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(1.南華大學腫瘤研究所,湖南省胃癌研究中心，湖南省高校腫瘤細胞與分子病理學重點實驗室，湖南 衡陽 421001；2.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術學院內科學教研室；3.南華大學附屬第二醫(yī)院病理科)

·基礎醫(yī)學·

PTEN蛋白在胃癌中的表達及臨床病理意義

羅文1,2，周娟1#，夏紅1，蘇堅1,3，劉芳1，湯歡1，蘇琦1*

(1.南華大學腫瘤研究所,湖南省胃癌研究中心，湖南省高校腫瘤細胞與分子病理學重點實驗室，湖南 衡陽 421001；2.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術學院內科學教研室；3.南華大學附屬第二醫(yī)院病理科)

目的研究10號染色體缺失的張力蛋白同源磷酸酶基因(PTEN)蛋白在胃癌中的表達與臨床病理的關系，為尋找胃癌腫瘤標記物提供一定的實驗依據。方法應用組織芯片及免疫組化方法檢測140例胃癌組織、54例癌旁胃黏膜組織與64例正常胃黏膜組織中PTEN的表達情況，研究PTEN與胃癌發(fā)生發(fā)展的關系。結果PTEN蛋白在正常組織表達85.94%(55/64)明顯高于癌前病變51.85%(28/54)與胃癌20.71%(29/140)(P<0.05)，而癌前病變表達顯著高于胃癌(P<0.05)。PTEN在高分化、中分化、低分化腺癌、黏液癌與印戒細胞癌分別表達44.83%(13/29)、26.08%(6/23)、14.58%(7/48)、7.40%(2/27)與7.69%(1/13)，各組間差異具有顯著性(P<0.05)。PTEN在淋巴結轉移組表達11.53%(12/104)明顯低于無淋巴結轉移組47.22%(17/36)(P<0.05)。在Ⅰ+Ⅱ期表達38.30%(18/47)明顯高于Ⅲ+Ⅳ期11.83%(11/93)(P<0.05)。結論PTEN蛋白下調與胃癌的發(fā)生、分化程度、淋巴結轉移和臨床分期有關。

胃癌； PTEN； 組織芯片； 免疫組織化學

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，每年全世界新發(fā)病例約95.16萬，死亡約72.31萬，發(fā)生率與死亡率分別為全球第四位與第二位[1]。據2015年流行病學最新統計，胃癌在我國每年約新發(fā)67.9萬和死亡49.8萬人，發(fā)生率與死亡率位于第二。由于患者就診時大多已發(fā)生侵襲轉移，5年生存率低于10%[2-3]。因此，研究胃癌侵襲轉移機制，尋找診斷標志與治療靶點具有重要的意義。

眾所周知，10號染色體缺失的張力蛋白同源磷酸酶基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten，PTEN)是抑癌基因，在胃癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、頭頸部癌與口腔癌等多種腫瘤中表達缺失或低表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[4-11]。本文采用組織芯片與免疫組化研究PTEN蛋白在胃癌中表達與臨床病理的關系。

1 材料與方法

1.1病例資料從南華大學附屬湘潭醫(yī)院存檔石蠟塊獲取胃癌140例及癌旁組織54例，另取距離腫瘤邊緣>5 cm處的正常胃黏膜上皮64例作為對照。每例均有明確臨床背景資料和病理組織學切片診斷支持，對每一組織標本，均先觀察HE切片以確定并標記出癌組織、癌旁組織及正常組織部位，制作組織芯片。140例胃癌標本中，男性97例，女性43例，年齡40～74歲，平均年齡56.7歲。按WHO病理組織學分類[12]，高分化腺癌29例，中分化腺癌23例，低分化腺癌48例，黏液癌27例，印戒細胞癌13例。

1.2免疫組化染色PTEN(#9188)抗體購自Cell Signaling公司，二步法SP通用試劑盒購自福州邁新生物技術公司。按照試劑盒的說明進行SP染色，步驟具體如下：切片放入68 ℃烤箱內烘烤20 min；切片常規(guī)二甲苯脫蠟、酒精梯度脫水；沖水20 min；PBS清洗3次，每次5 min；抗原修復；PBS清洗3次，每次5 min；加入3%H2O2室溫37 ℃靜置10 min，用于滅活內源性過氧化物酶；PBS清洗3次，每次5 min；甩干PBS，滴加一抗，濕盒內孵育1 h；PBS清洗3次，每次5 min；去除PBS，滴加50 μL試劑A(聚合物增強劑)，室溫靜置10 min；PBS清洗3次，每次5 min；滴加50 μL試劑B(酶標抗鼠/兔聚合物)，室溫靜置10 min；PBS清洗3次，每次5 min；滴加50 μL試劑C(鏈霉親和素—過氧化物酶)，靜置10 min；PBS清洗3次，每次5 min；清除PBS，滴加50 μL DAB顯色液，鏡下掌握顯色程度；自來水充分沖洗；蘇木素復染1 min，PBS液返藍5 min，最后脫水、透明、封片。

1.3結果判定根據文獻[12]，陽性細胞染色程度及著色細胞百分率進行記分：0分不著色，1分淺棕色，2分深棕色；著色細胞<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分；>50%為3分。兩種分值相加，1分為(-)；2分為弱陽性(+)；其中2～3分為陽性(++)；4～6分為強陽性(+++)。(++)～(+++)判為陽性，(-)～(+)判為陰性。PTEN蛋白陽性表達為棕黃或棕褐色顆粒，定位于胞漿或胞核。

1.4統計學分析實驗結果應用SPSS軟件實施統計學分析，采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 PTEN蛋白在胃癌組織中的表達PTEN在正常組織上皮明顯呈陽性表達，在胃癌組織及癌前病變中呈陰性或部分陽性表達。PTEN在正常組織表達85.94%(55/64)明顯高于癌前病變51.85%(28/54)與胃癌20.71%(29/140)(P<0.05)，而在癌前病變表達顯著高于胃癌(P<0.05)(表1，圖1)。

表1 PTEN表達與胃癌臨床病理的關系

a：與正常組織比較；b：與癌前病變比較；c：與高中分化比較；d：與腺癌比較；e：與無轉移比較；f：與Ⅰ+Ⅱ期比較

2.2 PTEN表達與臨床胃癌病理指標的關系表1所示，PTEN蛋白在高分化、中分化、低分化腺癌的表達率分別為44.83%(13/29)、26.08%(6/23)、14.58%(7/48)，經χ2檢驗各組間差異具有顯著性(P<0.05)，并且明顯高于黏液癌7.40%(2/27)與印戒細胞癌7.69%(1/13)。PTEN蛋白在淋巴結轉移組11.53%(12/104)明顯低于無淋巴結轉移組47.22%(17/36) (P<0.01)。PTEN在Ⅰ+Ⅱ期表達38.30%(18/47)明顯高于Ⅲ+Ⅳ期11.83%(11/93) (P<0.01)。男性表達20.61%(20/97)與女性表達間20.93%(9/43)差異無顯著性(P>0.05)。

圖1 PTEN在胃癌組織中表達(SP400×)A:正常組織;B:腸化;C:高分化;D:中分化;E:低分化;F:黏液癌

3 討 論

PTEN抑癌基因又稱為MMAC1(mutated in multiple advanced cancer 1)和TEP1(TGF-regulated and epithelial cell -enriched phosphatase)。PTEN基因位于染色體10q23.3，由9個外顯子組成，編碼由403個氨基酸組成的蛋白質，具有磷酸酯酶的活性，PTEN蛋白可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。

研究顯示，PTEN在肺鱗狀細胞癌低表達與惡性程度和淋巴結轉移有關，因此，PTEN表達缺失可作為評估惡性與獨立的預后因子[6]。PTEN高表達的NSCLC患者平均生存12.9月較低表達患者生存17.1月具有明顯差異。PTEN高表達在肺腺癌平均生存23.50月較低表達患者生存15.54月具有明顯差異，并且減少43%的危險。PTEN表達在T1/T2明顯高于T3/T4，而肺腺癌明顯高于肺鱗狀細胞癌，表明PTEN表達可能是NSCLC患者預后良好的標志[7]。PTEN在360例乳腺癌中低表達，PTEN啟動子存在39.44%甲基化，而45.56%PTEN表達下調，兩者具有顯著相關性，并與惡性程度有關，表明PTEN啟動子甲基化是PTEN表達缺失的機制，PTEN甲基化和表達缺失可能成為乳腺癌的危險判斷的標志[8]。PTEN在前列腺癌中低表達，采用免疫組化與FISH 檢測PTEN 基因缺失顯示，731例前列腺癌中，免疫組化與FISH 的特異性為91%(FISH檢測602例PTEN 基因缺失，免疫組化549例表達缺失)，敏感性為97%(67例純合子缺失中免疫組化65例表達缺失)。因此，免疫組化篩選對鑒定PTEN 基因純合子缺失是顯著有益的[9]。研究表明，PTEN 在胰腺癌中表達低于正常組織，與組織學分級、臨床分期和淋巴結轉移明顯相關[10]。25.0%的壺腹癌PTEN表達缺失與淋巴結轉移、臨床分期、高頻率復發(fā)和更短生存率相關，是外科手術治療后重要的預后因子[11]。PTEN在頭頸部癌表達下調，與增殖標記Ki-67、臨床分期和分級呈負相關[12]。

在胃癌中，Zhu等采用組織芯片與免疫組化檢測159例胃癌與151例非胃癌組織顯示，PTEN在62%胃癌組織表達較非胃癌組織明顯下調，PTEN表達缺失與組織學類型和臨床分期密切相關，表明PTEN可作為胃癌診斷的標志[4]。Kim等顯示，PTEN在438例胃癌中20.3%表達降低，可能成為臨床治療靶點[13]。Zhang等采用FISH與免疫組化檢測胃癌患者腫瘤細胞移植SCID小鼠的移植瘤中，發(fā)現66%的移植瘤中PTEN表達缺失[14]。研究表明，PTEN在胃癌低表達，與腫瘤大小和淋巴結轉移密切相關，相反，PI3K、AKT、p-AKT、p-mTOR等在胃癌中高表達，表明PI3K/AKT/mTOR通路在胃癌中活化，可能是特異性靶向治療胃癌的靶點[15]。免疫組化檢測亞洲胃癌患者顯示，PTEN 異常表達與腫瘤大小、分化程度、臨床分期、侵襲、淋巴結轉移、遠距離轉移和血管侵襲有關，提示免疫組化檢測PTEN可預告侵襲與轉移[16]。Zhang 等研究表明，HER2抑制劑trastuzuma與lapatinib是治療胃癌的最佳靶向藥物，但是，PTEN表達缺失是對trastuzuma或lapatinib治療胃癌患者早期抗藥性的重要預兆標志。因此，治療前檢測胃癌患者PTEN是否存在缺失，必須對缺失患者調整治療方案，顯然，進一步研發(fā)治療胃癌的藥物是今后研究的重點[17]。

本文結果顯示，PTEN蛋白在85.94%正常胃黏膜組織上皮呈陽性表達，明顯高于癌前病變51.85%與胃癌20.71%，且在癌前病變表達顯著高于胃癌，表明PTEN低表達與胃癌發(fā)生有關。并且，PTEN蛋白在高分化、中分化、低分化腺癌、黏液癌與印戒細胞癌的表達率分別為44.83%、26.08%、14.58%，7.40% 與7.69%，各組間差異具有顯著性，表明PTEN低表達與胃癌分化程度相關。PTEN表達在淋巴結轉移組11.53%明顯低于無淋巴結轉移組47.22%。PTEN在Ⅰ+Ⅱ期表達38.30%明顯高于Ⅲ+Ⅳ期11.83%，表明PTEN低表達與淋巴結轉移和臨床分期顯著相關。綜上所述，PTEN低表達與胃癌發(fā)生、分化程度、淋巴結轉移和臨床分期明顯有關，可能是胃癌診斷與預后判斷的重要標志，本研究結果與國內外報告一致。

DJ-1(Parkinson’s disease-associated protein 7，PARK7)是癌基因，也是PTEN的重要負調控蛋白，在胃癌發(fā)生發(fā)展起著重要作用。LI等發(fā)現，DJ-1蛋白在66.7%胃癌高表達與腫瘤侵襲深度、淋巴結轉移、遠距離轉移和臨床分期有關。而PTEN在58.7%的胃癌表達下調與臨床分期和DJ-1高表達相關。并且， DJ-1高表達和PTEN低表達與胃癌患者不良預后顯著相關，可能成為胃癌患者預后的重要因子[18]。因此，研發(fā)抑制DJ-1表達和促進PTEN表達的治療胃癌藥物將是今后的新策略[17]。近來，采用蛋白質組學技術鑒定二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)誘導白血病分化的差異蛋白質中，發(fā)現DJ-1蛋白表達明顯下調[19]。然而，DADS是否可通過下調DJ-1上調PTEN抑制胃癌細胞增殖與遷移侵襲，尚待進一步研究。

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ExpressionofPTENingastriccancerandclinicalpathologicalsignificance

LUO Wen,ZHOU Juan,XIA Hong,et al

(CancerResearchInstitute，CenterforGastricCancerResearchofHunanProvince,KeyLaboratoryofCancerCellulalandMoleculayPathologyofHunan,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo investigate the expression of PTEN protein in gastric cancer and clinical pathological significance.MethodsTissue microarray technique and SP Immunohistochemistry method were applied to detect PTEN protein expression in the 140 cases of gastric cancer,the 54 cases of tissue nearby and 64 cases matched non-cancer mucosa and evaluate the influence of abnormal expression of PTEN protein for carcinogenesis and progression of gastric cancer.ResultsImmunohistochemistry results revealed that the positive rates of PTEN protein expression in matched non-cancer mucosa,tissue nearby and gastric cancer were 83.36% (19/22),56.25% (27/48) and 24.44% (22/90),respectively.The PTEN protein positive expression in gastric cancer were significantly lower than those matched non-cancer mucosa and the tissue nearby (P<0.05).The positive rates of PTEN expression were 44.83% (13/29) in well differentiated,26.08% (6/23) in moderate differentiated,14.58% (7/48) in poorly differentiated,7.40% (2/27) in mucinous cancer and 7.69% (1/13) in signet ring cell cancer,respectively,and the positive expression rates of PTEN between distinct degree of differentiation were significantly different in gastric cancer (P<0.05).ConclusionThe down-regulation of PTEN protein was concerned with carcinogenesis,degree of differentiation,lymphatic metabasis and clinical stage in gastric cancer.

gastric cancer; PTEN; tissue microarray; immunohistochemistry

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.001

2016-12-06；

2017-02-19

國家自然科學基金(81102854,81374013).

*通訊作者，E-mail:suqi1945@163.com.

#并列第一作者，E-mail:suqi1945@163.com.

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蔣湘蓮)