張桂龍，陳陸馗，李炳乾，蔡云朗

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，神經(jīng)外科，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 3.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210009)

人源神經(jīng)干細胞來源外泌體的提取鑒定及內(nèi)吞作用

張桂龍1,2，陳陸馗1,2，李炳乾1,2，蔡云朗2,3

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，神經(jīng)外科，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 3.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210009)

目的細胞外囊泡外泌體內(nèi)含有蛋白、脂質(zhì)和遺傳物質(zhì)，在細胞間的交流中發(fā)揮著非常重要的作用。本研究首次探討人源神經(jīng)干細胞來源外泌體的的生物學(xué)特性和潛在功能。方法經(jīng)東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院臨床研究倫理委員會的審查和批準(zhǔn)，我們利用成功分離出的人胎兒海馬來源的原代神經(jīng)干細胞進行體外培養(yǎng)、外泌體獲取以及功能評價。通過免疫熒光、western blotting和瓊脂糖凝膠電泳對人源神經(jīng)干細胞進行鑒定；利用超高速離心和總外泌體提取試劑盒提取培養(yǎng)細胞上清中的外泌體，并通過透射電鏡、納米顆粒追蹤分析和western blotting進行鑒定；最后用PKH67標(biāo)記外泌體后評價其潛在功能。結(jié)果人胎兒的海馬中原代神經(jīng)干細胞成功分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)和少突膠質(zhì)細胞；隨后在干細胞的培養(yǎng)上清中成功分離出了干細胞分泌的外泌體，符合外泌體的基本特征結(jié)構(gòu)；最后發(fā)現(xiàn)外泌體可以被干細胞攝取和內(nèi)吞，明顯聚集于胞質(zhì)內(nèi)，且部分入核。結(jié)論本研究初步探索了人源神經(jīng)干細胞來源外泌體的基本特征和內(nèi)吞作用，為其后續(xù)在神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

神經(jīng)干細胞； 外泌體； 標(biāo)記； 內(nèi)吞作用

因此，外泌體作為介導(dǎo)細胞間功能的重要介質(zhì)，本課題將通過人源神經(jīng)干細胞分析其來源外泌體的分泌表達情況，為將來研究外泌體如何參與治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病打下前期基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 人源神經(jīng)干細胞的獲取培養(yǎng)

1.2 人源神經(jīng)干細胞的增殖、分化及免疫熒光鑒定

1.3 外泌體的提取

收集神經(jīng)干細胞培養(yǎng)過程中的細胞上清，用超高速離心方法和總外泌體提取試劑盒根據(jù)操作說明進行提取。細胞上清先經(jīng)2 000 rpm, 10 min去細胞及碎片，再用0.22 μm濾器過濾殘余碎片或雜質(zhì)。超高速離心方法，120 000×g(Beckman)4 ℃離心2 hours，用1 ml預(yù)冷PBS重懸清洗后再120 000×g 4 ℃離心2 hours，最后用100 μl PBS收集外泌體；總外泌體提取方法(Invitrogen)，細胞上清和試劑按2∶1混勻后4 ℃過夜孵育，離心10 000×g 4 ℃ 1 hour，棄上清后用100 μl PBS收集外泌體。

1.4 PKH67標(biāo)記外泌體及細胞內(nèi)吞實驗

人神經(jīng)干細胞常規(guī)培養(yǎng)、鋪板，24孔板培養(yǎng)3 d后換新鮮培養(yǎng)基，并加入PKH67標(biāo)記過的外泌體共孵育24 h，PBS洗細胞2～3次，4%多聚甲醛固定15～30 min，PBS洗3次，DAPI染核5 min，PBS再洗3次，熒光觀察并拍照。

1.5 透射電鏡檢查(TEM)和納米顆粒追蹤分析檢測(NTA)

透射電鏡，取新鮮提取的外泌體10 μl懸滴于銅網(wǎng)上(中鏡科儀)5～10 min，濾紙擦干，再懸滴10 μl 2%磷鎢酸負染液(索萊寶)3～5 min，然后用去離子水清洗1～2次，濾紙吸干多余水分，晾干后透射電鏡下觀察拍照。

納米顆粒分析，用Zetaview(Particle Metrix)儀器根據(jù)操作說明進行外泌體濃度粒徑檢測，方法是利用一個光散射檢測系統(tǒng)和納米顆粒的布朗運動，可為特定和一般大小的納米粒子表征提供檢測。

1.6 瓊脂糖凝膠電泳

根據(jù)總RNA提取試劑盒(Omega)操作說明提取神經(jīng)干細胞的總RNA，用Oligodt引物進行逆轉(zhuǎn)錄，隨后用特異性引物(Nestin、Sox2、Musashi1)進行普通PCR擴增。普通PCR擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，電泳液為0.5% TBE，瓊脂糖濃度為1.5%，電泳結(jié)束后紫外下觀察并拍照。引物：Nestin,正向GGAGGTAGACAAGGAAAGTCAAAC,反向CTTCTCCACCGTATCTTCCCAC；SOX2正向CCCCCTGTGGTTACCTCTTCC,反向CCCTCCCATTTCCCTCGTTTT；MUSASHI1正向GAACCATCCCGTCCTGTATCA,反向ATTCCTGTCCAGCAGTGTCGC。

1.7 Western blotting實驗

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 人源神經(jīng)干細胞的生物學(xué)特性

海馬區(qū)的原代神經(jīng)干細胞是懸浮生長且呈典型的神經(jīng)球樣表現(xiàn)(圖1A)。免疫熒光、western blotting及瓊脂糖凝膠電泳均證實了神經(jīng)干細胞特異性標(biāo)志物(markers)的表達(圖1B)。免疫熒光可見巢蛋白Nestin明顯表達于細胞的骨架(綠)，Sox2明顯表達于細胞核(紅)，Musashi1則明顯表達于細胞質(zhì)和核(紅)；Western blotting從蛋白水平在不同分子量kDa上證實了各個markers的表達；瓊脂糖凝膠電泳從RNA水平也證實了這三種markers的表達。

當(dāng)干細胞分化培養(yǎng)7～10 d后，可以成功分化三種細胞，分別明顯表達Tuj1(神經(jīng)元marker)、GFAP(神經(jīng)膠質(zhì)細胞marker)和MOG(少突膠質(zhì)細胞marker)(圖1C)。

2.2 人源神經(jīng)干細胞來源的外泌體的特征

隨后我們收集了人源神經(jīng)干細胞培養(yǎng)過程中的細胞上清，利用超高速離心和總外泌體提取試劑盒提取后對其(外泌體)進行了鑒定，透射電鏡TEM(圖2A)可見其大小在100 nm上下，具有典型的雙層膜結(jié)構(gòu)，且呈圓盤或杯口狀；納米顆粒大小追蹤分析NTA(圖2B)進一步證實了外泌體的大小均數(shù)為(127.8±7.7) nm，且主要分布于40～250 nm，呈相對的正態(tài)分布特征；Western blotting則驗證了外泌體內(nèi)的特異性標(biāo)志蛋白markers的表達，可見此外泌體內(nèi)明顯表達Hsp70、CD63和Tsg101蛋白(圖2C)。

2.3 人源神經(jīng)干細胞外泌體的內(nèi)吞現(xiàn)象

為了進一步探討人源神經(jīng)干細胞外泌體的特性和潛在功能，我們隨后利用PKH67對其進行了標(biāo)記，并試圖檢測其潛在的內(nèi)吞情況。本實驗中我們依然使用人源神經(jīng)干細胞作為潛在被干預(yù)對象，當(dāng)與提取的其他人源神經(jīng)干細胞來源的外泌體進行共孵育后，發(fā)現(xiàn)外泌體可以成功被攝入內(nèi)吞進入細胞內(nèi)。圖3A和3B示PKH67標(biāo)記后的外泌體在細胞內(nèi)的表達，發(fā)現(xiàn)其主要是在胞質(zhì)內(nèi)進行聚集，并可見(紅色箭頭處)有少部分外泌體還能進入細胞核內(nèi)，間接說明了外泌體有可能參與調(diào)控細胞的轉(zhuǎn)錄表達及生物學(xué)功能。

A.原代人源神經(jīng)干細胞培養(yǎng)第3天和第6天的形態(tài) (×40);B.原代人源神經(jīng)干細胞的免疫熒光(左)、western blotting(中)和瓊脂糖凝膠電泳實驗(右);C.原代人源神經(jīng)干細胞分化后的免疫熒光，分化為神經(jīng)元(Tuj1，左)、神經(jīng)膠質(zhì)(GFAP，中)和少突膠質(zhì)細胞(MOG，右)

圖1原代人源神經(jīng)干細胞的鑒定

A. The morphology of primary hNSCs on 3rdand 6thday; B. Immunofluorescence (Left), western blotting (Middle), and agarose gel electrophoresis (Right) methods confirmed primary hNSCs; C. Primary hNSCs differentiated into neurons (Tuj1, Left), astrocytes (GFAP, Middle), and oligodendrocytes (MOG, Right)

Fig1Identificationofprimaryhumanneuralstemcells

A.透射電鏡TEM檢測外泌體的形態(tài)和大小;B.納米顆粒大小追蹤分析NTA檢測所有外泌體的大小,ZetaView為檢測的視頻顆粒圖;C.Western blotting檢測外泌體特異性標(biāo)記物Hsp70、CD63和Tsg101的表達情況

圖2人源神經(jīng)干細胞分泌外泌體的鑒定

A. The morphology and size of exosomes detected by TEM; B. The size distribution of exosomes examined by NTA. ZetaView was the video snapshot; C. Western blotting showed the exosomal special markers Hsp70, CD63 and Tsg101

A.白光觀察細胞+熒光觀察PKH67標(biāo)記后的外泌體，下圖為局部放大效果;B.DAPI染核后同時熒光觀察PKH67標(biāo)記后的外泌體，下圖為局部放大效果

圖3PKH67標(biāo)記后的人源神經(jīng)干細胞來源外泌體的內(nèi)吞作用

3 討 論

本研究重點探討了人源神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)及其分泌外泌體的基本特征，試圖揭示神經(jīng)干細胞外泌體的潛在功能。雖然目前已有研究證實了鼠源相關(guān)神經(jīng)干細胞來源外泌體的分泌特點，但臨床前研究的目標(biāo)最終還是為了未來的臨床轉(zhuǎn)化服務(wù)。因此，在此基礎(chǔ)上，我們利用被終止妊娠的胎兒的腦組織，直接從人體的細胞水平去進行研究，希望可以更精準(zhǔn)地分析人源神經(jīng)干細胞的各種特征。首先我們成功分離出了人胎兒海馬來源的原代神經(jīng)干細胞，并通過免疫熒光、western blotting和瓊脂糖凝膠電泳從蛋白表達和RNA表達水平多重路徑進行了鑒定；隨后在其培養(yǎng)的細胞上清中提取其可能分泌的外泌體，并通過透射電鏡、納米顆粒大小追蹤分析和western blotting驗證了外泌體的形態(tài)、大小和其特異性標(biāo)志物markers；最后在人源神經(jīng)干細胞自身身上探索外泌體基本的潛在特征，發(fā)現(xiàn)外泌體可以成功被攝取內(nèi)吞進入細胞并在細胞內(nèi)進行聚集，且部分外泌體還能入核。

綜上所述，神經(jīng)干細胞作為神經(jīng)損傷修復(fù)過程中至關(guān)重要的種子細胞，外泌體作為一種新興的重要的細胞間調(diào)控分子，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療過程中神經(jīng)干細胞來源的外泌體將具有非常重要的作用，也許將成為未來神經(jīng)系統(tǒng)疾病一種新的治療方式。因此，本研究在人源神經(jīng)干細胞來源外泌體的基本特征和潛在作用方面進行了初步探索，為后續(xù)的外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域深入的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

[13] COSSETTI C,SMITH J A,IRACI N,et al.Extracellular membrane vesicles and immune regulation in the brain[J].Front Physiol,2012,3:117.

Characterizationofhumanneuralstemcellsderivedexosomesandtheirsendocytosis

(1.SchoolofMedicine,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China; 2.DepartmentofNeurosurgery,

ZhongdaHospital,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China; 3.DepartmentofObstetricsandGynaecology,ZhongdaHospital,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China)

human neural stem cells; exosomes; labeled; endocytosis

國家自然科學(xué)基金面上項目(81471780，81671819)

R741.05

A

孫茂民)