張連美 仲紀祥 孫蘇安

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EGFR、ALK和Ki-67在非小細胞肺癌中的表達及相關性分析

張連美1仲紀祥2孫蘇安1

目的 探討EGFR、ALK和Ki-67在非小細胞肺癌中的表達及相關性。方法 選取2010年1月-2015年1月期間我院收治的100例非小細胞肺癌患者，考察EGFR、ALK和Ki-67在非小細胞肺癌組織中的表達情況，并對患者的臨床病理資料進行統(tǒng)計分析，探討EGFR、ALK和Ki-67在非小細胞肺癌中表達相關性分析。結果 EGFR、ALK和Ki-67在非小細胞肺癌表達陽性率(65.0%，14.0%，87.0%)均顯著高于癌旁組織(3.0%，0%，0%)(P<0.05)；EGFR蛋白在女性、有淋巴結轉移患者中的陽性率顯著高于男性、無淋巴結轉移患者(P<0.05)，ALK蛋白在無吸煙史、鱗癌、低分化組患者中的陽性率顯著高于有吸煙史、腺癌、高-中分化組患者(P<0.05)，Ki-67蛋白在低分化組、有淋巴結轉移、腫瘤大小≥5cm的患者中陽性率顯著高于高-中分化組、無淋巴結轉移、腫瘤大小<5cm患者(P<0.05)；在非小細胞肺癌中，Spearman相關性分析顯示EGFR和ALK表達呈負相關(r=-0.165，P=0.006)，EGFR和Ki-67表達呈正相關(r=0.361，P=0.013)，ALK和Ki-67表達無相關性(r=0.097，P=0.242)。結論 EGFR、ALK和Ki-67在非小細胞肺癌中均呈高表達，EGFR、ALK和Ki-67表達有相關性，可能在非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程中相互作用，值得進一步深入研究。

EGFR；ALK；Ki-67；非小細胞肺癌

近年來，肺癌發(fā)病率呈顯著上升趨勢，而非小細胞肺癌(NSCLC)約占原發(fā)性肺癌的80%左右。手術治療、放射治療和化學治療是治療肺癌的傳統(tǒng)手段[1]。隨著對腫瘤發(fā)病機制研究的不斷深入，分子靶向治療成為研究的熱點，如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的酪氨酸激酶抑制劑等，而間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)融合突變也是治療NSCLC新的分子靶點，但是部分患者會出現(xiàn)耐藥性，不適合分子靶向治療[2-3]。為了進一步研究NSCLC的發(fā)病機制，EGFR、ALK和Ki-67在其發(fā)生發(fā)展過程中的相關性，我院在收治的100例NSCLC患者進行研究，現(xiàn)將相關內(nèi)容報道如下。

資料與方法

一、一般資料

選取2010年1月-2015年1月期間我院收治的100例經(jīng)病理學診斷確診為NSCLC患者，其中男性患者43例，女性患者57例，年齡范圍45-79歲，平均年齡58.9±5.8歲。本研究100例NSCLC患者均符合以下標準入選標準：① 所選標本經(jīng)病理學確診為NSCLC和癌旁組織；② 均未經(jīng)放化療治療；③ 患者隨訪資料完整。所有患者均于手術后獲取患者的NSCLC組織和癌旁組織，并制作石蠟標本，用于免疫組化分析。

二、研究方法

免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋公司。標本用10%福爾馬林固定，石蠟包埋后進行①脫蠟水化；②抗原修復；③PBS洗滌，H2O2室溫孵育；④雙蒸水，PBS洗滌；⑤封閉；⑥一抗孵育過夜；⑦PBS洗滌；⑧二抗室溫孵育；⑨PBS洗滌；⑩ABC室溫孵育；PBS洗滌；DAB 染色；蘇木素復染，用雙蒸水洗滌。脫水保存中性樹膠封閉后蓋玻片。由經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法進行閱片，每張切片選5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，EGFR陽性信號呈棕黃色或棕褐色，表達于胞漿或胞膜，ALK陽性信號呈棕黃色，表達于細胞核或胞漿，Ki67陽性信號為棕色顆粒，定位于細胞核，樣本中EGFR、ALK和Ki-67陽性表達細胞所占總細胞的比例分為四個等級：<5%，5%-25%，26%-50%和>50%。分別對應-，+，++和+++。

三、 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以絕對數(shù)和百分率表示，計量資料采用x±s表示，組間比較采用方差F分析加q檢驗，EGFR、ALK和Ki-67相關性分析采用 Spearman 相關性分析法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、EGFR、ALK和Ki-67在NSCLC和癌旁組織中的表達

EGFR在NSCLC組織中陽性率為65.0%，癌旁組織中陽性率為3.0%，ALK在NSCLC組織中表達陽性率為14.0%，癌旁組織中表達陽性率為0%，Ki-67在NSCLC組織中表達陽性率為87.0%，癌旁組織中表達陽性率為0%。EGFR、ALK和Ki-67在NSCLC表達陽性率均顯著高于癌旁組織，數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05，(見表1，圖1)。

表1 EGFR、ALK和Ki-67在NSCLC和癌旁組織中的表達

nEGFR陽性(%)ALK陽性(%)Ki-67陽性(%)癌旁組織1003(3.0)0(0)0(0)癌組織10065(65.0)14(14.0)87(87.0)P0.0000.0010.000

圖1 EGFR、ALK和Ki-67在NSCLC組織中的表達(×100)

A：EGFR在NSCLC組織中陽性表達；B：EGFR在NSCLC組織中陰性表達；C：ALK在NSCLC組織中陽性表達；D：ALK在NSCLC組織中陰性表達；E ：Ki-67在NSCLC組織中陽性表達；F：Ki-67在NSCLC組織中陰性表達

二、EGFR、ALK和Ki-67陽性表達與患者臨床病理資料分析

EGFR蛋白在女性、有淋巴結轉移患者中的陽性率顯著高于男性、無淋巴結轉移患者，數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，ALK蛋白在無吸煙史、鱗癌、低分化組患者中的陽性率顯著高于有吸煙史、腺癌、高-中分化組患者，數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Ki-67蛋白在低分化組、有淋巴結轉移、腫瘤大小≥5 cm的患者中陽性率顯著高于高-中分化組、無淋巴結轉移、腫瘤大小<5 cm患者，數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05，(見表2)。

表2 EGFR、ALK和Ki-67陽性表達與患者臨床病理資料分析

三、EGFR、ALK和Ki-67在NSCLC中表達相關性分析

Spearman 相關性分析，EGFR和ALK在NSCLC中表達呈負相關(r=-0.165，P=0.006)，(見表3)。

表3 EGFR和ALK在NSCLC中表達相關性分析

Spearman 相關性分析顯示EGFR和Ki-67在NSCLC中表達呈正相關(r=0.361，P=0.013)，(見表4)。

Spearman 相關性分析顯示ALK和Ki-67在NSCLC中表達無相關性(r=0.097，P=0.242)，詳見表5。

表4 EGFR和Ki-67在NSCLC中表達相關性分析

表5 ALK和Ki-67在NSCLC中表達相關性分析

討 論

EGFR是目前腫瘤研究的熱點，其介導的信號轉導與細胞的增殖、生存以及分化密切相關。已有研究表明，EGFR在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵作用，如腎癌、卵巢癌、結腸癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌等均發(fā)現(xiàn)EGFR過表達，且影響患者的預后[4-5]。ALK融合突變基因首次發(fā)現(xiàn)于2007年，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)EML4-ALK至少有13種不同的融合突變亞型，研究表明ALK融合基因突變可誘導肺癌的發(fā)生，給予ALK酪氨酸激酶抑制劑腫瘤可迅速消退，現(xiàn)已有相關藥物批準上市用于治療ALK陽性的NSCLC患者[6]。Ki-67 定位于第10號染色體，于1983年首次制備成功，表達于增殖細胞當中，可以直接與反映腫瘤增殖的核抗原發(fā)生反應，因此，用于腫瘤組織活檢[7]。目前，Ki-67已經(jīng)用于軟組織肉瘤、惡性淋巴瘤、肺癌以及乳腺癌等惡性腫瘤的研究，其與腫瘤惡性程度呈正相關，可用于判斷腫瘤侵襲力。此外，有學者認為與腫瘤組織的病理分級、臨床分期、淋巴結轉移、腫瘤大小存在聯(lián)系[8]。

本研究結果顯示EGFR、ALK和Ki-67在NSCLC表達陽性率顯著增高，此外，EGFR蛋白與NSCLC患者的性別、淋巴結轉移相關，ALK蛋白與NSCLC患者的吸煙史、病理類型、分化程度相關，Ki-67蛋白與NSCLC患者的分化程度、淋巴結轉移、腫瘤大小相關。有學者研究發(fā)現(xiàn)EGFR 的表達水平明顯比無淋巴結轉移者高，鱗癌的 EGFR 高表達較突出[9-10]。有研究結果表明ALK融合基因陽性多見于年輕、不吸煙或少吸煙、女性、鱗癌的NSCLC患者，與本研究結果相似[11-12]。有研究結果顯示Ki-67在肺癌細胞核中表達，在肺癌組織中的陽性表達率為62.5%，而在NSCLC中陽性表達率高達93.33%，且不表達于正常組織。發(fā)現(xiàn)Ki-67在高分化、中分化、低分化組織中表達逐漸增高[13]。

針對NSCLC中EGFR、ALK和Ki-67表達相關性，目前還存在爭議[14]。本研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC中EGFR和ALK表達呈負相關，EGFR和Ki-67表達呈正相關，而ALK和Ki-67表達無相關性。提示EGFR和Ki-67在 NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展中具有協(xié)同或相互調節(jié)功能。三者在NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了關鍵性作用，但其具體作用機制有待于進一步研究闡明，但任一種表達異常，則可能導致NSCLC向著惡性度更高的方向發(fā)展。

本文尚存一些不足，EGFR 突變的確診方式為基因檢測，而本文運用免疫組化法，可能存在偏差，本文入選的病例數(shù)較少，樣本量不足可能產(chǎn)生誤差。

綜上所述，EGFR、ALK和Ki-67在NSCLC中均呈高表達，EGFR、ALK和Ki-67表達有相關性，可能在NSCLC肺癌發(fā)生發(fā)展過程中相互作用，值得深入研究。

[1] 曾珠, 吳一龍. EML4-ALK與EGFR基因突變共存型非小細胞肺癌研究進展[J].中國肺癌雜志,2011,14(11):880-884.

[2] Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin, 201l,6l(2):69-90.

[3] Soria JC,Wu YL,Nakagawa K,et al.Gefitinib plus chemotherapy versus placebo plus chemotherapy in EGFR-mutation-positive non-small-cell lung cancer after progression on first-line gefitinib (IMPRESS): a phase 3 randomised trial[J].Lancet Oncol,2015,16(8):990-998.

[4] 吳霞，李代強. ALK和EGFR蛋白在非小細胞肺癌中的表達及意義[J].國際病理科學與臨床雜志, 2013,33(2):120-124.

[5] 王杰,衣素琴,王歡,等.非小細胞肺癌中c-Met、EGFR、K-Ras和EML4-ALK基因的檢測分析[J].臨床腫瘤學雜志,2015,20(10):902-908.

[6] Liang W,He Q,Chen Y,et al. Metastatic EML4-ALK fusion detected by circulating DNA genotyping in an EGFR-mutated NSCLC patientand successful management by adding ALK inhibitors: a case report[J].BMC Cancer,2016,16:62.

[7] Weickhardt AJ,Aisner DL,Franklin WA，et al.Diagnostic assays for identification of anaplastic lymphoma kinase-positive non-small cell lung cancer[J].Cancer, 2013,119(8):1467-1477.

[8] 尹迎春,王新美,李良,等.非小細胞肺癌胸腔積液細胞蠟塊檢測EGFR與K-rasras基因突變和EML4-ALK融合基因及其臨床病理特征[J].中國胸心血管外科臨床雜志,2015,22(9):870-874.

[9] 張緒超,陸舜,張力,等.中國間變性淋巴瘤激酶 (ALK) 陽性非小細胞肺癌診斷專家共識(2013版).中華病理學雜志, 2013,42(6):402-406.

[10] Yang JJ,Zhang XC,Su J,et al.Lung cancers with concomitant EGFR mutations and ALK rearrangements: diverse responses to EGFR-TKI and crizotinib in relation to diverse receptors Phosphorylation[J].Clin Cancer Res,2014,20(5):1383-1392.

[11] Zhao N,Zheng SY,Yang JJ,et al.Lung adenocarcinoma harboring concomitant EGFR mutation and EML4-ALK fusion that benefits from three kinds of tyrosine kinase inhibitors: a case report and literature review[J].Clin Lung Cancer,2015,16(2):e5-e9.

[12] Zhang X,Zhang S,Yang X,et al.Fusion of EML4 and ALK is associated with development oflung adenocarcinomas lacking EGFR and KRAS mutations and is correlated with ALK expression[J]. Mol Cancer, 2010,9:188.

[13] Lee CK, Brown C, Gralla RJ,et al.Impact of EGFR inhibitor in non-small cell lung cancer on progression-free and overall survival: a meta-analysis[J].J Natl Cancer Inst,2013,105(9):595-605.

[14] Gainor JF,Varghese AM,Ou SH,et al.ALK rearrangements are mutually exclusive with mutations in EGFR or KRAS: an analysis of1,683 patients with non-small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res,2013,19(15):4273-4281.

Expression and correlation analysis of EGFR, ALK and Ki-67 in non small cell lung cancer

ZHANGLian-mei,ZHONGJi-xiang,SUNSu-an

DepartmentofPathology,Huai’anFirstPeople'sHospital,Huai’an,Jiangsu223300,China

Objective To investigate the expression and correlation analysis of EGFR, ALK and Ki-67 in non small cell lung cancer. Methods 100 patients with non small cell lung cancer were selected from January 2010 to January 2015, and the expression of epidermal growth factor receptor (EGFR), ALK and Ki-67 in non-small cell lung cancer were detected. Their clinical and pathological data were statistically analyzed. Results The positive expression rate of EGFR, ALK and Ki-67 in non-small cell lung cancer was 65.0%, 14.0 % and 87.0% respectively, which were all significantly higher than those in paracancerous tissues (3.0%, 0%, 0%) (P<0.05). The positive rate of EGFR protein was obviously higher in female patients with lymph node metastasis than in male patients without lymph node metastasis (P<0.05). The positive rate of ALK protein was higher in patients with no smoking history, squamous cell carcinoma, and low differentiation (P<0.05). The positive rate of Ki-67 protein was higher in patients with low differentiation, lymph node metastasis and tumor size greater or equal than 5 cm (P<0.05). In non small cell lung cancer, the Spearman correlation analysis showed EGFR and ALK expression was negatively correlated (r=-0.165,P=0.006), and the expression of EGFR and Ki-67 was positively correlated (r=0.361,P=0.013). ALK and Ki-67 expression had no correlation (r=0.097,P=0.242). Conclusion The expression of EGFR and ALK and Ki-67 shows high expression in patients with non-small cell lung cancer, which may occur in the development of non small cell lung cancer.

EGFR; ALK; Ki-67; non small cell lung cancer

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.01.002

淮安市科技支撐計劃基金(No HAS2014008-2)

1.223300 江蘇 淮安，淮安市第一人民醫(yī)院病理科 2.223002 江蘇 淮安， 淮安市婦幼保健院不孕不育科

2016-06-07]