諶立新+梅麗+張海姬+侯東敏+朱萬龍+王政昆

摘要：指出了SRY基因是存在于哺乳動物雄性Y 染色體上的性別決定基因，對該基因的檢測可以快速準(zhǔn)確地判定性別。利用分子糞便學(xué)方法從野外獲取中緬樹鼩糞便中提取到的基因組DNA，運(yùn)用雙重PCR同時擴(kuò)增SRY基因和微衛(wèi)星DNA后，經(jīng)過電泳分析最終鑒定出了79只樹鼩的性別。

關(guān)鍵詞：中緬樹鼩；糞便DNA；SRY基因；性別鑒定

中圖分類號：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：16749944（2017）22013103

1 引言

在地球上現(xiàn)存的動物中，凡是靠有性生殖來繁衍后代的種類，大多有雌雄個體之別。性別控制一直是人們所感興趣的話題，在生物體內(nèi)幾乎都存在著性別決定系統(tǒng)，分化的雌雄兩性無論在生理、行為、器官方面都存在顯著差異，在某些低等的生物中還存在雌雄同體的情況，在某些物種中也有一些能進(jìn)行孤雌生殖的物種僅僅只有一種性別的生物。性別決定是通過遺傳和環(huán)境的作用使個體建立性別的過程，性染色體就是與性別分化直接相關(guān)的染色體[1]。動物的個體發(fā)育除了極低等的幾種以外，多是從受精卵開始的，而性別決定與分化基本上是在胚胎時期就已完成，對于不同動物而言，其性別決定的影響因子也各不相同，因此，生物的性別決定一直在生物學(xué)中是令人感興趣的研究領(lǐng)域，但決定性別分化的機(jī)制是比較復(fù)雜的，是由遺傳、環(huán)境和生理因素相互作用的結(jié)果[2]。

1959年，F(xiàn)acobs提出哺乳動物的Y染色體在性別分化中起決定性作用[3]，于是許多科學(xué)家將目光聚集到雄性動物的Y染色體上，直至1990年，英國學(xué)者Sinclair在其研究中發(fā)現(xiàn)哺乳動物Y染色體的短臂邊緣存在決定性別的片段即SRY基因。1991年，Koopman將含有SRY基因的Y染色體片段注入雌性小鼠胚胎中，最終導(dǎo)致了雌性小鼠生殖原基退化逐步發(fā)育為雄性，證明了SRY基作為哺乳動物的性別決定基因[4]。SRY基因被定義為Y染色體性別決定序列，廣泛存在于哺乳動物包括有袋目動物雄性Y染色體上，但它在動物Y染色體上的位置、大小、結(jié)構(gòu)都不盡相同。具有這種序列的染色體，在胚胎期能啟動雄性激素的合成，進(jìn)而促使性別朝雄性的方向分化，雄性的內(nèi)外器官開始發(fā)育，精巢形成后，又能不斷產(chǎn)生雄性激素，更進(jìn)一步促使雄性內(nèi)外器官的繼續(xù)發(fā)育[5]。利用SRY基因的檢測可以做到特異而快速地判定動物性別，正常情況下通過瓊脂糖凝膠電泳觀察，若為陽性（+）表明有SRY基因，則為雄性，反之則為雌性。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動物

中緬樹鼩（Tupaia belangeri）屬攀鼩目（Scandentia）樹鼩科（Tupaiidae），是一種型似松鼠的小型哺乳動物，為東洋界特有類群，從馬來西亞半島北部一直到中國南部均有分布，在我國主要分布于云南、貴州、四川、西藏東南部、廣西和海南等地[6]。中緬樹鼩由于進(jìn)化地位特殊，其系統(tǒng)分類地位一直備受爭議，當(dāng)前我國現(xiàn)生樹僅有中緬樹鼩一種。該動物常棲息于針闊混交林或闊葉林帶，主要是稀樹林緣灌木叢和次生林，在野外為雜食性動物[7]。由于在生理、生化方面與靈長類動物近似，加之生長繁殖周期短等已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的重要新模式動物，目前中緬樹鼩分類學(xué)、生理解剖學(xué)、寄生蟲學(xué)、新陳代謝、病毒學(xué)和腫瘤學(xué)都已經(jīng)進(jìn)行過深入細(xì)致的研究。

2.2 樣品采集

實(shí)驗(yàn)于2017年6～7月間在昆明市?？诹謭霾蓸?，采樣地位于昆明市西山區(qū)海口鎮(zhèn)北部，北緯24°47′～24°57′ ，東經(jīng)102°26′～102°51′，該地區(qū)所處亞熱帶低緯高原山地季風(fēng)氣候，由于受到印度洋西南暖濕氣流的影響，氣候溫暖干燥，無霜期為270 d以上，年均降雨量1450 mm，年平均氣溫15 ℃左右，該林場地理位置特殊，動植物資源豐富，分布著典型的亞熱帶常綠闊葉林，是中緬樹鼩生活的較佳環(huán)境。在采集為了避免了樣品污染，樣品采集時，佩戴一次性手套，盡量采集有光澤的新鮮糞便，采集到的糞便樣品立即裝入自封袋，并注明采集地的生境特點(diǎn)、采集時間等，同時用GPS定位。

2.3 DNA的提取

本研究共3次采集，最后共獲得103份中緬樹鼩糞便樣本。將樣品存放于低溫條件下并帶回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保存，利用糞便DNA提取試劑盒QIAamp DNA Stool Mini Kit 提取，具體步驟參照說明書。在操作前將糞便稍微放置-40 ℃超低溫冰箱讓其冰凍，盡量刮取糞便表皮部分提取中緬樹鼩基因組DNA。由于采集時間在6、7月份，氣溫較高加之糞便中DNA含量較少，經(jīng)過結(jié)合PCR擴(kuò)增和反復(fù)提取后共79份糞便中次抽提合格的DNA樣品。

2.4 PCR擴(kuò)增目的片段

根據(jù)GenBank中緬樹鼩SRY基因，利用Primer5.0軟件設(shè)計引物，引物均由昆明碩陽科技有限公司合成（表1）。擴(kuò)增中緬樹鼩Y染色SRY基因片段，而微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)的RCR擴(kuò)增進(jìn)行提取的DNA檢測，也是為了陰性對照，防止錯誤判別。PCR反應(yīng)總體積為25 μL，10×Buffer 2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 0.5 μL、20 μmol/L引物各1 μL、25 mmol/L MgCl2 1 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL、DNA模板1 μL，雙蒸補(bǔ)加到25 μL。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃預(yù)變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min（36個循環(huán)），72 ℃延伸5 min，4 ℃終止。

2.5 檢測

以獲得合格的DNA樣品76份為模板進(jìn)行微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)擴(kuò)增，繼而采用雙重PCR同時擴(kuò)增SRY基因和微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)，最后各取3μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過EB染色的0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察。

3 結(jié)果與分析

從圖1中可以看出，電泳結(jié)果顯示DNA條帶清晰明亮，PCR的結(jié)果較好，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的使用要求，也從圖中可以看出微衛(wèi)星DNA TBC4位點(diǎn)擴(kuò)增條帶為130 bp左右。

瓊脂糖凝膠電泳圖2顯示出條特異性擴(kuò)增帶，一條為130 bp左右，一條為600 bp左右，根據(jù)之前利用微衛(wèi)星DNA檢測中緬樹鼩糞便DNA的結(jié)果再參照眾多學(xué)者對林麝[8]、小麂[9]、綿羊[10]、牦牛[11]等動物的SRY基因研究，可以判定600 bp左右大小的條帶為SRY基因擴(kuò)增條帶。同一泳道出現(xiàn)130 bp 和600 bp兩條特異性擴(kuò)增帶判定為雄性，而泳道只出現(xiàn)一條130 bp條帶可以判定為雌性，79只中緬樹鼩中雌性有31只，雄性48只。

4 討論

中緬樹鼩DNA通過從糞便中提取出，利用的原理是野生動物的糞便中主要成分是一些未消化的食物殘渣，而這些殘渣在經(jīng)過腸道時會粘附上大量的腸道上皮細(xì)胞，利用PCR技術(shù)的高倍擴(kuò)增能力，可以從較少量的DNA中擴(kuò)增出目的片段進(jìn)行分析[12]。

20世紀(jì)90年代初期，糞便DNA技術(shù)建立之后就在動物生態(tài)學(xué)和保護(hù)遺傳學(xué)中被廣泛采用至今。但值得一提的是，糞便DNA的提取方法也不盡相同，當(dāng)前國內(nèi)外主要采用試劑盒提取（如美國Omega試劑，德國Qiangen試劑盒）、有機(jī)溶劑法、硫氰酸胍一二氧化硅法、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法等幾種方法。提取動物的DNA時，也根據(jù)采集糞便時的環(huán)境，糞便保存方法以及動物食性來加以選擇和適當(dāng)改進(jìn)[13]。SRY基因鑒定性別已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床診斷、產(chǎn)前診斷、法醫(yī)鑒定。生物學(xué)方面常用于野生動物的研究，糞便DNA對于外部性別鑒定特征缺失、反應(yīng)較敏捷、容易受驚嚇的動物性別鑒定和其他研究提供了快速可靠的途徑。

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Abstract： SYR gene is a sex-determining gene that exists in mammalian male Y chromosome. The detection of this gene can be done quickly and accurately. For this study， we obtained high quality fecal DNA from the stool of the tree shrews by molecular fecal methods. After simultaneous amplification of SRY gene and microsatellite DNA by double-PCR， the sex of the 77 tree shrews were identified by electrophoresis analysis.

Key words： Chinese-Burmese tree shrew； fecal DNA； SRY gene； sex identification