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(西安市第九醫(yī)院老年病一科,陜西西安 710054)

·慢性阻塞性肺病專題·

慢性阻塞性肺疾病患者和肽素、高遷移率族蛋白1水平變化及其臨床意義

黃馨諒，白跳，崔瑩雪，邵亞婷*

(西安市第九醫(yī)院老年病一科,陜西西安 710054)

目的探討慢性阻塞性肺疾病患者(COPD)中和肽素(Copeptin)、高遷移率族蛋白1(HMGB1)水平變化及其臨床意義。方法72例COPD患者，按病情分為輕度組(n=15)、中度組(n=28)、重度組(n=29)。分析各組患者Copeptin、HMGB1水平變化。結(jié)果隨著病情由輕到重，患者血清Copeptin、HMGB1、白介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平和肺組織HMGB1 mRNA及其蛋白水平依次均顯著升高。重度組患者住院天數(shù)均長于輕度、中度組。急性加重期患者血清Copeptin水平與住院天數(shù)呈正相關(guān)。結(jié)論COPD 患者的嚴(yán)重程度和Copeptin及HMGB1表達(dá)水平呈正相關(guān)， Copeptin及HMGB1表達(dá)水平均可作為臨床上評價(jià)COPD 的嚴(yán)重程度的生物學(xué)指標(biāo)。

慢性阻塞性肺疾??； 和肽素； 高遷移率族蛋白1； 白介素-1β； 腫瘤壞死因子-α

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是臨床呼吸道重癥疾病之一。持續(xù)存在的氣流受限是COPD的只要特點(diǎn)，并且與氣道慢性炎癥反應(yīng)的增高密切相關(guān)。目前大量研究表明，C 反應(yīng)蛋白、降鈣素原、血管升壓素是COPD的非特異性生物學(xué)標(biāo)志物，即在COPD 急性加重期時(shí)，上述生物學(xué)指標(biāo)水平均明顯升高，與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[1-2]。和肽素(Copeptin)由39個氨基酸組成一種急性期時(shí)相蛋白，是精氨酸加壓素(AVP)原的部分肽段，可由神經(jīng)垂體分泌。正常人體中AVP含量極低，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)感染、低血壓等癥狀后可促使下丘腦分泌AVP增加。研究發(fā)現(xiàn)，大多心肺血管病患者血液中的AVP水平均明顯升高，且和疾病程度呈正相關(guān)。然而，AVP的生物活性不穩(wěn)定，難以測定，而Copeptin在體內(nèi)表現(xiàn)比AVP更加穩(wěn)定，無酶切位點(diǎn)和受體，在體內(nèi)很少降解，可直接測定來反映AVP水平，因此，和肽素可作為一種新型的生物學(xué)標(biāo)志物來診斷COPD[3-4]。近年有研究報(bào)道，高遷移率族蛋白1(High mobility group box-1 protein，HMGB1)在COPD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[5]。HMGB1作為內(nèi)毒素血癥和膿毒癥的晚期炎癥介質(zhì)，參與多種生理學(xué)進(jìn)程，當(dāng)其被釋放到細(xì)胞外后，可作為細(xì)胞因子參與氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大。因此，HMGB1可作為致炎細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的中心環(huán)節(jié)，同時(shí)具有級聯(lián)放大以及調(diào)節(jié)其他炎癥因子分泌的功能，有研究亦提示HMGB1可能參與了COPD的發(fā)生和發(fā)展的過程[6]。本研究旨在探討COPD 嚴(yán)重程度與Copeptin、 HMGB1在COPD發(fā)病過程中的水平變化情況，揭示HMGB1在COPD發(fā)病機(jī)制中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料選擇2015年1月～2016年10月于我院就診的72例COPD患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：參照2007年《慢性阻塞性肺疾病診治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確診為COPD患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并慢性感染性疾病、心肺功能障礙、惡性腫瘤者或者其他重大疾病患者；合并心理疾病、精神疾病患者。根據(jù)COPD 綜合評估按病情由輕至重分為三組：輕度組(n=15) 、中度組(n=28) 、重度組(n=29)。輕度組15例，年齡19～53(41.8±3.5)歲；病程1.5～13(5.8±1.8)年。中度組28例，年齡20～53(41.8±3.5)歲；病程1.5～14(5.8±1.8)年。重度組29例，年齡19～54(41.8±3.5)歲；病程1.6～13(5.8±1.8)年。各組年齡、病程比較無明顯差異，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，資料具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者自愿簽署知情同意書。

1.2主要儀器與試劑ABI 7300 熒光定量PCR儀(型號：ABI 7300，上海普迪生物技術(shù)有限公司)； EL204 梅特勒電子天平(型號：EL204，廠家：鄭州南北儀器設(shè)備有限公司)；高遷移率族蛋白1(High mobility group protein 1，HMGB1)和GAPDH(內(nèi)參)一抗均購自Cell Signaling Technology公司；二抗購自碧云天公司。

1.3 ELISA法檢測指標(biāo)采用ELISA試劑盒檢測血清Copeptin、HMGB1，IL-1β和TNF-α水平，所有試劑盒均購自南京建成生物研究所。按照試劑盒操作嚴(yán)格進(jìn)行測定。

1.4熒光定量PCR 采用Trizol方法提取肺組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA純度和濃度后，取2μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，生成cDNA。采用SYBR green染料法進(jìn)行定量檢測，利用Q-PCR儀設(shè)置95 ℃ 10 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個循環(huán)，每個循環(huán)記錄一次CT值，根據(jù)2-ΔΔt計(jì)算HMGB1及GAPDHd的mRNA表達(dá)情況。HMGB1及GAPDH(內(nèi)參)引物信息如下：

HMGB1：上游引物 (5′-3′) CATGGATCAGAAACTCAGCAAAGTC

下游引物 (5′-3′) CATGCCATGCCTTGTCTTTGCCTGC

GAPDH：上游引物 (5′-3′) CCTAGTTCGTCATGGGTGTGAACCA

下游引物 (5′-3′) GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC

1.5蛋白印跡(Western blot) 常規(guī)方法提取組織總蛋白，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)方法測定蛋白質(zhì)含量后，進(jìn)行凝膠電泳，每孔上樣20 μg，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯薄膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上后，3%的脫脂奶封閉2 h，分布孵育HMGB1和GAPDH一抗，4 ℃孵育一抗過夜，接著進(jìn)行TBST洗膜，最后孵育二抗并進(jìn)行顯影。采用Quantityone軟件對條帶亮度進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1患者急性加重期與緩解期血清Copeptin水平與輕度組比較，中度，重度組患者急性加重期和緩解期的血清和肽素水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；與中度組比較，重度組患者急性加重期和緩解期的血清Copeptin水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；與緩解期比較，中度、重度組患者急性加重期血清Copeptin水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體見表1。

表1 急性加重期與緩解期血清Copeptin水平(pmol /L)

與輕度組比較，a：P<0.05；與中度組比較，b：P< 0.05；與緩解期期比較，c：P<0.05

2.2比較各組患者住院天數(shù)情況重度組患者住院天數(shù)均長于輕度、中度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，具體見表2。

表2 各組患者住院天數(shù)

與輕度組比較，a：P<0.05；與中度組比較，b：P<0.05

2.3血清Copeptin水平與住院天數(shù)的相關(guān)分析急性加重期患者血清Copeptin水平與住院天數(shù)呈正相關(guān)(r=0.617，P<0.01) ，具體見圖1。

圖1

2.4各組患者血清HMGB1、IL-1β和TNF-α水平與輕度組比較，中度，重度組患者血清HMGB1、IL-1β和TNF-α水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；與中度組比較，重度組患者血清HMGB1、IL-1β和TNF-α水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。具體見表3。

表3 各組患者血清HMGB1、IL-1β和TNF-α水平

與輕度組比較，a：P<0.05；與中度組比較，b：P<0.05

2.5各組患者肺組織HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平RT-PCR和Western blot法檢測各組患者肺組織HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，與輕度組比較，中度，重度組患者肺組織HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；與中度組比較，重度組患者肺組織HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；具體見表4和圖2。

表4 肺組織HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平變化

與輕度組比較，a：P<0.05；與中度組比較，b：P<0.05

圖2 HMGB1蛋白表達(dá)水平變化

3 討 論

目前COPD患者急性加重期時(shí)不能完成肺功能全面檢查，臨床上關(guān)于COPD疾病嚴(yán)重程度的診斷主要是依靠患者呼吸困難、咳嗽、咳痰等臨床癥狀的加重，故需要一個客觀指標(biāo)來評價(jià)COPD嚴(yán)重程度尤為重要。C反應(yīng)蛋白、降鈣素原、血管升壓素是COPD的非特異性生物學(xué)標(biāo)志物。有研究[7]對接受糖皮質(zhì)激素治療的急性加重期COPD患者血清C反應(yīng)蛋白、Copeptin兩項(xiàng)生物標(biāo)志物水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，C反應(yīng)蛋白水平變化的波動和范圍較大，C反應(yīng)蛋白水平不僅與COPD患者疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)，且還易受到糖皮質(zhì)激素等藥物的影響，而Copeptin水平的變化與這些藥物的使用無關(guān)，僅與COPD 患者疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)，故Copeptin在體內(nèi)表現(xiàn)出更為穩(wěn)定的生物活性，檢測方法更為快捷簡便，亦更能反應(yīng)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)程度和疾病的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果表明，隨著與COPD 患者疾病嚴(yán)重程度增加，患者血清Copeptin水平亦隨著升高，提示COPD 患者的嚴(yán)重程度和Copeptin水平呈正相關(guān)。與緩解期比較，中度、重度組患者急性加重期血清Copeptin水平均升高，可能是由于在急性加重期，患者下呼吸道感染產(chǎn)生的炎癥因子，細(xì)胞因子的刺激所致。重度組患者住院天數(shù)均長于輕度、中度組，急性加重期患者血清Copeptin水平與住院天數(shù)呈正相關(guān)(r=0.618，P<0.05)，提示Copeptin水平升高可引起住院時(shí)間延長，提示疾病的預(yù)后不理想。綜上可知，COPD 患者的嚴(yán)重程度和Copeptin水平呈正相關(guān)，Copeptin有望成為評價(jià)COPD 的嚴(yán)重程度的生物學(xué)指標(biāo)。

目前關(guān)于COPD的確切發(fā)病機(jī)制有多種假說，如蛋白酶和抗蛋白酶假說，免疫失衡假說，感染假說，氧化損傷假說及炎癥假說等[8]。其中，炎癥假說在COPD發(fā)生發(fā)展的機(jī)制一直備受學(xué)術(shù)研究者的重視。HMGB1由Johns在20 世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的一種急性期時(shí)相蛋白，因其在聚丙烯酚胺凝膠電泳中有很高的遷移率而得此名，隨著HMGB1的發(fā)現(xiàn)，越來越多的學(xué)者對HMGB1進(jìn)行研究[9-11]，結(jié)果表明，HMGB1在炎癥反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中可能作為一個中心環(huán)節(jié)，不僅自身的分泌有級聯(lián)放大效應(yīng)，而且還可以促進(jìn)IL-1β、TNF-α等其他炎癥因子的分泌。有報(bào)道[11]HMGB1在自身免疫性疾病等炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著非常重要的作用。本研究結(jié)果表明，隨著與COPD 患者疾病嚴(yán)重程度增加，患者血清和肺組織中HMGB1基因和蛋白表達(dá)水平亦隨著升高，提示COPD 患者的嚴(yán)重程度和HMGB1表達(dá)水平呈正相關(guān)。同時(shí)，隨著患者血清中HMGB1基因和蛋白表達(dá)水平升高，血清炎癥因子IL-1β和TNF-α水平亦隨著升高，提示HMGB1有可能作為炎癥因子在COPD 發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

綜上所述，COPD 患者的嚴(yán)重程度和Copeptin及HMGB1水平呈正相關(guān)，因此均可作為臨床上評價(jià)COPD 的嚴(yán)重程度的生物學(xué)指標(biāo)。

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ClinicalsignificanceofCopeptinandHMGB1inpatientswithchronicobstructivepulmonarydisease

HUANG Xinliang,BAI Tiao,CUI Yingxue,et al

(DepartmentofGeriatrics，NinthHospitalofXi’an，Xi’an,Shaanxi710054，China)

ObjectiveTo evaluate the clinical significance of Copeptin and HMGB1 in patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD).Methods72 patients with COPD in our hospital were analyzed,and divided into mild group (n=15),moderate group (n= 28),severe group (n= 29) according to COPD comprehensive evaluation by the disease from mild to severe.The levels of Copeptin and HMGB1 and the clinical significance of them in patients with COPD were evaluated.ResultsThe levels of serum Copeptin,HMGB1,IL-1β,TNF-α,tissue HMGB1 mRNA and protein were elevated with degree of COPD.Hospitalization days in severe group were statistically significantly longer than those of mild,moderate groups.The Copeptin levels and hospitalization days among patients with acute exacerbation had positive correlation.ConclusionThe severity of COPD was positively related to the levels of Copeptin and HMGB1.Therefore,which can be used as a biological indicator to evaluate the severity of COPD in clinic.

chronic obstructive pulmonary disease; copeptin; HMGB1; IL-1β; TNF-α

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.06.004

專題主持人——邵長周主任醫(yī)師

2017-03-24；

2017-09-29

*通訊作者，E-mail：smcv8922@163.com.

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