李卓+李莉玲+苗長春+梁子豪+鄭文官+陳澤田+潘韻

摘要：指出了拮抗細(xì)菌B是實驗室從種植小麥的土壤中分離和篩選出來的對小麥紋枯病菌具有良好拮抗作用的生物防治菌種，通過室內(nèi)防效盆栽試驗，證明了拮抗細(xì)菌B有很好的抵抗禾谷絲核菌的能力。同時根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性測定和 16SrDNA序列分析將拮抗細(xì)菌B鑒定為枯草芽孢桿菌。試驗采用拮抗細(xì)菌B的發(fā)酵液、三唑酮，多菌靈，井岡·蠟芽菌（井崗霉素蠟樣芽孢桿菌）處理小麥種子，萌發(fā)后測量小麥的種子萌發(fā)率，小麥生長到一定時間后測株高及鮮重，從而評價了拮抗細(xì)菌發(fā)酵液的植物安全性。結(jié)果表明：拮抗細(xì)菌B發(fā)酵液對小麥種子的萌發(fā)和幼苗的生長具有促進作用。同時與市面上常用殺菌劑三唑酮等進行對比，分析了其對小麥萌發(fā)和生長改善的影響。探討了驗證拮抗細(xì)菌B的實際效用，以期為小麥紋枯病的有效防治和微生物生防殺菌劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：禾谷絲核菌；拮抗細(xì)菌；生物防治；小麥；安全性評價

中圖分類號：S435

文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：16749944（2017）23013904

1 引言

當(dāng)下，并沒有相應(yīng)的小麥品種能有效的抵抗小麥紋枯病，在目前的生產(chǎn)中，對于該病主要是化學(xué)防治，目前防治小麥紋枯病較好的殺菌劑主要有井岡霉素、三唑酮、三唑醇、烯唑醇和紋霉凈（復(fù)配劑）。一般采用2種藥劑拌種處理和春季拔節(jié)期噴1次的防治方法。但是由于大量使用及使用的不合理，使小麥紋枯病菌對一些常用的化學(xué)殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，使藥劑使用量越來越大，成本越來越高，效果很不理想，且使用化學(xué)試劑的殘留物對環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品造成污染產(chǎn)生危害[1]。因此，從小麥土壤中篩選有益的微生物，利用生物防治的方法進行防治成為當(dāng)下研究的熱點，但是，研究出來的成果表現(xiàn)出效果達(dá)不到預(yù)期效果和不穩(wěn)定的特性，所以篩選出高效菌株同時提高菌株的穩(wěn)定性成為當(dāng)下研究的新目標(biāo)。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的對小麥紋枯病菌具有較強抑制作用的生物防治菌株有放線菌 S024、B-3、蠟樣芽孢桿菌 2011、2012、2013 和枯草芽孢桿菌 2014 等，使用這些菌株處理過的種子和植株后都能在植株體內(nèi)定殖，并且能促進小麥植株的生長，提高品質(zhì)及抗逆性。上海農(nóng)樂生物制品有限公司將井崗霉素與蠟樣芽孢桿菌混合研制出井岡·蠟芽菌，蠟質(zhì)芽孢桿菌與井岡霉素經(jīng)生物融合培養(yǎng)后，可以有效地防治作物真菌病害，既緩解了井岡霉素抗性，又提高了防治效果，同時還有增產(chǎn)作用，大大降低了農(nóng)業(yè)成本[2]。

枯草芽孢桿菌拮抗植物病原菌的重要作用機理之一是與病原菌存在營養(yǎng)和空間位點的競爭?？莶菅挎邨U菌可以在植物根際、 體表或體內(nèi)及土壤中快速、大量繁衍和定殖，當(dāng)枯草芽孢桿菌覆蓋植物表面時會減少植物病原微生物與植物體的接觸，有效的阻止和干擾了植物病原微生物在職務(wù)上的繁殖和感染，從而達(dá)到抑制病原菌生長，植物病發(fā)減少的效果[3，4]。

細(xì)菌在生長和繁殖的過程中會分泌出一些物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠促進細(xì)菌的生長和繁殖，同時這些物質(zhì)也可以成為阻止其它細(xì)菌生長或者直接殺滅其它細(xì)菌的物質(zhì)?？莶菅挎邨U菌也不例外，枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生枯草菌素（Subtilin）和枯草桿菌蛋白酶（Subtilosin），這兩種細(xì)菌素屬于抗菌肽類型，具有水溶性好、熱穩(wěn)定性強、分子量低、強堿性和廣譜抗菌的特點。枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的枯草菌素對致病菌等有很好的抗性，不僅在植物生防領(lǐng)域，在食品行業(yè)中也有很大用途：可以用作食品保鮮及食品防腐。這些新型抗菌物質(zhì)的研究為抗菌基因，新型轉(zhuǎn)基因抗病植物的研究奠定基礎(chǔ)，提供理論指導(dǎo)。

2 研究目的及意義

枯草芽孢桿菌生長繁殖迅速，菌株對營養(yǎng)的要求比較單一簡單，產(chǎn)生的芽孢能在高溫下存活，抗逆性強，利于菌種的保藏和運輸，又能忍受極端的外部環(huán)境而長期存活，可以制成粉劑、可濕性粉劑等各種劑型，能與化學(xué)農(nóng)藥混用而不失活，在工業(yè)生產(chǎn)中：成本低、容易繁殖、生產(chǎn)工藝簡單，這些都能使枯草芽孢桿菌成為一種非常好的生物生產(chǎn)藥劑。美國己有 4 株枯草芽抱桿菌生防菌株 （ QST713、MB1600、GB03 和 FZB24） 得到了美國環(huán)保署 （ EPA） 商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可。在預(yù)防病菌的同時也成為植物增加產(chǎn)量產(chǎn)促進生長的藥劑。

在國內(nèi)也利用枯草芽孢桿菌防治植物病害，主要菌株有枯草芽孢桿菌B908，B3等。B908通過營養(yǎng)及與其他致病菌競爭生存空間的方式對那些容易被土壤中的病原菌侵害的農(nóng)作物具有很好的抑菌作用，事實證明：B908對紋枯病的防治效果能達(dá)到70%。如果能更好的了解到枯草芽孢桿菌的一些生理特性及枯草芽孢桿菌對不同病原菌的抑制機理，就可以進一步的研制開發(fā)出新的配方，用枯草芽孢桿菌與其他菌種或者化學(xué)農(nóng)藥配合，生產(chǎn)出既能對植物病原菌產(chǎn)生拮抗作用，還能促進植物生長的復(fù)方農(nóng)藥。

本課題利用實驗室分離鑒定出的對小麥紋枯病具有防止作用的枯草芽孢桿菌：拮抗細(xì)菌B，用其發(fā)酵液與一些常用殺菌劑進行室內(nèi)盆栽防效試驗，對拮抗細(xì)菌B對小麥生長的影響進行探究，為防治小麥紋枯病和枯草芽孢桿菌在植物生防方面的研究提供理論依據(jù)。

3 試驗材料與方法

3.1 供試菌種與材料

供試菌株：拮抗細(xì)菌B（由實驗室提取鑒定保藏的對小麥紋枯病具有拮抗作用的菌種）

小麥品種：鄭麥9023（實驗室保藏）。

對比藥劑：三唑酮（成都科利隆生化有限公司）；多菌靈（上海滬禾科技發(fā)展有限公司）；井岡·蠟芽菌（上海農(nóng)樂生物制品有限公司）。

3.2 試劑及儀器

3.2.1 試劑名稱及生產(chǎn)廠家

試驗試劑名稱及生產(chǎn)廠家，如表1所示。

3.2.2 實驗儀器

實驗儀器的有關(guān)信息，如表2所示。

3.3 試驗方法

3.3.1 培養(yǎng)基的配制

（1）LB固體養(yǎng)基的配制。成分：蛋白胨1 g、 酵母膏0.5 g、氯化鈉1 g、蒸餾水100 mL 、1 mol/L NaOH溶液、pH值為7.0瓊脂粉1.5 g。

①稱量及溶化取所需要的燒杯至于電子秤上，去皮，按比例加入蛋白胨、氯化鈉和酵母膏（酵母膏為粘稠狀固體，用玻璃棒挑取稱量）。然后加入所需的水量的一半，放在電爐上加熱攪拌，使試劑全部融化。

②調(diào)pH值。用1 mol/LNaOH溶液調(diào)pH值至7.0。

③定容。將溶液倒入量筒中，補充水量至所需體積。

④加瓊脂。加入培養(yǎng)基所需的瓊脂的用量，在電爐上加熱使瓊脂融化，最后補充失去的水量使培養(yǎng)基達(dá)到所需要的體積。

⑤分裝、加塞、包扎。

⑥高壓蒸汽滅菌0.1 MPa滅菌20 min。

⑦在無菌操作臺中倒平板。

（2）LB液體培養(yǎng)基的配制。成分：蛋白胨 1 g、酵母膏 0.5 g、氯化鈉 1 g、蒸餾水 100 mL、1 mol/L NaOH溶液、pH值為7.0。

（3）細(xì)菌發(fā)酵液培養(yǎng)基的配制。成分：0.8%甘油、0.3%酵母膏、0.2%硫酸鎂、0.2%磷酸氫二鉀、蒸餾水 100 mL、pH值為6.8。

3.3.2 拮抗細(xì)菌B的活化

將雙人雙面超凈工作臺用75% 的酒精擦凈，打開紫外燈照射30 min殺菌，用LB固體培養(yǎng)基倒平板，等到固體培養(yǎng)基冷卻凝固后，用經(jīng)過滅菌處理的接種環(huán)挑取一環(huán)待活化的拮抗細(xì)菌B在固體培養(yǎng)基上劃線接種；然后將培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中將溫度調(diào)至28 ℃培養(yǎng)半天用以活化菌種。

3.3.3 拮抗細(xì)菌B發(fā)酵液的制備

在無菌操作臺上，將拮抗細(xì)菌B各挑取一環(huán)接入裝有20 mL LB液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，在28 ℃，200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)12 h。按4% 的接種量，用移液管或移液槍吸取菌液4 mL接種到裝有100 mL細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)液的250 mL三角瓶，在28℃，180 r/min條件下，搖床培養(yǎng)48 h。經(jīng)10000 r/min離心10 min后收集拮抗細(xì)菌B發(fā)酵上清液，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3.4 拮抗細(xì)菌B發(fā)酵液的植物安全性分析

（1）小麥種子預(yù)處理。用水洗滌小麥種子兩次，使小麥種子中的雜物洗掉；用3%的雙氧水浸泡小麥種子10 min；用水把種子漂洗干凈，然后用蒸餾水浸泡小麥種子24 h；把8～16層被水潤濕的紗布平鋪在磁盤中，然后把浸泡后的小麥種子均攤在紗布上置于陰暗處常溫下保存，每天灑水于種子上使種子和紗布保持濕潤。

（2）小麥種子的拌種處理。等到經(jīng)預(yù)處理的小麥種子露白后挑取露白程度良好的種子500粒，均分為5組即每組100粒，分別置于5個小燒杯中，編號A B C D E；分別稱取三唑酮0.0408 g、多菌靈0.0534 g 和井岡蠟0.402 g，再用蒸餾水分別稀釋為100 mL，得到三種藥劑稀釋液，然后分別編號為a b c；分別用移液管吸取a b c三種稀釋液10 mL分別置于A、B、C三個小燒杯中，同時分別移取10 mL的拮抗細(xì)菌B的發(fā)酵液，10 mL蒸餾水置于D、E燒杯中；再向A、B、C、D、E 5個小燒杯中分別加入1.224 g滑石粉并且用玻璃棒充分?jǐn)嚢枋?個燒杯中的物質(zhì)混合均勻；將A、B、C、D、E 5個小燒杯中的小麥種子分別以每個燒杯對應(yīng)5盆每盤20粒種植于編號為1～25的25個盛裝有混合營養(yǎng)土的花盆中；然后把花盆置于有一定水深的盆子中，等待土壤全部浸濕后取出種植有小麥種子的花盆；處理組和對照組放在相同光照強度的室溫環(huán)境中培養(yǎng)，每天光照和黑暗時間均為12 h，每天以每盆相同的水量灑水一次使土壤保存濕潤。

（3）小麥種子萌發(fā)率的測定。待小麥種子萌發(fā)后分別測定每盆中萌發(fā)的小麥幼苗數(shù)并記錄數(shù)據(jù)。

（4）小麥幼苗株高的測定。當(dāng)小麥幼苗生長到一心一葉期后的第3 d分別用毫米刻度尺測定每盆中各株幼苗的株高并記錄數(shù)據(jù)。

（5）小麥幼苗鮮重的測定。在測定株高后將所有的小麥幼苗連同根部拔出，用清水洗滌去除塵土，置于恒溫干燥箱內(nèi)烘干，然后稱量每株幼苗的鮮重并記錄所測得的數(shù)據(jù)。

4 結(jié)果與分析

4.1 不同處理結(jié)果對小麥種子萌發(fā)率的影響

不同處理結(jié)果對小麥種子萌發(fā)率的影響，如表3所示。

在上述表格中如果同列中具有相同的字母，說明該處理結(jié)果在0.05或0.01水平上差異不顯著；若字母不同，說明該處理結(jié)果在0.05或0.01水平上差異顯著（結(jié)果處理采用Duncan法）。

4.2 不同的處理對小麥幼苗株高的影響

不同的處理對小麥幼苗株高的影響，如表4所示。

在上述表格中如果同列中具有相同的字母，說明該處理結(jié)果在0.05或0.01水平上差異不顯著；若字母不同，說明該處理結(jié)果在0.05或0.01水平上差異顯著（結(jié)果處理采用Duncan法）。

4.3 不同的處理對小麥幼苗鮮重的影響

不同的處理對小麥幼苗鮮重的影響，如表5所示。

在上述表格中如果同列中具有相同的字母，說明該處理結(jié)果在0.05或0.01水平上差異不顯著；若字母不同，說明該處理結(jié)果在0.05或0.01水平上差異顯著（結(jié)果處理采用Duncan法）。

從上述的3個實驗結(jié)果表格分析，用拮抗細(xì)菌B與對照組清水相比，拮抗細(xì)菌B對小麥種子萌發(fā)，小麥幼苗株高，小麥鮮重都具有明顯的促進作用，達(dá)到了極顯著水平差異。

與常用殺菌劑三唑酮對比，拮抗細(xì)菌B在對小麥種子的萌發(fā)和小麥幼苗鮮重的促進作用上與三唑酮近似，未達(dá)到顯著水平，但是對小麥幼苗株高的促進作用上沒有三唑酮效果好，達(dá)到了顯著水平但未達(dá)到極顯著水平。

與常用殺菌劑多菌靈對比，拮抗細(xì)菌B對小麥種子萌發(fā)的促進作用要好于多菌靈，達(dá)到了極顯著水平，對小麥幼苗株高，鮮重的促進作用上與多菌靈近似，沒有明顯差別。

與混合殺菌劑井岡·蠟芽菌對比，拮抗細(xì)菌B在對小麥種子的萌發(fā)和小麥幼苗株高的促進作用上與井岡·蠟芽菌近似，沒有明顯差別，但是對于小麥鮮重的影響上拮抗細(xì)菌B要明顯好于井岡·蠟芽菌，達(dá)到了極顯著水平。

5 討論

在本次實驗研究中，利用同樣的實驗室土壤，在相同的環(huán)境下，用常用殺菌劑和空白對照表現(xiàn)出實驗室菌株拮抗細(xì)菌B對小麥種子的萌發(fā)率及幼苗的生長具有促進作用。實驗過程中，一共進行了兩組實驗，在第一次實驗中，在拮抗細(xì)菌B發(fā)酵培養(yǎng)完后，并沒有進行離心處理，在培養(yǎng)液中保留了拮抗細(xì)菌B，直接與處理過的小麥種子進行攪拌，在小麥培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)小麥種子的萌發(fā)率相對應(yīng)的高些，但是生長狀態(tài)卻不如經(jīng)過殺菌劑處理過的樣品。在第二次實驗中，嚴(yán)格按照實驗流進行處理，過程中保持五組樣品處理的高度一致性，處理數(shù)據(jù)得到表3、表4和表5。由上述表格中的數(shù)據(jù)可以看出，實驗室所篩選出來的拮抗細(xì)菌B對小麥種子的萌發(fā)和幼苗的生長具有促進作用，雖然在某些方面不如化學(xué)殺菌劑，但是達(dá)到的總體效果令人滿意。通過實驗證明，拮抗細(xì)菌B在提高小麥種子萌發(fā)率、促進幼苗生長上比多菌靈，井岡·蠟芽菌要好，與三唑酮效果相當(dāng)。實驗中使用的土壤為實驗室內(nèi)土壤，但是沒有經(jīng)過滅菌處理，可能在這個方面會使實驗結(jié)果產(chǎn)生一定的誤差。有的菌株能夠產(chǎn)生一些具有促進植物生長的生物質(zhì)，這些生物質(zhì)可以直接對植物的生長或者種子的萌發(fā)具有促進作用。從本次所做的兩組實驗的結(jié)果來看，不難分析出本實驗室的拮抗細(xì)菌B自身對小麥沒有明顯的促進生長的作用，但是通過對拮抗細(xì)菌B進行發(fā)酵，發(fā)酵出來的細(xì)菌培養(yǎng)液對小麥種子的萌發(fā)和小麥幼苗的生長有很明顯的促進作用。

基于這種結(jié)果，可以用拮抗細(xì)菌B發(fā)酵出來的細(xì)菌培養(yǎng)液與一些常見的農(nóng)藥如井岡霉素混合，用不同的配比制作出一些新型的復(fù)合農(nóng)藥，用于田間試驗，一方面可以繼續(xù)檢測拮抗細(xì)菌B發(fā)酵出來的細(xì)菌發(fā)酵液對禾谷絲核菌的拮抗作用，另一方面也可以研發(fā)出新的農(nóng)藥，不僅對植物病原菌具有抗性，同時對植物種子的萌發(fā)和植株的生長具有促進作用。同時，運用單克隆，也可以批量生產(chǎn)拮抗細(xì)菌B，檢測出拮抗細(xì)菌B對病原菌拮抗的有效成分。進而，可以從拮抗細(xì)菌B中提取出產(chǎn)生該種物質(zhì)的遺傳物質(zhì)片段，進行質(zhì)粒重組，嫁接到大腸桿菌等繁殖速度快的菌種中，進行工業(yè)化生產(chǎn)。

通過研究拮抗細(xì)菌B和D與市售殺菌劑對小麥種子萌發(fā)、株高及鮮重的影響，研究得出以下結(jié)論：① 對禾谷絲核菌具有拮抗作用的拮抗細(xì)菌B同時對小麥的生長有促進作用。②拮抗細(xì)菌B本身不能很好的促進小麥生長，而是其發(fā)酵產(chǎn)物能促進小麥生長。③與生物農(nóng)藥井岡·蠟芽菌相比，拮抗細(xì)菌B和D的發(fā)酵產(chǎn)物對小麥株高和鮮重的影響要好。

6 展望

在科技發(fā)展的今天，隨著人們對農(nóng)作物的培育，各種高產(chǎn)作物的出現(xiàn)使農(nóng)作物病害成為減產(chǎn)的重要原因，一般來說，在農(nóng)作物的種植上，都是采用噴灑農(nóng)藥的方式去消滅一些病蟲害，但是對于由病菌引起的病害，只能通過加大相應(yīng)農(nóng)藥用量或者增大種植空隙來消除或減輕。由于農(nóng)作物面積廣，大量的農(nóng)藥會流入土壤、地下水、河水等，不僅污染土壤河流，同時也會使水中的水產(chǎn)品，和土地中的農(nóng)副產(chǎn)品相應(yīng)的攜帶殘留農(nóng)藥，農(nóng)藥的積累不僅會破壞生態(tài)平衡，而且會通過食物鏈的累積使人攝入，間接的危害到人們的健康。農(nóng)藥的過度使用也會使病菌產(chǎn)生抗藥性，降低了農(nóng)藥的效果。我國耕地面積廣泛，不同土壤中含有不同的微生物，從這些微生物中篩選出對某些病原菌具有拮抗作用的真菌細(xì)菌，用這些具有拮抗作用的真菌細(xì)菌制成農(nóng)藥防治農(nóng)作物病害，不僅對新型生物農(nóng)藥的開發(fā)具有十分重要的作用，也對我國的農(nóng)業(yè)具有重大意義。

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