郝金奇，陳 霞，陸改玲，計晶晶，余艷琴，周 澐

(內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古包頭 014060)

He-Ne激光結(jié)合丹參對類風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠免疫指標的影響

郝金奇，陳 霞*，陸改玲，計晶晶，余艷琴，周 澐

(內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古包頭 014060)

旨在研究激光結(jié)合丹參對Ⅱ型膠原誘導類風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的類風濕性因子、免疫指標、臟器系數(shù)及炎癥因子的變化情況，為治療類風濕性關(guān)節(jié)炎提供參考依據(jù)。用雞Ⅱ型膠原誘導健康雄性Wistar大鼠為類風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠，造模成功后，隨機分為5組，于第35天處死大鼠，取大鼠各臟器，稱取其濕重并計算臟器系數(shù)，檢測并比較各處理組大鼠血清中類風濕性因子(RF)、IL-6、IL-1水平及免疫球蛋白水平等。處理組大鼠血清中的免疫指標IgA水平丹參結(jié)合激光組高于模型組及其他治療組(P<0.05)，免疫指標IgG和IgM水平丹參結(jié)合激光組低于模型組及其他治療組(P<0.05)。與模型組、空白對照組比較，各處理組大鼠臟器系數(shù)含量降低(P<0.05)。各處理組大鼠血清中IL-1、IL-6及RF含量均低于模型組且高于對照組(P<0.05)?？梢娂す饨Y(jié)合丹參對Ⅱ型膠原誘導類風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型具有一定程度的治療效果。

He-Ne激光穴位照射；丹參；類風濕關(guān)節(jié)炎；免疫學指標

類風濕關(guān)節(jié)炎(Rhenmatoid arthritis,RA)是一種慢性、以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥病變?yōu)橹鞯南到y(tǒng)性、異質(zhì)性疾病。在風濕病中危害最大且最難治愈[1-3]。認為RA的發(fā)病可能與遺傳、感染以及免疫紊亂等因素有關(guān)，尤其是與白細胞介素-l(IL-l)、白細胞介素-6(IL-6)等炎癥因子有關(guān)。目前治療風濕病的常用西藥有免疫抑制劑、非甾抗炎藥、激素等[4]，對胃、肝腎損傷很大，且不能治本。而常用中藥如雷公藤，青風藤也有副作用[5-7]。因此，尋找安全、高效的創(chuàng)新療法成為該領(lǐng)域研究的熱點。風濕病屬中醫(yī)“痹癥”，正如清代王清任的《醫(yī)林改錯》中所說“痹證有瘀血”。明·李中梓《醫(yī)宗必讀卷十·痹》書中提到“治風先治血，血行風自滅”。丹參具有涼血消癰、活血祛瘀、通經(jīng)止痛等功效，研究表明丹參可參與機體的免疫調(diào)節(jié)以及減輕炎癥反應，尤其是對IgA具有活化作用并且可以減少IL-6的分泌[8]。激光對組織有生物效應，能增強新陳代謝、消除腫脹和炎癥、以及鎮(zhèn)痛、改善血液流變學和微循環(huán)，調(diào)節(jié)機體免疫功能[9-13]，在治療風濕病方面也有報道[14-18]。通過He-Ne激光血管內(nèi)照射可以提高T淋巴細胞數(shù)目和淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率，能使免疫球蛋白、補體正?；?，循環(huán)免疫復合物的水平下降，對RA有較好治療效果[19]。本文通過對健康大鼠注射雞Ⅱ型膠原誘導建立大鼠類風濕性關(guān)節(jié)炎模型，并觀察丹參及激光照射對類風濕性因子、免疫指標、臟器系數(shù)及炎癥因子的影響，以便為臨床治療風濕病提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 由內(nèi)蒙古大學動物中心提供清潔級健康雄性Wistar大鼠40只，編號為Scxk(蒙)2016-0001，8周齡～10周齡，體重180 g～200 g。所有大鼠飼養(yǎng)環(huán)境條件均一，溫度是25℃，自然光線，環(huán)境清潔，標準顆粒鼠糧喂養(yǎng)，水分充足，隨機分籠，自由活動，適應性喂養(yǎng)1周，所有Wistar大鼠試驗的方法、檢測均得到倫理委員會的認可。隨機分為: A空白對照組， B模型組，C激光治療組，D丹參治療組，E丹參結(jié)合激光治療組。

1.1.2 主要試劑和儀器 注射用青霉素鈉、丹參注射液、生理鹽水和戊巴比妥鈉粉劑，哈藥集團制藥總廠生產(chǎn)；冰醋酸，臺山市新寧制藥有限公司生產(chǎn)；100 mL/L多聚甲醛，天津市天大化工實驗廠生產(chǎn)；完全弗氏佐劑(CFA)、雞Ⅱ型膠原(CⅡ)、大鼠類風濕因子(RF)ELISA檢測試劑盒，大鼠IL-1ELISA，IL-6ELISA試劑盒，美國Sigma公司產(chǎn)品； FSH-2型高速勻漿機，江蘇省環(huán)宇科學儀器廠產(chǎn)品；HJ-1B型氦氖激光照射儀，南京激光儀器廠產(chǎn)品；酶標分析儀，荷蘭PHILIPS公司產(chǎn)品。

1.2 方法

所有大鼠都通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液進行麻醉按照40 mg/kg體重。將冰醋酸0.05 mL加入到100 mL去離子水中，形成混合溶液a；取一定體積的a溶液加入一定質(zhì)量的雞Ⅱ型膠原得到2 mg/mL的混合溶液b；取一定體積的b溶液再加入相同體積的完全弗氏佐劑在冰浴條件下用高速勻漿機充分混合，制成混合乳劑c，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｓ诿恐淮笫笃つw、腳掌、尾部，分點皮內(nèi)注射混合乳劑c(0.3 mL)進行類風濕性關(guān)節(jié)炎造模，并用雙氧水、無菌生理鹽水沖洗注射針口處，再用碘伏消毒，空白對照組腹腔注射生理鹽水。每只大鼠腹腔每日注射1次青霉素鈉(每只每次30萬單位)預防感染，連續(xù)注射3 d。在試驗第7天進行第2次類風濕性關(guān)節(jié)炎造模，操作同上。

1.2.1 試驗分組及藥物治療方案 把40只雄性Wistar大鼠隨機分為5組(各8只)。A空白對照組：腹腔注射生理鹽水來代替造模的誘導乳劑，不給予治療。B模型組：造模成功后，不給予治療；C激光治療組：造模成功后，采用He-Ne激光隔日足三里穴位照射1次，照射時間為30 min；D丹參治療組：造模成功后，給予0.8 mg/kg丹參腹腔注射治療，隔天1次；E丹參結(jié)合激光治療組：造模成功后，給予0.8 mg/kg丹參腹腔注射治療，隔天1次，并且采用He-Ne激光隔日足三里穴位照射1次，照射時間為30 min。

1.2.2 He-Ne激光穴位照射 采用He-Ne激光(波長是632.8 nm)隔日進行穴位照射，光斑直徑約4 mm，輸出功率為1.2 mw～1.5 mw，用大鼠固定器固定大鼠，每次照射足三里30 min。足三里在膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處[20-21]。

1.2.3 檢測指標

1.2.3.1 大鼠血清中免疫指標的測定 于試驗第35天處死大鼠，通過腹主動脈取血5 mL/只，離心、吸取上層血清，分裝，標本隨即封凍于-80℃冰柜中待檢，檢測得各組大鼠血清中IgG、IgA、IgM的含量。

1.2.3.2 臟器系數(shù)測定 處死大鼠后，取出脾、肝臟、腎臟、心臟和肺臟，以濾紙吸干表面血污，分別于電子天平上稱取濕重，并計算臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=本只大鼠器官濕重/本只大鼠體重)。

1.2.3.3 大鼠血清中炎癥因子及類風濕性因子的測量 處死大鼠腹主動脈取血5 mL/只，離心、吸取上層血清，分裝，標本隨即封凍于-80℃冰柜中待檢。用ELISA法檢測不同處理組大鼠血清中炎癥因子(IL-1、IL-6)及類風濕性因子(AF)含量比較，嚴格按照說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 不同處理對免疫指標的影響

處理組大鼠血清中的免疫指標 IgA水平丹參結(jié)合激光組高于模型組及其他治療組(P<0.05)，免疫指標 IgG和 IgM水平丹參結(jié)合激光組低于模型組及其他治療組(P<0.05)，樣本間多重比較LSD結(jié)果顯示IgA模型組低于其他治療組,與模型組大鼠比較，各治療組大鼠血清中IgM、IgG水平均降低(P<0.05)，而激光結(jié)合丹參治療組降低比較明顯，IgA僅丹參結(jié)合激光治療組升高(P<0.05)(表1)。

表1 不同處理組免疫指標比較

注：※與空白組比較，*與模型組比較，#與激光組比較(P<0.05)。

Note:※Compared with the blank control group；*compared with the model group；#compared with the laser group(P<0.05).

2.2 不同處理對臟器系數(shù)的影響

方差分析結(jié)果證實各處理組大鼠臟器系數(shù)均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，而LSD比較結(jié)果顯示，與空白對照組比較，各處理組大鼠臟器系數(shù)含量降低且有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與模型組大鼠比較，各處理組臟器系數(shù)均顯著降低(P<0.05)，而丹參結(jié)合激光治療組降低比較明顯(表2)。

表2 不同處理組臟器系數(shù)比較

注：※與空白組比較，*與模型組比較，#與激光組比較(P<0.05)。

Note:※compared with the blank control group,*compared with the model group,#compared with the laser group(P<0.05).

2.3 不同處理對大鼠血清中炎癥因子及類風濕性因子含量的影響

方差分析結(jié)果顯示，各處理組大鼠血清中IL-1、IL-6及RF含量均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，LSD比較結(jié)果顯示與空白對照組大鼠比較，各處理組血清中IL-1、IL-6及RF含量顯著升高(P<0.05)，與模型組大鼠比較，丹參治療組、激光治療組以及激光結(jié)合丹參治療組大鼠血清中IL-1、IL-6及RF含量均顯著降低(P<0.05)，而激光結(jié)合丹參治療組降低比較明顯(表3)。

表3 不同處理組(IL-1、IL-6)及類風濕性因子(RF)水平比較

注：※與空白組比較，*與模型組比較，#激光組比較(P<0.05)。

Note:※compared with the blank control group,*compared with the model group,#compared with the laser group(P<0.05).

3 討論

3.1 不同處理對免疫指標的影響的分析

IgG是細細胞外液和血液中再次免疫應答的主要抗體，也是機體再次免疫應答的主要抗體。IgA是參與黏膜局部免疫的主要抗體。IgM是抗原刺激誘導的體液免疫應答中最早出現(xiàn)的抗體[22]。本試驗顯示，處理組大鼠血清中的免疫指標IgA水平丹參結(jié)合激光組高于模型組及其他治療組(P<0.05)，免疫指標 IgG和 IgM水平丹參結(jié)合激光組低于模型組及其他治療組(P<0.05)與研究報道一致，說明體液免疫參與類風濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程[22]。而丹參可以通過降低ox-LDL、IgG、IgA、IgM的水平恢復免疫功能[23]。各處理組比較中IgM、IgG水平降低空白對照組(P<0.05)，丹參治療組、激光治療組以及丹參結(jié)合激光治療組大鼠血清中IgM、IgG水平均低于模型組(P<0.05)，而丹參結(jié)合激光治療組降低比較明顯，而IgA無統(tǒng)計學差異，說明類風濕性關(guān)節(jié)炎可以導致模型組大鼠出現(xiàn)炎癥反應而出現(xiàn)特異的臨床癥狀與體癥，而丹參在類風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中具有很好的治療效果，并且He-Ne激光血管內(nèi)照射可以降低血清免疫球蛋白水平[24]。這說明激光結(jié)合丹參可以有效的恢復類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠的各項免疫指標。在本研究中IgA模型組低于丹參結(jié)合激光治療組(P<0.05)，可能與類風濕性關(guān)節(jié)炎可以導致模型組大鼠出現(xiàn)比較嚴重的局部反應，經(jīng)過激光穴位照射治療、丹參治療以及丹參結(jié)合激光治療恢復到一定程度，其中丹參結(jié)合激光恢復程度最快。

3.2 不同處理對臟器系數(shù)影響的分析

動物的臟器系數(shù)是動物實驗中常用的重要評價指標之一[25]。動物染毒后受損臟器臟器系數(shù)隨之改變。臟器充血、水腫或增生肥大等會增大臟器系數(shù)，反之臟器萎縮及其他退行性改變減小臟器系數(shù)。本研究結(jié)果顯示，各處理組大鼠臟器系數(shù)均低于空白對照組(P<0.05)，模型組大鼠臟器系數(shù)均高于丹參治療組、激光治療組以及丹參結(jié)合激光治療組(P<0.05)，而丹參結(jié)合激光治療組降低比較明顯。說明類風濕關(guān)節(jié)炎對肝臟、脾、腎臟、心臟和肺臟都有不同程度的損害，與其他報道的結(jié)果一致[26]，可能與類風濕性關(guān)節(jié)炎對某些靶器官損害所導致的，而各治療組的臟器系數(shù)又有所上升，可以證明丹參結(jié)合激光對類風濕關(guān)節(jié)炎有較好的治療作用。

3.3 不同處理對大鼠血清中炎癥因子及類風濕性因子含量的影響

類風濕性因子(RF)主要存在于患者的血清和關(guān)節(jié)液中，是類風濕關(guān)節(jié)炎臨床診斷的標準。研究認為類風濕關(guān)節(jié)炎是T淋巴細胞介導的自身免疫性疾病,在RA 的發(fā)病機制的研究中,T 淋巴細胞、細胞因子IL-1和IL-6在介導炎癥反應及對組織損傷起著重要的作用。目前認為IL-1是參與RA 進展期關(guān)節(jié)破壞的典型前炎癥細胞因子，IL-6可增強IL-1的某些生物效應。在臨床上，RA患者體內(nèi)促炎細胞因子IL-1水平升高。本實驗大鼠造模后，IL-1和IL-6水平明顯升高，說明該模型與臨床表現(xiàn)的一致性。其他各處理組大鼠血清中IL-1、IL-6及RF含量均低于模型組(P<0.05)，各處理組血清中IL-1、IL-6及RF含量高于空白對照組(P<0.05)，丹參治療組、激光治療組以及激光結(jié)合丹參治療組大鼠血清中IL-1、IL-6及RF含量均低于模型組(P<0.05)，而激光結(jié)合丹參治療組降低比較明顯。本實驗結(jié)果與研究報道一致[23]，分析可能在類風濕性關(guān)節(jié)炎可以導致大鼠出現(xiàn)比較嚴重的炎癥反應，而經(jīng)過激光結(jié)合丹參治療可以有效降低IL-1、IL-6及RF含量，并且可以有效抑制各炎癥因子的形成，對類風濕關(guān)節(jié)炎有較好的保護和治療作用。

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EffectsofHe-NeLaserCombinedwithSalviaMiltiorrhizaonImmuneIndicesofRheumatoidArthritisRats

HAO Jin-qi，CHEN Xia，LU Gai-ling，JI Jing-jing，YU Yan-qin，ZHOU Yun

(BaotouMedicalCollege,Baotou，InnerMongolia，014060,China)

To study the changes of organ coefficient，immune indices and inflammatory factors in the model of collagen induced rheumatoid arthritis in rats by Salvia miltiorrhiza combined with laser for providing a new therapy for the treatment of rheumatoid arthritis,the rats were injected with the chicken collagen of typeⅡ for inducing rats rheumatoid arthritis model,and then divided randomly into 5 groups.The changes of organ coefficients，immune indices，rheumatoid factor and inflammatory factors (IL-6,IL-1)were measured.IgA level in serum of rat group with Salvia miltiorrhiza plus laser was higher than that in the model group and other treatment groups (P<0.05),IgG and IgM levels of Salvia miltiorrhiza combined with laser group was lower than that of model group and other treatment groups (P<0.05).Compared with the model group and the blank control group,the organ coefficients of the rats in each treatment group decreased (P<0.05).The contents of IL-1,IL-6 and RF in serum of treatment group were lower than that in model group,and higher than that in control group (P<0.05).It can be seen that Salvia miltiorrhiza combined with laser has a certain degree of therapeutic effect on type II collagen induced rheumatoid arthritis rat model.

He-Ne laser acupoint irradiation; Salvia miltiorrhiza; Rheumatoid arthritis; immunology index

2017-04-26

包頭市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目(Wsjj2014014)

郝金奇(1980-)，男，山東菏澤人，講師，碩士，主要從事預防醫(yī)學研究。*

S852.4

A

1007-5038(2017)12-0054-05