沈煒 陳學奇

調經(jīng)湯對卵巢早衰模型大鼠卵巢功能影響的實驗研究

沈煒1陳學奇2

目的觀察調經(jīng)湯對卵巢早衰模型大鼠卵巢功能的影響。方法將60只雌性成熟未交配Wistar大鼠隨機分為空白對照組、模型組、陽性藥物對照組、調經(jīng)湯低、中、高劑量組，每組10只?？瞻捉M大鼠按0.4mL/100g體質量腹腔注射無菌注射用水，其余各組大鼠按0.4mL/100g體質量腹腔注射濃度為0.5mg/mL的順鉑溶液，連續(xù)7天。觀察大鼠行為變化、動情周期，采用放射免疫法檢測大鼠血清促卵泡生成素（FSH）、雌激素（E2）和促黃體生成素（LH）水平，光鏡觀察卵巢組織形態(tài)改變。結果模型組和陽性藥物對照組大鼠無穩(wěn)定的動情周期，調經(jīng)湯中、高劑量組逐漸恢復規(guī)律的動情周期。給藥后第7、14天，與空白對照組比較，模型組大鼠血清FSH、LH升高，E2降低，差異有統(tǒng)計學意義[第7天：（7.38±0.99）IU/L比（6.18±0.24）IU/L，（3.35±0.27）ng/L比（2.79±0.24）ng/L，（94.04±6.22）ng/L比（109.10±5.69）ng/L，P均＜0.05；第14天：（8.01±0.13）IU/L比（6.97±0.88）IU/L，（4.22±0.82）ng/L比（3.20±0.17）ng/L，（131.74±23.65）ng/L比（157.82±5.68）ng/L，P均＜0.05]；給藥后第7天，與模型組比較，調經(jīng)湯低、中、高劑量組大鼠血清FSH降低，E2升高，差異有統(tǒng)計學意義[（5.72±0.51）IU/L、（6.20±1.05）IU/L、（6.08±0.26）IU/L比（7.38±0.99）IU/L；（104.46±10.25）ng/L，（104.48±12.85）ng/L，（106.64±8.67）ng/L比（94.04±6.22）ng/L，P均＜0.05]；血清LH含量水平雖降低，但差異無統(tǒng)計學意義[（2.96±0.38）ng/L、（3.00±0.19）ng/L、（2.96±0.23）ng/L比（3.35±0.27）ng/L，P＞0.05]。給藥后第14天，與模型組比較，調經(jīng)湯中劑量組大鼠血清FSH、LH降低，E2升高，差異有統(tǒng)計學意義[（7.02±1.04）IU/L比（8.01±0.13）IU/L，（3.37±0.53）ng/L比（4.22±0.82）ng/L，（153.67±20.55）ng/L比（131.74±23.65）ng/L，P均＜0.05]。模型組大鼠卵巢萎縮，卵泡生長少，閉鎖卵泡增加，部分被纖維組織代替，黃體數(shù)量少，子宮內(nèi)膜明顯變薄。調經(jīng)湯低、中、高劑量組大鼠卵泡數(shù)量和黃體數(shù)目不同程度增多，子宮內(nèi)膜有所增厚。結論調經(jīng)湯能有效改善順鉑誘導的卵巢早衰模型大鼠的卵巢功能。

大鼠；卵巢早衰；調經(jīng)湯；順鉑

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指婦女在40歲之前由于卵巢功能提前衰竭而導致閉經(jīng)的現(xiàn)象[1-2]。POF臨床診斷標準為年齡＜40歲，閉經(jīng)時間≥4個月，間隔1個月以上的兩次血清促卵泡激素＞40mIU/mL，雌二醇（E2）＜73.2pmol/L，且超聲波顯示卵巢和子宮縮小，卵巢中無卵泡[3]。“調經(jīng)湯”源自陳木扇女科經(jīng)典著作《陳素庵婦科補解》中的“大調經(jīng)丸”，由當歸、川芎、麩白芍、熟地黃、白術等組成。經(jīng)臨床觀察發(fā)現(xiàn)，調經(jīng)湯能延長女性的絕經(jīng)年齡，重建規(guī)律的月經(jīng)周期，改善早衰女性的卵巢功能。本文旨在通過動物實驗研究，初步探索調經(jīng)湯治療卵巢早衰可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物成熟雌性未交配Wistar大鼠60只，體質量180～220g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物合格證號：SCXK（滬）2012-0002。

1.2 藥物及試劑調經(jīng)湯組成：當歸、川芎、麩白芍、熟地黃、白術等十六味中藥（浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片廠，經(jīng)鑒定為合格的中藥飲片）。注射用順鉑（凍干型）（齊魯制藥有限公司，批號1507112）；0.9%氯化鈉注射液（杭州民生藥業(yè)有限公司，批號1503571）；HE染色液（三明市和眾生物技術有限公司，批號1410068）；戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號1511085）；

2 實驗方法

2.1 調經(jīng)湯提取液制備取單帖處方劑量的“調經(jīng)湯”飲片，用10倍量（體積/重量）水浸泡30min，然后煎煮1h，濾過得一次水提液；濾渣再加8倍量（體積/重量）水煎煮40min，濾過得二次水提液。合并兩次濾液，常壓濃縮至5、2.5、1.25g/mL，分別用于調經(jīng)湯高、中、低劑量組。

2.2 動物分組與喂養(yǎng)將60只Wistar大鼠隨機分成空白對照組、模型組、陽性藥物對照組、調經(jīng)湯低、中、高劑量組，每組10只。用苦味酸分別標記，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。所有動物均飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)的IVE籠具中，相對濕度50%～70%，溫度22℃±1℃，12h明暗交替，15～20次/h的換風次數(shù)，噪音小于50d。

2.3 卵巢早衰大鼠模型建立[4]空白組大鼠按0.4mL/100g體質量腹腔注射無菌注射用水，其余各組大鼠按0.4mL/100g體質量腹腔注射濃度0.5mg/mL順鉑溶液，連續(xù)7天，造成免疫性卵巢早衰大鼠模型。

2.4 給藥造模24h后開始分組給藥，空白對照組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃；陽性對照組給予濃度為1.25mg/100mL的雌二醇溶液；治療組分別給予低劑量（0.5g/100g體質量）、中劑量（1g/100g體質量）、高劑量（2g/100g體質量）調經(jīng)湯水煎液灌胃均1天2次，連續(xù)14天。

2.5 觀察指標及方法

2.5.1 各組大鼠行為學變化在實驗過程中，每天觀察各組大鼠飲食量、活動量、體毛、反應和大便性狀等外在表現(xiàn)的差異。

2.5.2 各組大鼠動情周期變化在實驗過程中，每天定時取各組大鼠陰道分泌物，做陰道涂片，置于顯微鏡下觀察六組大鼠的動情周期變化。

2.5.3 各組大鼠血清性激素變化分別于給藥第7、14天，禁食不禁水12h以上，眼眶內(nèi)眥取血，靜置后離心（3000r/min）20min，取上清液送檢，用放免法測定血清性激素水平。

2.5.4 卵巢組織形態(tài)學變化治療14天后將大鼠斷頸處死后剖腹取卵巢、子宮，置于中性甲醛液中固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，光鏡下觀察大鼠卵巢組織形態(tài)變化。

2.6 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)應用SPSS12.0統(tǒng)計軟件處理，采用單因素方差分析。

3 實驗結果

3.1 行為學變化實驗前后對比，空白對照組大鼠無明顯異常表現(xiàn)，狀態(tài)良好，行為敏捷，皮毛光滑，大便性狀良好。造模后，模型組大鼠的體質量均明顯減輕，且隨著造模時間的推移，絕大部分大鼠進食逐漸減少，形體逐漸消瘦，反應變得遲鈍，蜷縮扎堆，皮毛暗淡，毛發(fā)蓬松，大便性狀發(fā)生變化，變得濕軟，臭味明顯加重。藥物治療后，陽性藥物對照組大鼠恢復最慢，調經(jīng)湯組大鼠活動量逐漸增加，進食逐漸增多，大便性狀逐漸往正常水平恢復，其中屬高劑量調經(jīng)湯組大鼠恢復最佳。

3.2 動情周期變化造模前，各組大鼠的動情周期均為3～5天，動情間期、動情前期、動情期、動情后期交替出現(xiàn)。各期陰道脫落細胞變化表現(xiàn)為動情間期/靜止期：大部分為白細胞，混有少量較小的有核扁平上皮細胞；動情前期：大部分為膨大的橢圓形有核上皮細胞；動情期：膨大的上皮細胞消失，成為鱗狀脫落的角化上皮細胞；動情后期：出現(xiàn)卵原細胞并逐漸增多。造模7天后，空白對照組大鼠動情周期穩(wěn)定，為3～5天；其余五大組大鼠動情周期紊亂，失去正常動情周期變化，表現(xiàn)為持續(xù)的動情間期、無動情前期及動情期，周期延長至5～8天，陰道涂片可見白細胞、上皮細胞和角化的上皮細胞。治療14天后，調經(jīng)湯低、中劑量組大鼠動情周期逐漸縮短為5～7天，其中調經(jīng)湯高劑量組大鼠動情周期為4～6天。見封三圖1。

圖1 實驗第12天各組大鼠陰道脫落細胞圖（Giemsa染色，×100）

圖2 各組大鼠卵巢組織形態(tài)（HE染色，×200）

3.3 血清性激素含量變化給藥7天后，與空白對照組比較，模型組大鼠血清FSH和LH水平升高，E2含量降低（P均＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物對照組、調經(jīng)湯低、中、高劑量組大鼠血清FSH明顯降低，E2含量顯著升高（P均＜0.05）。給藥14天后，與空白對照組比較，模型組大鼠血清FSH和LH升高、E2含量降低（P均＜0.05）；陽性藥物對照組大鼠血清E2含量降低（P＜0.05）。與模型組比較，調經(jīng)湯中劑量組大鼠血清FSH和LH含量降低、E2含量升高（P＜0.05），調經(jīng)湯高劑量組大鼠血清FSH含量降低（P＜0.05）。見表1。

3.4 卵巢組織形態(tài)學變化空白對照組大鼠卵泡數(shù)量多，顆粒細胞層次多，各級卵泡類型明顯，黃體發(fā)育好，體積大，數(shù)量多，子宮內(nèi)膜厚。模型組大鼠卵巢體萎縮，卵泡生長少，未見成熟的卵泡，閉鎖卵泡增加，部分被纖維組織代替，黃體數(shù)量少。陽性藥物對照組大鼠卵巢體萎縮未見明顯恢復，卵泡生長略有所增多，未見成熟卵泡，閉鎖卵泡略減少，黃體數(shù)量略增多；調經(jīng)湯各組大鼠均有明顯好轉趨勢，成熟卵泡數(shù)量明顯增加，卵泡液含量也有所增多，黃體數(shù)目明顯增多，體積變大，其中屬調經(jīng)湯高劑量組大鼠恢復最明顯。各組大鼠卵巢組織形態(tài)見封三圖2。

4 討論

雌激素能促使細胞合成DNA、RNA和相應組織內(nèi)各種不同的蛋白質，從而促使子宮內(nèi)膜增生，增強子宮平滑肌的收縮，臨床用于治療卵巢機能不全或卵巢激素不足引起的各種癥狀。但是17β-雌二醇在體內(nèi)有抑制LH分泌的作用[5]，會推遲卵泡生長。本研究顯示，陽性對照組大鼠卵巢卵泡數(shù)量少，未見明顯成熟卵泡，閉鎖卵泡多，黃體數(shù)量少，體積小。陰道涂片觀察可見大鼠沒有穩(wěn)定的動情周期變化。調經(jīng)湯組大鼠成熟卵泡數(shù)量明顯增加，卵泡液含量也有所增多，黃體數(shù)目明顯增多，體積也明顯變大，子宮內(nèi)膜也有所增厚。陰道涂片分析可見大鼠的動情周期變化逐漸恢復穩(wěn)定。說明調經(jīng)湯對順鉑致卵巢早熟模型大鼠的治療效果優(yōu)于雌二醇。

表1 各組大鼠治療后血清性激素含量比較（±s）

表1 各組大鼠治療后血清性激素含量比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；FSH：促卵泡生成素；E2：雌激素；LH：促黃體生成素

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本研究顯示，利用順鉑建立雌性大鼠卵巢早衰動物模型，成功損傷卵巢功能，影響卵泡的正常生長發(fā)育及排卵過程，導致卵泡丟失、閉鎖、不排卵，調經(jīng)湯對卵巢早衰模型大鼠修復卵巢功能具有較高的療效。

［1］李茜西，呂德欣.卵巢早衰的病因及治療研究進展［J］.中國醫(yī)藥導報，2014，11（30）：164-168.

［2］豐有吉，沈慳.婦產(chǎn)科學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：252.

［3］徐苓，宋亦軍.卵巢早衰的臨床表現(xiàn)和診斷標準［J］.實用婦產(chǎn)科雜志，2003，19（4）：195-196.

［4］張麗娟，陶仕英，趙丕文，等.順鉑建立大鼠卵巢模型的實驗研究［J］.世界中醫(yī)藥，2015，10（10）：1563-1569.

［5］方溪.17β-雌二醇對動情后期大鼠的離體垂體小片進行表面灌流其促性腺激素分泌有急性抑制性影響［J］.國際婦產(chǎn)科學雜志，1991，5（5）：92-98.

Effect of Tiaojing Decoction on Treatment of Premature Ovarian Failure in Rats

SHEN Wei1,CHEN Xueqi2.
1 Drug Preparation Center,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China.2 Department of Gynecology，the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of Tiaojing decoction on treatment of premature ovarian failure in rats.MethodsSixty female adult rats were randomly divided into blank group,model group,positive drug control group,andlow-,medium-,and high-dose of Tiaojing decoction groups,with 10 rats in each group.Premature ovarian failure rat model was established through 7-consecutive-day intraperitoneal injection of cisplatin solution in all groups except for blank group.The oestrous cycle was observed,the variation in content of FSH,E2,LH was detected with radioimmunoassay and ovarian pathological changes were observed under light microscope in all group.ResultsThe model group and positive drug control had no stable estrous cycle while high-dose and medium dose Tiaojing decoction group gradually restored the estrous cycle.On day 7 and 14,the serum FSH（Day7:7.38±0.99IU/L,Day 14:8.01±0.13IU/L）and LH（Day 7:3.35±0.27）ng/L,Day 14:4.22±0.82ng/L）increased and E2（Day 7:94.04±6.22ng/L,Day 14:131.74±23.65ng/L）decreased compared with those in blank group（FSH:Day 7:6.18±0.24IU/L,Day 14:6.97±0.88IU/L;LH:Day 7:2.79±0.24ng/L,Day 14:3.20±0.17ng/L;E2:Day 7:109.10±5.69ng/L,Day 14:157.82±5.68ng/L）,all withP＜0.05;on day 7,compared with those in the model group,the serum FSH content decreased and E2 content increased in the low-,middle-and high-dose Tiaojing decoction groups（FSH:5.72±0.51IU/L,6.20±1.05IU/L,6.08±0.26IU/L;E2:104.46±10.25ng/L,104.48±12.85ng/L,106.64±8.67ng/L,allP＜0.05）,but the serum LH level decreased without significant difference（2.96±0.38ng/L,3.00±0.19ng/L,2.96±0.23ng/L,P＞0.05）;on day 14,the FSH（7.02±1.04IU/L）and LH（3.37±0.53ng/L）in the middledose of Tiaojing decoction group were lower and E2（153.67±20.55ng/L）was higher than those in the model group（P＜0.05）.Ovarian tissue pathological changes such as ovarian volume contraction,less follicular growth,increase in atresia follicles,partly replaced by fibrous tissue,less corpus luteum in number,and thinner endometrium were observed in the model group.These pathological changes were improved in Tiaojing decoction groups,such as more follicular growth,increase in corpus luteum number,and thicker endometrium.ConclusionTiaojing decoction can improve the ovarian function of rats with premature ovarian failure induced by cisplatin.

rats;premature ovarian failure;Tiaojing decoction;cisplatin

浙江省中醫(yī)藥科技計劃（No.2014ZA047）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃（2015ZA114）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃（No.2016ZA112）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃（No.2017ZZ009）

1浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院制劑中心（杭州310006）；2浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院婦科（杭州310006）

陳學奇，Tel：057187071760；E-mail：1810633261@qq.com

（收稿：2017-06-06修回：2017-07-14）