韓玉慶,許陽陽，董力慶，趙理樂，楊新宇

基于SWI檢測的大鼠腦微出血后血胱抑素C水平的變化分析

韓玉慶,許陽陽，董力慶，趙理樂，楊新宇

目的通過磁敏感加權(quán)成像(SWI)檢查，探討血胱抑素C水平在SHR大鼠腦微出血(cerebral microbleeds，CMBs)發(fā)生后的變化。方法30只SHR大鼠，隨機分為CMBs組和對照組，每組各15只。采用立體定向技術(shù)在腦實質(zhì)內(nèi)注入10 μl自體股動脈血制作CMBs大鼠模型；對照組大鼠予相同干預(yù)，但不進行注血。在造模前、后行SWI掃描檢查。在造模前、造模后3 h、6 h取自體股動脈血檢測胱抑素C水平；取血后用斷髓法處死大鼠取腦行病理學(xué)檢查。結(jié)果造模后CMBs組大鼠SWI檢查清晰地顯示腦部點狀血腫，與病理檢查結(jié)果吻合。造模前兩組血胱抑素C水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后3 h、6 h， CMBs組的血胱抑素C水平為(0.31±0.03)mg/dl、(0.36±0.05)mg/dl，明顯高于對照組的(0.10±0.03)mg/dl、(0.10±0.03)mg/d，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)。結(jié)論在大鼠發(fā)生CMBs后血胱抑素C水平逐步升高，與SWI及病理檢查結(jié)果相符合，可以作為CMBs的敏感生物學(xué)檢測指標(biāo)。

胱抑素C；腦微出血；SHR大鼠；磁敏感加權(quán)成像

腦微出血(cerebral microbleeds， CMBs)是多種危險因素損害血-腦屏障與神經(jīng)血管后，血液通過病變的微小血管壁漏出并被巨噬細胞吞噬，在血管周圍形成含鐵血黃素沉積的現(xiàn)象，其沒有明顯的臨床特征[1-2]。相關(guān)研究報道，通過磁共振磁敏感加權(quán)成像(SWI)掃描可大大提高CMBs的檢出率[3]。目前共識CMBs的出現(xiàn)會增加血管的出血傾向，對急性缺血性腦卒中患者的溶栓治療有重要的指導(dǎo)意義，很可能成為腦出血事件風(fēng)險增加的一個重要參考指標(biāo)[4-5]。本研究根據(jù)急性腦梗死發(fā)生后的溶栓治療時間窗窄，溶栓術(shù)后癥狀性出血致死率高這一問題，制作CMBs大鼠模型，用SWI掃描確定微出血灶，在造模前、后進行血胱抑素C(CysC)水平檢測；以探討CMBs發(fā)生后血胱抑素C水平變化的特點，為急性缺血性腦卒中患者早期干預(yù)治療提供更多的監(jiān)測指標(biāo)，減少癥狀性出血的發(fā)生率。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級10周齡SHR大鼠30只，雌雄各15只，體質(zhì)量350～400 g；隨機分為CMBs模型組(CMBs組)和對照組，每組15只。

1.2 CMBs模型制作 參照文獻方法制作CMBs大鼠模型[6]。大鼠制模前8 h禁食水，用10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔注射麻醉，于股動脈置留置針(取血)。用耳桿將麻醉后大鼠固定在立體定向儀(瑞沃德公司)上，剪除頭部術(shù)區(qū)鼠毛，消毒后于中線旁切開皮膚約5 mm，于前卥門右側(cè)3 mm、向前1 mm處用微型磨鉆鉆1 mm骨孔1個，不損傷硬腦膜，用微量注射器抽取自體股動脈血10 μl沿此點緩慢垂直刺入腦組織，深度為3 mm，勻速緩慢注射，30 s注血完畢，保留穿刺針1 min后，小心緩慢退針，使用骨蠟封閉骨孔，用6-0絲線縫合切口。對照組大鼠前面干預(yù)步驟相同，但不進行腦組織注血。

1.3 血胱抑素C水平檢測 使用大鼠胱抑素C ELISA試劑盒。于術(shù)前、術(shù)后3 h、6 h經(jīng)大鼠股動脈抽血，用3.2%檸檬酸鈉抗凝，混合30 min，以3 000 r/min 離心20 min；收集上清液，使用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中胱抑素C水平。再使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算標(biāo)本中胱抑素C濃度。

1.4 MR檢查 在大鼠造模前、后采用西門子 1.5 T磁共振機，進行SWI和T1WI、T2WI序列掃描。用手腕線圈將麻醉大鼠俯臥包裹于線圈中，用3D掃描定位鼠腦坐標(biāo)。調(diào)整參數(shù)為：TE 20 ms，TR 29 ms，矩陣256×256，F(xiàn)OV 70 mm×70 mm，層厚0.6 mm，層間距0.12 mm，層數(shù)20，翻轉(zhuǎn)角15°。

2 結(jié) 果

2.1 造模前后MRI檢查 造模前CMBs組大鼠MRI各序列掃描未見異常信號。造模后MRI檢查，T1WI及T2WI未見異常信號，但SWI上出現(xiàn)點灶狀短信號(圖1)，證實CMBs模型制作成功。

A：造模前SWI，未見異常信號； B：T1WI;C：T2WI，未見異常信號； D：造模后SWI，表現(xiàn)為點灶狀短信號圖1 造模前后MRI檢查

2.2 兩組大鼠造模前后血胱抑素C水平比較 見表1。CMBs組造模前、造模后3 h、6 h血胱抑素C水平逐步升高，3個時間點之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=208.745，P=0.000)。對照組造模前、造模后3 h、6 h血胱抑素C水平之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.244，P=0.299)。CMBs組與對照組造模前血胱抑素C水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.541)；CMBs組造模后3 h、 6 h的血胱抑素C水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)。

表1 兩組大鼠造模前、后血清胱抑素C水平的比較

2.3 病理學(xué)檢查 造模后6 h取血后，將CMBs組大鼠用斷髓法處死取腦行病理學(xué)檢查。結(jié)果顯示，腦組織內(nèi)有出血病灶(圖2)與SWI掃描的影像學(xué)特征相吻合。

圖2 通過普魯士藍染色顯示微出血病灶，與影像學(xué)檢查符合

3 討 論

CMBs屬于腦小血管病變的一種，局限于皮質(zhì)區(qū)的CMBs主要與淀粉樣血管病(cerebral amyloid angiopath, CAA)相關(guān)；深部的CMBs與高血壓或動脈粥樣硬化有關(guān)[7]。腦內(nèi)的實質(zhì)小動脈、微動脈、小靜脈、毛細血管是其主要靶點，由于各種病因致使小動脈粥樣硬化、脂質(zhì)透明樣變性和淀粉樣變性等病理變化，最終導(dǎo)致CMBs。其具體病理機制目前尚不確定，包括內(nèi)皮激活、炎癥機制、局部腦血流量失調(diào)以及血-腦屏障破壞等假說[8]。

目前臨床主要通過磁共振SWI掃描進行CMBs檢查，可明顯提高檢出率。與其他磁共振檢查序列不同，SWI比T2WI能夠更清晰地發(fā)現(xiàn)出血后含鐵病灶的變化[9-10]，可以明顯增強圖像的對比和組織間的磁敏感的差異。本研究中，造模后腦組織內(nèi)微出血在SWI上呈類圓形小灶，邊界清楚，而在T1WI和T2WI上邊界模糊不清，不易分辨。

研究表明，25%～70%的缺血性腦卒中患者都存在腦部微出血的現(xiàn)象[11]。合并CMBs的急性缺血性腦卒中患者接受溶栓治療后，出現(xiàn)癥狀性顱內(nèi)出血的概率很高，時間窗內(nèi)接受溶栓治療后出現(xiàn)癥狀性顱內(nèi)出血的概率如何，目前尚無客觀的臨床觀察指標(biāo)。本研究通過對SHR大鼠模型血清胱抑素C的研究，來證實其與CMBs發(fā)生的相關(guān)機制，進而增加客觀的溶栓后癥狀性出血概率判定指標(biāo)。

研究發(fā)現(xiàn)大腦與腎臟的小血管病變存在密切相關(guān)性，通過解剖及血管調(diào)節(jié)機制，包括高灌注壓，終末低阻力血管結(jié)構(gòu)和一氧化氮在維持腎小球或腦穿通動脈微循環(huán)的作用方面都有相似之處。還有報道發(fā)現(xiàn)，腎功能不全與腦卒中發(fā)生CMBs的患者之間可能存在著密切的關(guān)系[12-13]?？紤]到這方面，一個適當(dāng)?shù)闹笜?biāo)可能會反映大腦和腎臟的小血管病變的嚴(yán)重程度；而以往對CMBs的研究大多基于傳統(tǒng)定義的腎功能不全(肌酐，腎小球濾過率，尿微量白蛋白等)。

胱抑素C廣泛存在于細胞外液中，是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，參與細胞外基質(zhì)產(chǎn)生和降解的動態(tài)平衡。當(dāng)胱抑素C水平減低，對組織蛋白酶活性的抑制就會減弱，導(dǎo)致蛋白酶活性增加，最終造成病理損害；隨之會釋放大量炎癥因子，誘導(dǎo)多種組織蛋白酶的大量增加，組織蛋白酶抑制劑進而增加，導(dǎo)致胱抑素C水平增高，促使蛋白酶和其抑制劑達到平衡[14]。

胱抑素C只通過腎臟代謝，幾乎完全被腎小球濾過，再由腎小管重吸收，最終在腎小管細胞中完全代謝，不再參與血液循環(huán)。其具有維持血管壁正常生理的功能，與心腦血管病的關(guān)系密切。有研究證實，腎臟小血管損害和腦小血管病存在著共同的病理基礎(chǔ)，由于胱抑素C參與了炎性反應(yīng)過程，那么炎性因素可能是皮質(zhì)區(qū)及深部CMBs存在的相對獨立的危險因素。另一方面由于胱抑素C水平與動脈粥樣硬化性疾病密切相關(guān)，其可能會通過影響動脈粥樣硬化的過程及程度，間接反映CMBs的存在[15]。Spearman等研究顯示，血胱抑素C水平與CMBs的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)；表明血清胱抑素C水平越高，CMBs病灶可能越多[5]。本研究結(jié)果顯示，造模前兩組大鼠血清胱抑素C水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；造模后3 h、6 h CMBs組血清CysC水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)；且伴隨著出血時間的延長，血胱抑素C水平呈逐漸升高趨勢?？梢婋滓炙谻對CMBs有較好的診斷價值，獨立于常見的危險因素，血胱抑素C水平是診斷CMBs很好的生物標(biāo)志物。

綜上所述，胱抑素C有望成為急性缺血性腦卒中溶栓治療前是否存在CMBs篩查的生物學(xué)標(biāo)志物之一；用于提高溶栓后可能發(fā)生癥狀性出血患者的篩查效率，可更敏感、更準(zhǔn)確地反映溶栓后的病情變化。

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MechanismanalysisofcorrelationbetweencystatinCandbrainmicrohemorrhageinratsbasedonSWI

HANYu-qing，XUYang-yang，DONGLi-qing，etal.

DepartmentofNeurosurgery,TianjinMedicalUniversityGeneralHospital,Tianjin300052,China

Correspondingauther:YANGXin-yu

ObjectiveThe changes of cystatin C levels in brain hemorrhage of SHR rats were investigated by SWI sequence analysis.Methods30 SHR rats underwent autologous femoral artery cystatin C blood test and SWI scanning before modeling.15 in the trial group,10μl autologous arterial blood were injected in the brain parenchyma by stereotary and again underwent SWI scanning,15 in the control group were given the same intervention,but without blood injection. Femoral artery blood cystatin C level were analyzed 3 h and 6 h after modeling,and the rats were treated with marrow breaking for brain pathology.ResultsBefore modeling,the level of cystatin C in the observation group was (0.08±0.03) mg/dl.After modeling,the hematoma can be clearly detected by SWI,and it is consistent with the pathological findings.After 3 hours,the level of cystatin C in the observation group was (0.31±0.03) mg/dl,and that of the control group was (0.10±0.03) mg/dl.The cystatin C level in the 6 hour observation group was (0.36±0.05) mg/dl,and the control group was (0.10±0.03) mg/d.P<0.01.ConclusionCystatin C level micro hemorrhage in the brain of SHR rats is increased,consistent with the results of SWI and pathological results,can be used as SHR of rat brain microvascular hemorrhage sensitive index.

cystatin C；cerebral hemorrhage；SHR rats；SWI

300052天津，天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科(韓玉慶，楊新宇)；天津市西青醫(yī)院神經(jīng)外科(許陽陽，董力慶，趙理樂)

楊新宇

10.3969/j.issn.1672-7770.2017.06.003

R743.3

A

1672-7770(2017)06-0413-04

(收稿2017-04-23 修回2017-09-10)