源性代謝小分子隨時(shí)間變化而形成的代謝圖譜,具有即時(shí)性和動(dòng)態(tài)性特征。所以,代謝組學(xué)技術(shù)有助于客觀認(rèn)知衛(wèi)氣虛的生物學(xué)本質(zhì)。若能確定衛(wèi)氣虛的生物標(biāo)志物,則有助于進(jìn)行辨證施治的療效評(píng)價(jià),并結(jié)合機(jī)體內(nèi)源性生物標(biāo)志物的軌跡變化,確定中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。這也是“中醫(yī)方證代謝組學(xué)”的觀點(diǎn)[9],通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)的利用,為中醫(yī)辨證和療效判定提供量化的客觀依據(jù)。

        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,同型半胱氨酸、富馬酸二甲酯、睪酮、神經(jīng)酰胺、膽固醇酯、環(huán)鳥(niǎo)甘酸、肌氨酸等物質(zhì)在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間呈現(xiàn)明顯差異,這些物質(zhì)的功能涉及機(jī)體的脂代謝、氨基酸代謝、神經(jīng)遞質(zhì)及激素水平的調(diào)節(jié)。同型半胱氨酸由肌肉、肝臟等組織蛋氨酸脫甲基生成,靠自身代謝的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)濃度。當(dāng)其濃度異常時(shí)可成為“毒性氨基酸”,導(dǎo)致甲硫氨酸循環(huán)發(fā)生紊亂,可使多個(gè)基因的甲基化狀態(tài)發(fā)生改變,進(jìn)而影響其表達(dá)[10-11]。肌氨酸又名N-甲基甘氨酸,由S-腺苷酶的一組甲基轉(zhuǎn)移到甘氨酸后生成,是膽堿代謝成為甘氨酸過(guò)程中的一個(gè)非編碼氨基酸中間體,存在于人體的肌肉和一些其他組織中,其生成過(guò)程中需要的甘氨酸-N-甲基轉(zhuǎn)移酶主要表達(dá)在前列腺和其他組織[12]。肌氨酸轉(zhuǎn)變成的甘氨酸是結(jié)構(gòu)性氨基酸,是肌酸、嘌呤、谷胱甘肽等活細(xì)胞必需成分的代謝來(lái)源,在人體生理活動(dòng)中具有重要作用。L-谷氨酰胺是人體肌肉中最豐富的游離氨基酸[13],一方面能促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成,參與保持谷胱甘肽儲(chǔ)備,保護(hù)組織細(xì)胞避免受到氧自由基帶來(lái)的損傷[14],提高機(jī)體對(duì)應(yīng)激的適應(yīng)性;對(duì)于營(yíng)養(yǎng)不良的個(gè)體,谷氨酰胺還通過(guò)提供能量ATP到巨噬細(xì)胞,調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的分泌功能,也有認(rèn)為谷氨酰胺能增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫[15]。腦苷脂是廣泛存在于生物細(xì)胞膜中的一類重要活性脂質(zhì),具有免疫調(diào)節(jié)、改善脂質(zhì)代謝等多種生物活性[16-18],其主要結(jié)構(gòu)單元即糖基和神經(jīng)酰胺,后者是細(xì)胞膜的重要組成成分,是神經(jīng)鞘脂類的骨架結(jié)構(gòu)。同時(shí),神經(jīng)酰胺可以作為第二信使,參與膜的信號(hào)傳導(dǎo)[19],在細(xì)胞的分化、增殖、衰老和凋亡過(guò)程中發(fā)揮良性調(diào)節(jié)作用[20-21]。N-乙酰天門冬氨酸存在于機(jī)體的正常神經(jīng)元內(nèi),普遍存在于神經(jīng)細(xì)胞胞體和神經(jīng)軸突中,發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的功能,并沿軸索傳遞信號(hào)[22]。睪酮的分泌主要受下丘腦-腺垂體-性腺軸調(diào)節(jié),同時(shí)可以將信息反饋至調(diào)節(jié)軸,形成循環(huán)以維持體內(nèi)性激素分泌的平衡。睪酮能夠增加骨骼肌細(xì)胞膜對(duì)氨基酸的攝取、促進(jìn)核酸、肌蛋白、紅細(xì)胞和磷酸肌酸的生成,與機(jī)體的體質(zhì)和運(yùn)動(dòng)能力密切相關(guān)。

        在春、夏、秋、冬季節(jié)差異性表達(dá)的代謝物中,同型半胱氨酸、肌氨酸、神經(jīng)酰胺、睪酮、環(huán)鳥(niǎo)甘酸分別在2個(gè)以上不同季節(jié)的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較中發(fā)揮作用,尤其是同型半胱氨酸和肌氨酸分別在3個(gè)季節(jié)的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異性比較中發(fā)揮作用,其對(duì)衛(wèi)氣和衛(wèi)氣的生理功能影響幾乎持續(xù)四季,說(shuō)明衛(wèi)氣虛的季節(jié)性變化與氨基酸代謝關(guān)系尤為密切,這也與本課題組前期研究中反復(fù)上呼吸道感染肺衛(wèi)氣虛證的潛在標(biāo)志物多為氨基酸類的研究結(jié)果一致[23]。

        綜上所述,衛(wèi)氣虛的病理狀況涉及機(jī)體氨基酸、脂類、神經(jīng)遞質(zhì)、激素4個(gè)層面的代謝標(biāo)志物變化。我們推測(cè)機(jī)體衛(wèi)外功能的異常,即衛(wèi)氣虛狀況的出現(xiàn),與機(jī)體氨基酸、脂類代謝有關(guān),也和機(jī)體神經(jīng)調(diào)節(jié)以及激素調(diào)節(jié)密切相關(guān),從代謝組學(xué)角度分析機(jī)體內(nèi)源性生物標(biāo)志物的細(xì)微變化,可以在早期通過(guò)量化指標(biāo)確定衛(wèi)氣虛證,從而達(dá)到未病先防或既病防變的目的。

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        (修回日期:2016-08-05;編輯:華強(qiáng))

        Research on Seasonal Variation of Plasma Metabolic Markers of Wei-qi Deficiency

        YAN Cui-huan1,

        WANG Ya-li2, WANG Xin-guo1, ZHANG Ming-quan1, LIU Xiang3, LI Bo-lin3, CAO Wen-li1(1. Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, China; 2. Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China; 3. Hebei Province Chinese Medicine Hospital, Shijiazhuang 050011, China)

        Objective To study the plasma metabolomics features of SD rats with wei-qi deficiency respectively in spring, summer, autumn and winter; To seek the potential markers related to wei-qi deficiency; To discuss the essence of wei-qi deficiency. Methods Twenty male SD rats were adaptively fed 7 days before Chinese Vernal Equinox Day, Summer Solstice, Autumn Equinox and Winter Solstice, synchronous controled with temporal condition. The rats were randomly divided into experimental and control groups according to random number method. Rats in the experimental groupwere made into wei-qi deficiency models through fatigue stimulation alternately with cold and heat stimulation. Blood was collected at 12:00 each solar term. High performance liquid chromatographymass spectrometry instrument was used to detect plasma metabolites. Partial least squates-discriminant analysis was used to process statistical analysis of the data to compared the original data of plasma metabolomics between the two groups of each season, and explore the difference metabolic markers between each two groups, then speculate the potential biomakers of wei-qi differency. Results With the changes of spring, summer, autumn and winter, significant differences were showed in metabolic profile between the experimental and control groups. Homocysteine showed a significant difference in spring, summer and autumn; Ceramide showed a significant difference in summer and winter; Testosterone showed a significant difference in spring and summer; Cyclic guanosine monophosphate showed a significant difference in autumn and winter; Sarcosine showed a significant difference in spring, summer and winter. The physiological functions of these substances related to lipid metabolism, amino acid metabolism, neurotransmitter and hormone regulation. Conclusion Potential biomakers of wei-qi deficiency changed along with the seasonalvariation, which mainly reflected in lipid metabolism, amino acid metabolism, neurotransmitter and hormone regulation. Key words: wei-qi deficiency; metabolomics; seasonal variation; biomarker; rats

        10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.017

        R228

        A

        1005-5304(2017)01-0066-05

        2016-07-05)

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