羅海霞，楊 易，謝秀蘭

(1.寧夏大學生命科學學院 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏銀川 750021;2.寧夏農林科學院動物科學研究所,寧夏銀川 750002)

腹瀉羔羊與健康羔羊腸道微生物群落分析

羅海霞1，楊 易1，謝秀蘭*

(1.寧夏大學生命科學學院 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏銀川 750021;2.寧夏農林科學院動物科學研究所,寧夏銀川 750002)

羔羊腹瀉與其腸道菌群的種類及比例密切關系。為了探索腸道菌群結構在腹瀉病程的變化，采集同樣飼養(yǎng)條件下20份1月齡～3月齡灘寒雜交羊糞便樣本，通過Miseq測序技術并結合多變量統(tǒng)計學方法檢測細菌16S rRNA基因V4-V5區(qū)的多樣性，通過數據分析，比較了腹瀉羊糞便與正常羊糞便中微生物的類別及數量。從門的水平分析，腹瀉羔羊腸道中變形菌門顯著高于健康羔羊。發(fā)現(xiàn)擬桿菌門、藍細菌門、黏膠球形菌門和無壁細菌門在腹瀉羔羊中的含量顯著低于健康羔羊。從科水平分析2個樣本優(yōu)勢菌具有顯著差異，其中腹瀉羔羊腸道放線菌乳桿菌科顯著高于健康羔羊，而瘤胃球菌科顯著低于健康羔羊。非優(yōu)勢菌也存在顯著差異，如擬桿菌科、柔膜菌科和理研菌科。比較了灘寒雜交羊健康羔羊及腹瀉羔羊腸道微生物的差異，發(fā)現(xiàn)其微生物豐度及優(yōu)勢微生物都具有顯著的差異，因此，腹瀉羔羊中的腸道微生物差異可能是羔羊腹瀉的重要因素之一，研究結果為羔羊腹瀉的研究及治療提供了理論依據。

灘寒雜交羊；羔羊；腸道微生物；腹瀉

動物的腸道菌群具有營養(yǎng)與代謝，免疫與保護，維持腸道菌群平衡，改善腸道環(huán)境，促進動物生長發(fā)育等作用[1]。腸道菌群的研究已成為全球研究熱點。腸道微生物菌群結構并非一成不變，而是與宿主的年齡、居住環(huán)境、食物、健康狀態(tài)等元素密切相關[2]。3月齡以內為羔羊期，1月齡～3月齡羔羊腹瀉病是規(guī)模養(yǎng)羊場多發(fā)病，發(fā)病率在60%左右，病死率達49.8%，臨床表現(xiàn)為腹瀉、腸炎、腹痛、脫水等，給養(yǎng)羊業(yè)帶來嚴重損失[3]。誘發(fā)羔羊腹瀉的主要病因是致病菌的感染，比如大腸埃希菌、沙門菌、腸球菌等[4]。但對羔羊腸道微生物分布報道較少，尤其對健康羔羊及腹瀉羔羊腸道菌的差異報道較少。隨著測序技術的發(fā)展，采用16S rRNA 高通量測序的方法研究腸道微生物菌落，可以對腸道微生物中的所有菌種進行精確定量，該方法已經成為研究腸道微生物豐度變化的主流。

灘寒雜交羊有良好的生長和發(fā)育性能，具有出欄周期短、體型大、肉質鮮嫩等有點，被廣泛飼養(yǎng)[5]。本研究采集20只1月齡～3月齡灘寒雜交羔羊糞便，其中10只無腹瀉癥狀的健康羔羊，10只具有明顯腹瀉癥狀羔羊。提取糞便樣品DNA，PCR 擴增16S rRNA V4-V5區(qū)，Miseq測序，通過數據比對方法分析健康羔羊與腹瀉羔羊腸道菌群落的結構及多樣性。本研究比較健康羔羊及腹瀉羔羊腸道微生物菌群，為患病羔羊能夠得到及時治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所采集的羔羊來自同一羊場3月齡以內3.5 kg～20 kg灘寒雜交羊。采取舍飼管理，羔羊飼養(yǎng)采取哺乳和混合日糧飼養(yǎng)(混合日糧飼料：玉米82%,豆餅15%,石灰石礦石粉1.4%,鹽0.5%,添加劑0.1%，苜蓿干草，可占飼料總量的30%～60%。)，粗料自由采食。所采集的羔羊從未使用任何抗生素類藥物。DNA 提取試劑盒購自Mobio 公司;DNA凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 健康羔羊糞便樣品采集通過尾部固定滅菌試管收集2?！?粒糞便樣品，腹瀉羔羊糞便樣品通過肛門蘸取2個滅菌醫(yī)用棉簽的糞便樣品。樣品存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 樣品總DNA提取 所有糞便樣品均采用DNA 提取試劑盒提取樣品的總基因組DNA，具體的操作嚴格按試劑盒說明書進行。用DNA純化試劑盒純化以及用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳性檢測和Nano drop測定濃度，置-20℃保存。

1.2.3 16S rRNA基因擴增 對所提取的DNA樣品PCR擴增16S rRNA V4-V5區(qū)，選用上游引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和下游引物907R (5′- CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。擴增體系為20 μL體系，采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase，模板為10 ng。擴增條件:95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s；72℃ 45 s，27個循環(huán)；72℃ 10 min。切膠回收PCR產物，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)，Tris-HCl洗脫，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳性檢測。參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進行定量檢測，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。將總PCR產物經Illumina MiSeq2000 測序儀進行PE100-bp 測序(上海凌恩)。

1.2.4 數據分析 使用Trimmomatic和FLASH軟件，將Miseq測序得到的是雙端序列數據進行過濾和拼接。過濾read尾部質量值20 bp以下的堿基，設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp以下的reads；根據PE reads之間的overlap關系，將成對reads拼接成一條序列，最小overlap長度為10 bp；拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列；根據序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調整序列方向，barcode允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2。

原始數據通過優(yōu)化，統(tǒng)計平均序列長度在394 bp左右的。首先，對優(yōu)化序列提取非重復序列(http://drive5.com/usearch/manual/dereplication.html)，以便于降低分析中間過程冗余計算量。其次，去除沒有重復的單序列(http://drive5.com/usearch/manual/singletons.html)；按照RDP classifier貝葉斯算法對97%相似性非重復序列(不含單序列)進行OTU聚類(Usearch，vsesion 7.1 http://drive5.com/uparse/)，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。

2 結果

2.1 數據統(tǒng)計及Specaccum物種累積曲線

擴增提取DNA 16S rRNA V4-V5 區(qū)，擴增的PCR產物條帶大小正確，濃度合適。MiSeq 2 000

測序16 S rRNA并數據優(yōu)化。各個樣本的數據統(tǒng)計，擴增獲得749 183條16 S rRNA序列，總長度為295 823 540 bp，每條序列的平均長度為394.86 bp。物種累積曲線是用于描述隨著樣本量的加大物種增加的狀況(圖1)，當曲線表現(xiàn)趨于平緩，表明抽樣相對充分，能夠反應腹瀉與健康羔羊中的微生物數量及分布。

圖1 測序的樣本數

2.2 腸道菌群的門水平分布

通過同源性序列比對及聚類相結合的方法，將所有的序列鑒定為15個門，相對豐度大于1%進行比較(圖2)，其中擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍細菌門(Cyanobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門 (Spirochaetae)和無壁細菌門(Tenercutes)8個細菌門的相對分度占到了測序的94.3%。變形菌門(Proteobacteria)在腹瀉羔羊中的相對豐度顯著高于健康羔羊(腹瀉羔羊/健康羔羊平均值為14.98% vs 1.63%，P<0.05)，特別是7號腹瀉羔羊中變形菌門相對豐度占56.66%。擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍細菌(Cyanobacteria)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)和無壁細菌門(Tenercutes)在腹瀉羔羊中的相對豐度顯著低于健康羔羊，分別為擬桿菌門(12.22% vs 25.66%，P<0.05)、藍細菌門(0.075% vs 0.53%，P<0.05)、 黏膠球形菌門(0.001% vs 0.035%，P<0.05)、無壁細菌門(0.35%,5.32%)。腹瀉羔羊和健康羔羊腸道中厚壁菌門(Firmicutes)為優(yōu)勢菌門，無顯著差異(腹瀉羔羊/健康羔羊平均相對豐度為70.50%，53.12%，P>0.05)。

左邊柱狀圖為腹瀉樣品(F1～F10),健康樣品(1～10)；右邊柱狀圖F-average為腹瀉羔羊菌落相對豐度的平均值，N-average為健康羔羊菌落相對豐度的平均值

Histogram on the left presents samples from diarrhea (F1-F10) and health lambs(1-10); "F-average" on the right histogram stands for the average microbial abundance among 10 diarrhea lambs,"N-average" stands for the average microbial abundance among 10 health lambs

圖2腸道菌群門水平分布圖

Fig.2 Intestinal microbial distribution in phylum level

2.3 腸道菌群的科水平分布

科水平相對豐度大于10%的優(yōu)勢菌為擬桿菌科(Bacteroidaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、放線菌乳桿菌科(Lactobacillaceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)，其中放線菌乳桿菌科和瘤胃球菌科差異顯著(P<0.05)。放線菌乳桿菌科腹瀉羔羊/健康羔羊相對豐度為23.5% vs 0.07%(P<0.05)，瘤胃球菌科在腹瀉羔羊中的相對豐度顯著低于健康羔羊腸道微生物的比例14.1% vs 40.82%(P<0.05)。然而，擬桿菌科和毛螺科菌相對豐度無顯著差異P>0.05。非優(yōu)勢菌(百分比小于10%)在腹瀉羔羊中的相對豐度顯著低于健康羔羊(P<0.05)。Bacteroidales、Christensenellaceae、Mollicutes和Rikenellaceae在腹瀉羔羊中的相對豐度分別為1%、0.39%、0.32%、0.41%、1.36%，在健康羔羊中的相對豐度分別為6.83%、2.14%、4.63%、1.91%、9.49%(圖3)。

4 討論

腸道菌群主要分為腸腔內菌群和腸道黏膜相關菌群兩大類。腸腔內菌群即糞便菌群，其黏附于食物殘渣或混合于糞便中，主要由好氧菌和兼性好氧菌組成[6]。腸道環(huán)境中80%～99%的微生物是不可培養(yǎng)的，通過高通量測序技術可以定性的測定微生物的形態(tài)特征和豐度，而且能夠分析它們的空間分布、揭示并觀察微生物的多樣性[7]。3月齡以下為高洋期，羔羊腹瀉病是規(guī)模養(yǎng)羊場常見多發(fā)病，但羔羊腸道菌落微生物，特別是腹瀉羔羊的腸道微生物報道較少，本論文就健康羔羊及腹瀉羔羊腸道微生物菌落進行分析，以比較腸道微生物與羔羊腹瀉之間的關系。

總體看來，在所有檢測羔羊中厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌，腹瀉羔羊腸道厚壁菌門高于健康羔羊，但差異不顯著(腹瀉羔羊/健康羔羊平均值為70.50%，53.12%，P>0.05)。而擬桿菌門在腸道菌落的分布中低于健康羔羊并且差異顯著(腹瀉羔羊/健康羔羊平均值為12.22% vs 25.66%，P<0.05)該報道與在人腸道微生物的研究結果相一致[8]。研究發(fā)現(xiàn)在人的腸道菌群中厚壁菌門與擬桿菌門共占到人類遠端腸道菌群的90%以上。文獻報道，這兩組菌門在人體物質代謝過程中發(fā)揮重要作用。擬桿菌門參與碳水化合物的代謝過程，厚壁菌門參與能量的吸收過程，而當菌群失調，厚壁菌門增加而擬桿菌門減少時會增加發(fā)病概率。本研究中腹瀉羔羊中厚壁菌門高于健康羔羊，而擬桿菌門顯著低于健康羔羊，因此，該兩個菌門的相對豐度的差異可能與導致羔羊腹瀉原因之一。變形菌門是細菌中最大的一門，包括很多病原菌，如大腸埃希菌、沙門菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌等。本研究發(fā)現(xiàn)腹瀉羔羊變形菌門明顯高于健康羔羊(6.3倍)。Shin N R等[9]通過對人腸道微生物菌群的研究中發(fā)現(xiàn)健康人體腸道中變形菌門豐度較低，少量的變形菌門與宿主和平共存，而在一些致病因素的作用下會誘發(fā)其大量增殖，產生促炎因子，引發(fā)腸道炎癥發(fā)現(xiàn)腹瀉患者。Durban A等[10]通過進一步研究變形菌門可能參與急性腹瀉的發(fā)生。以上結果與本研究相符，說明腹瀉羔羊腸道變形菌門高于健康羔羊可能是導致腹瀉發(fā)生的病因之一。

左邊柱狀圖為腹瀉樣品(F1-F10),健康樣品(1-10)；右邊柱狀圖“F-average”為腹瀉羔羊菌落相對豐度的平均值，“N-average”為健康羔羊菌落相對豐度的平均值

Histogram on the left presents samples from diarrhea (F1-F10) and health lambs(1-10); "F-average" on the right histogram stands for the average microbial abundance among 10 diarrhea lambs,"N-average" stands for the average microbial abundance among 10 health lambs

圖3腸道菌群科水平分布圖

Fig.3 Intestinal microbial distribution in family level

通過檢索，尚未發(fā)現(xiàn)關于放線菌乳桿菌科與動物腹瀉方面的相關報道。放線菌乳桿菌科一般為非致病菌，如乳酸菌有助于治療某些腸道微生物紊亂的疾病。而本研究結果顯示放線菌乳桿菌科在腹瀉羔羊中的相對豐度顯著高于健康羔羊，在F10羔羊中高達90%。需要進一步對健康羔羊代謝產物等生理機能進行研究，說明放線菌乳桿菌科與羔羊腹瀉的相互關系。瘤胃球菌科是具有差異的優(yōu)勢菌，在腹瀉羔羊中的相對豐度著低于健康羔羊(14.1% vs 40.82%，P<0.05。)胃球菌科屬于革蘭陽性厭氧細菌。存在反芻動物瘤胃等處[11]。瘤胃、網胃和瓣胃是反芻動物前胃。瘤胃微生物在反芻動物的飼料消化過程中起著重要的作用，它們每天消化的量占采食總碳水化合物的50%～55%[12]。健康羔羊中的胃球菌科高于腹瀉羔羊，可能相對腹瀉羔羊，健康羔羊已建力了較為完善的腸道微生物系。羔羊的腸道健康與的腸道微生物多樣性及分布相關。腹瀉羔羊與健康羔羊的微生物存在顯著差異。本研究比較了3月齡以內健康羔羊和腹瀉羔羊糞便微生物菌落，分析了的腸道的差異，為研究腸道微生物與羔羊腹瀉防治提供了理論依據。

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AnalysisofIntestinalMicrobialDiversityinDiarrheaandHealthyLambs

LUO Hai-xia1，YANG Yi1,XIE Xiu-lan2

(1.KeyLaboratoryofMinistryofEducationforConservationandUtilizationofSpecialBiologicalResourcesintheWesternChina,LifeScienceSchool,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia,750021,China; 2.InstituteofAnimalScience,NingxiaAgricultureandForestrySciencesAcademy,Yinchuan,Ningxia,750002,China)

The lamb diarrhea is highly related to the type and proportion of intestinal flora.In order to investigate the changes of intestinal flora during the diarrhea,fecal samples were collected from three-month old sheep under the same feeding condition.The fecal bacteria 16S rRNA V4-V5 regions were detected by Miseq sequencing technology with combining multivariate statistical methods to evaluate the diversity of microbial community.The types and quantities of microorganisms in diarrhea lambs and health lambs were compared by using data analysis.The analysis result demonstrated that Proteobacteria from lambs with diarrhea is significantly higher than that from healthy lambs in the phylum level while Bacteroidetes,Cyanobacteria,Lentisphaerae and Tenercutes in lambs with diarrhea are significantly lower than that from healthy lambs.Dominant bacteria are significantly different in family level.Lactobacillaceae in the intestinal tract of lambs with diarrhea is significantly higher than that from healthy ones.Ruminococcaceae is significantly lower in the health lambs.Non dominant bacteria also demonstrated significant difference,such as Bacteroidales,Mollicutes and Rikenellaceae.The data obtained from this experiment have a certain guidance to understand the composition of the intestinal microflora and provide a practical guidance for treating diarrhea disease effectively.

Tanhan hybrid sheep; lamb; intestinal microorganism; diarrhea

2017-04-11

寧夏自治區(qū)留學人員創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)擇優(yōu)資助項目(寧人社函2014第486號)；寧夏大學人才引進科研啟動基金;寧夏自然科學基金項目(NZ14017);寧夏農林科學院先導基金項目(NKYJ-14-10)

羅海霞(1981-)，女，寧夏海原人，博士，主要從事病原微生物研究。*

S852.6

A

1007-5038(2017)12-0086-05