史毅，?？e，余倩倩，劉文輝，馬暉玲*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510640；3.青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用省級重點實驗室,青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016)

低溫對青海扁莖早熟禾活性氧代謝的影響和相關(guān)基因表達分析

史毅1，?？e1，余倩倩2，劉文輝3，馬暉玲1*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510640；3.青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用省級重點實驗室,青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016)

為研究青海扁莖早熟禾(BJ)在低溫脅迫下活性氧積累、抗氧化酶防御與逆境相關(guān)基因表達的機制，以WY-2(草地早熟禾‘午夜2號’)為對照，對這兩種材料低溫適應(yīng)(10/5 ℃) 3 d和冷凍脅迫(-10 ℃) 24 h，測定了O2-·產(chǎn)生速率、H2O2含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性及其抗氧化酶相關(guān)基因、冷脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的相對表達量。結(jié)果表明，低溫脅迫可引起B(yǎng)J和WY-2葉片內(nèi)的O2-·產(chǎn)生速率、H2O2含量和MDA含量的增加，BJ活性氧的積累程度和MDA含量均低于WY-2；低溫脅迫可導(dǎo)致BJ的SOD、APX和GR活性的降低，CAT活性呈先升后降的趨勢，但只有APX活性表現(xiàn)為BJ高于WY-2，同時，BJ和WY-2葉片內(nèi)的Cu/ZnSOD、CAT、APX和GR基因的表達量在低溫脅迫后被明顯的上調(diào)，且BJ抗氧化酶相關(guān)基因的相對表達量普遍高于WY-2；BJ葉片內(nèi)的DREB2是下調(diào)表達的，ERF、DREB1、CSP和HSP基因在低溫脅迫后均表現(xiàn)出明顯的上調(diào)表達，且ERF、CSP和HSP的相對表達量高于WY-2。從而得出結(jié)論，扁莖早熟禾在低溫脅迫時有害物質(zhì)的積累低于午夜二號，抗氧化酶相關(guān)基因表達上調(diào)幅度，以及一些與冷脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達調(diào)控均大于午夜二號。這些物質(zhì)合成和基因表達的差異可能共同導(dǎo)致扁莖早熟禾的高耐冷性。

青海扁莖早熟禾；草地早熟禾；活性氧；抗氧化酶；基因表達

低溫脅迫是暖季型草坪草分布、生長和生產(chǎn)力的一個重要限制因子[1]。在我國北方地區(qū)，低溫是影響冷季型草坪草綠期和越冬的一個關(guān)鍵因子[2]。因此，提高草坪草的抗寒性和延長綠期將是目前草坪草研究中的一個重要課題。

青海扁莖早熟禾(Poapratensisvar.ancepscv. Qinghai)是草地早熟禾(Poapratensis)的一個變種，廣泛分布于青海省海拔3000 m 以上的天然草地上，具有較強的抗寒性[3]，尤其強于一些草地早熟禾商用品種，例如午夜2號，本實驗室已有數(shù)據(jù)證明，但尚未發(fā)表。目前對青海扁莖早熟禾的研究主要集中在其生長特性[4-5]、繁殖特性[6-7]和種群變化特征[8-9]，對其響應(yīng)逆境脅迫的生理和分子機制的研究很少。然而，明確優(yōu)良種質(zhì)資源適應(yīng)逆境脅迫的機制是培育優(yōu)良抗性種質(zhì)和發(fā)展高效率、低成本草坪的關(guān)鍵措施。

草坪草抗逆性機理涉及多種代謝進程，主要包括水分和營養(yǎng)元素的關(guān)系、碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)代謝、激素代謝和抗氧化防御系統(tǒng)[1,10]。低溫脅迫可影響植物體內(nèi)多種代謝的能量平衡，從而引起活性氧(ROS)的積累和脂質(zhì)、核酸及蛋白的氧化損傷[11]。酶類和非酶類的抗氧化劑可通過一定程度的清除ROS來緩解逆境脅迫引起的氧化損傷，抗氧化清除能力的增加與低溫脅迫下植株的生存能力息息相關(guān)[12]。然而，在多年生黑麥草(Loliumperenne)[13]和狗牙根(Cynodondactylon)[14]響應(yīng)低溫脅迫的研究中發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫可導(dǎo)致抗氧化酶活性(SOD，CAT和APX)的下降。同時，低溫脅迫也會引起這兩種材料過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)下調(diào)表達，而鷹嘴豆(Cicerarietinum)響應(yīng)短期低溫脅迫時，超氧化物歧化酶SOD和CAT是上調(diào)表達的[15]。此外，一些逆境相關(guān)基因的表達調(diào)控與草坪草對逆境脅迫響應(yīng)有著一定的聯(lián)系。Zhang 等[16]對低溫脅迫下草地早熟禾的轉(zhuǎn)錄組進行分析后發(fā)現(xiàn)，抗寒轉(zhuǎn)錄因子(CBF/DREB)、乙烯響應(yīng)因子(ERF)、熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSF)、NAC蛋白和生長素應(yīng)答因子(ARF)等是草地早熟禾響應(yīng)低溫脅迫的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

因此，本研究以草地早熟禾‘午夜2號’(WY-2)為對照，對青海扁莖早熟禾(BJ)響應(yīng)短期低溫脅迫的機理進行了初步的研究，包括活性氧(ROS)的積累、脂質(zhì)過氧化(MDA)、抗氧化酶活性(SOD、CAT、APX、GR)、抗氧化酶基因表達和逆境脅迫相關(guān)基因表達(ERF、DREB、CSP、SWEET、HSP)。旨在為草坪草響應(yīng)低溫脅迫的機理和草坪草抗寒新品種的培育奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

‘青海扁莖早熟禾’(BJ)的種子由青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院提供，‘午夜2號’(WY-2)的種子由北京克勞沃草業(yè)技術(shù)開發(fā)中心提供。

1.2 材料培養(yǎng)和生長條件

試驗于2016年7-9月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)培養(yǎng)室內(nèi)進行，選取健康、飽滿的種子，播種于內(nèi)口徑20 cm、高14 cm的聚乙烯塑料盆中，基質(zhì)為土壤表層土與沙的混合物(4∶1)，播量為6.5 g/m2，在光照培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng),光照強度為400 μmol/(m2·s)；溫度為白天25 ℃、14 h，夜間20 ℃、10 h；相對濕度為60%～70%。出苗前用無紡布覆蓋，苗齊后進行間苗，留下長勢一致和分布均勻的20株幼苗。采用正常的養(yǎng)護管理，每隔10 d澆一次1/2 Hoagland營養(yǎng)液[17]，每盆100 mL。

1.3 低溫處理和取樣

待每株長到5～6片真葉進行低溫脅迫處理。挑選每盆內(nèi)材料長勢一致的4盆組成一組，將其移至10/5 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)(其他條件與對照保持一致)低溫適應(yīng)，3 d后再將材料放置于-10 ℃的冰箱內(nèi)冷凍處理24 h，分別于低溫適應(yīng)處理前(0 h)，低溫適應(yīng)3 d 后(C-3d)，冷凍處理2 h(F-2 h)、4 h(F-4 h), 8 h(F-8 h), 24 h(F-24 h)取樣，每種每個時間點4個重復(fù)(每盆為一個重復(fù))，共取48個早熟禾葉片樣品，取后放入液氮中，-80 ℃保存，用于生理指標(biāo)和基因表達量測定。

1.4 生理指標(biāo)測定

O2-·產(chǎn)生速率參照Schneider等[18]的方法測定；H2O2含量用Liu 等[19]的方法測定；丙二醛(MDA)含量的測定采用Heath等[20]的方法；粗酶液的提取和超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)活性的測定參照de Azevedo等[21]的方法。

1.5 基因表達分析

1.5.1總RNA的提取和第一鏈cDNA的合成 葉片總RNA采用TIANGEN的總RNA抽提試劑盒(RNAsimple Total RNA Kit)，RNA的質(zhì)量和濃度用超微量分光光度計檢驗，保證每個樣本的A260/A280值為 1.8～2.2，且A260/A230接近于2.0。去除基因組DNA 污染和第一鏈cDNA的合成采用TaKaRa 的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)(TaKaRa)。具體操作步驟均按照試劑盒的說明書進行。

1.5.2引物設(shè)計和RT-qPCR分析Cu/ZnSOD、CAT、APX、GR和Actin基因的引物序列根據(jù)NCBI的同源序列進行比對設(shè)計(表1)，ERF(c117307)、DREB1(c115634)、DREB2(c122138)、CSP(c117281)、SWEET(c121279)、HSP(c112042)基因的引物序列參照Zhang等[16]的報道。引物合成由金開瑞生物工程有限公司完成，純化方式為PAGE純化。每對引物在所有樣本均可擴增出單一的目的條帶，溶解曲線均為單峰。

實時定量PCR (RT-qPCR)分析采用LightCycle 96 (Roche)，熒光試劑用TaKaRa的試劑盒(SYBR? Premix DimerEraserTM)。反應(yīng)體系為20 μL，包含1.5 μL cDNA, 10 μL 2×SYBR? Premix DimerEraser, 上下游引物 (10 μmol/L)各0.6和 7.3 μL ddH2O。擴增程序為: 95 ℃ 預(yù)變性300 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)，隨后進行60～95 ℃的溶解曲線的繪制分析。基因相對表達量的計算采用2-ΔΔCt法[22]。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)單因素方差分析(ANOVA)，使用Duncan法以及LSD法在0.05顯著性水平進行差異顯著性分析，原始數(shù)據(jù)的基本處理和圖表繪制采用Microsoft Excel 2013。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對O2-·產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

如圖1所示，低溫脅迫可增加早熟禾O2-·產(chǎn)生速率和H2O2含量，除冷凍處理4 h (F-4 h)外，BJ(青海扁莖早熟禾)的O2-·產(chǎn)生速率在整個低溫處理期間均低于WY-2(草地早熟禾‘午夜2號’)。低溫適應(yīng)3 d 后(C-3 d)，BJ和WY-2的O2-·產(chǎn)生速率與處理前(0 h)均有所降低，但并無顯著性差異(P>0.05)。BJ的O2-·產(chǎn)生速率在冷凍處理4 h后達到最高值，為8.2 nmol/(min·g)，較處理前增加了19.3%。然而，冷凍處理2和8 h WY-2的O2-·產(chǎn)生速率均顯著高于0 h (P<0.05)，且冷凍處理2 h后的O2-·產(chǎn)生速率較0 h增加了80.4%。

BJ和WY-2的H2O2含量在整個處理期內(nèi)總體呈先增高后降低的趨勢(圖1)。BJ的H2O2含量在低溫適應(yīng)和冷凍處理初期(F-2h)有所增加，但與0 h 并無顯著性差異(P>0.05)，在冷凍處理8 h后，H2O2含量顯著增加(P<0.05)，并達到最大值。WY-2的H2O2含量在整個低溫處理期間均顯著高于0 h (P<0.05)，在冷凍處理2 h后就達到了最大值，為389.6 nmol/g，較0 h 增加了58.2%；在冷凍處理24 h后，H2O2含量顯著降低，但仍然高于0 h。

圖1 低溫脅迫對兩種早熟禾葉片組織O2-·產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響Fig.1 Effects of cold stress on O2-· generation rate and H2O2 content of the leaf tissue of two blue grass species C：低溫脅迫 Cold acclimation；F：冷凍脅迫 Frozen stress.豎線表示標(biāo)準(zhǔn)誤，不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。Vertical bars indicate mean±standard error (SE). Different lowercase letters represent significant difference at 0.05 level. The same below.

2.2 低溫脅迫對MDA含量的影響

圖2 低溫脅迫對兩種早熟禾葉片組織MDA含量的影響Fig.2 Effects of cold stress on MDA content of the leaf tissue of two blue grass species

如圖2所示，低溫脅迫可導(dǎo)致BJ和WY-2葉片內(nèi)MDA(丙二醛)含量的持續(xù)增加，BJ的MDA含量在整個處理期間均顯著低于WY-2 (P<0.05)。BJ和WY-2的MDA含量在冷凍脅迫24 h (F-24 h)后均達到了最大值，分別為78.8和161.8 nmol/g，較0 h分別增加了50.0%和115.3%，即冷凍處理24 h后WY-2的MDA增長量是BJ的2.3倍。

2.3 低溫脅迫對抗氧化酶活性的影響

BJ和WY-2葉片內(nèi)不同種類的抗氧化酶對低溫脅迫的響應(yīng)存在一定的差異(圖3)。低溫脅迫可導(dǎo)致BJ和WY-2的SOD活性降低，低溫適應(yīng)3 d可顯著降低BJ 的SOD活性(P<0.05)，WY-2的SOD活性較0 h雖有所降低，但未達到顯著性差異(P<0.05)。BJ的SOD活性在冷凍脅迫4 h后降到最小，較0 h降低了80%；在冷凍處理8 h后BJ的SOD活性有小幅的上升，但仍顯著低于0 h (P<0.05)。WY-2的SOD活性在冷凍處理2 h降到最低，較0 h降低了68.6%；在冷凍處理8 h后，WY-2的SOD活性較2 h顯著增加(P<0.05)，且與0 h無顯著性差異(P>0.05)。

BJ 的CAT活性隨著低溫處理時間的延長呈先增加后降低的趨勢，而 WY-2 的CAT活性則呈先降后升再降的趨勢(圖3)。同時，在整個低溫處理過程中，WY-2 的CAT活性整體要高于BJ。

BJ和WY-2的APX、GR活性對低溫脅迫響應(yīng)的敏感性較SOD和CAT的低，在冷凍處理8 h之前的整個低溫處理期內(nèi)，這兩種材料葉片內(nèi)的APX和GR活性與0 h均無顯著性差異，WY-2的GR活性甚至在整個低溫處理期間均沒有顯著的變化(P>0.05)。WY-2的APX活性在冷凍處理24 h后顯著低于0 h，較0 h降低了81.3%。BJ的GR活性在冷凍處理8 h后顯著低于0 h，較0 h降低了52.4%，WY-2的GR活性雖然在整個低溫處理期間并沒有顯著性的變化，但是一直維持在比較高的水平。

圖3 低溫脅迫對兩種早熟禾葉片組織抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effects of cold stress on antioxidant enzyme activity of the leaf tissue of two blue grass species

2.4 低溫脅迫對抗氧化酶相關(guān)基因表達的影響

低溫脅迫引起B(yǎng)J和WY-2的抗氧化酶相關(guān)基因的表達上調(diào)，BJ的Cu/ZnSOD、CAT、APX和GR相對表達量普遍高于WY-2(圖4)。除WY-2的Cu/ZnSOD相對表達量隨著低溫處理時間的延長逐漸增加外，BJ和WY-2的CAT、APX、GR相對表達量以及BJ的Cu/ZnSOD相對表達量均隨著處理時間的延長呈先增加后降低的趨勢。BJ和WY-2的CAT相對表達量均在冷凍脅迫2 h后達到最高，此時BJ的CAT相對表達量是WY-2的2.7倍；當(dāng)冷凍脅迫8 h后，CAT相對表達量逐漸接近于0 h的相對表達量。BJ的APX相對表達量在冷凍處理4 h后最高，是0 h的46.6倍，而WY-2的APX相對表達量在低溫適應(yīng)3 d后最高，是0 h相對表達量的12.3倍。BJ和WY-2的GR相對表達量在低溫適應(yīng)3 d后最高，分別為0 h相對表達量的15.3和9.1倍；在冷凍脅迫處理期間BJ的GR相對表達量均接近于低溫適應(yīng)后的值，WY-2的GR相對表達量在冷凍處理24 h后有明顯的降低。

2.5 低溫脅迫對逆境相關(guān)基因表達的影響

圖4 低溫脅迫對兩種早熟禾葉片組織抗氧化酶基因表達量的影響Fig.4 Effects of cold stress on relative expression level of antioxidant enzyme genes of the leaf tissue of two blue grass species 圖中短線表示同一時間點的兩個平均值間的最小顯著差異。下同。The bar in the Figure presents the least significant difference between the means in the same time point. The same below.

圖5 低溫脅迫對兩種早熟禾葉片組織逆境脅迫相關(guān)基因相對表達量的影響Fig.5 Effects of cold stress on relative expression level of stress-related genes of the leaf tissue of two blue grass species

如圖5所示， 低溫脅迫可誘導(dǎo)早熟禾葉片內(nèi)逆境相關(guān)基因(ERF、DREB1、DREB2、CSP、SWEET、HSP)的上調(diào)或下調(diào)表達。BJ與WY-2葉片內(nèi)的ERF相對表達量對低溫脅迫的響應(yīng)截然相反，即BJ的ERF在低溫脅迫后是上調(diào)的，而WY-2的ERF則是下調(diào)的；BJ的ERF相對表達量在低溫脅迫期間呈先升后降的趨勢，在冷凍處理4 h后最高，是0 h的21.8倍；WY-2的ERF相對表達量在冷凍脅迫2 h后最低，是0 h的9%。BJ與WY-2葉片內(nèi)的DREB2相對表達量對低溫脅迫的響應(yīng)與ERF的表達情況正好相反，其在BJ葉片內(nèi)是下調(diào)的，而WY-2葉片內(nèi)出現(xiàn)十分明顯的上調(diào)表達，在冷凍處理2 h后，其表達量是0 h的91.4倍。

BJ的CSP、SWEET、HSP相對表達量在低溫脅迫期間均高于WY-2，具體的表達調(diào)控方式在BJ與WY-2間同樣存在明顯的差異(圖5)。SWEET除BJ低溫適應(yīng)3 d后有明顯的上調(diào)外，其余處理時間均與0 h相近，無明顯的上調(diào)或下調(diào)表達。BJ的CSP和HSP在整個低溫脅迫期間均明顯出現(xiàn)了上調(diào)表達，而WY-2的CSP則沒有出現(xiàn)明顯的表達調(diào)控。BJ和WY-2的DREB1表達調(diào)控對低溫脅迫的響應(yīng)基本相似，呈先升后降再升的趨勢，且WY-2的DREB1相對表達量高于BJ。

綜上所述，BJ葉片內(nèi)的ERF、DREB1、CSP和HSP在低溫脅迫后均表現(xiàn)出明顯的上調(diào)表達，且ERF、CSP和HSP的相對表達量高于WY-2；低溫處理后DREB2在BJ葉片內(nèi)是下調(diào)表達的，SWEET對低溫脅迫的敏感性較低，表達調(diào)控不明顯。

3 討論

3.1 低溫脅迫對早熟禾氧化損傷的影響

在正常生長情況下，植物細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species ROS，包括O2-·，OH·和H2O2等)的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡；當(dāng)植物體遭受到各種逆境脅迫時，這種動態(tài)平衡就會被打破，導(dǎo)致ROS的不斷積累[23-24]，從而引起細胞結(jié)構(gòu)性損傷。而植物對逆境脅迫的抗性，常常與逆境下對ROS的清除能力有關(guān)[25]。同時，ROS包括自由基的積累會啟動膜脂過氧化反應(yīng)，使膜內(nèi)脂雙分子層中含有的不飽和脂肪酸鏈降解，從而對細胞膜的完整性產(chǎn)生破壞，這一反應(yīng)伴隨著過氧化產(chǎn)物MDA 積累[11,26-27]。本研究表明，BJ(青海扁莖早熟禾)和WY-2(草地早熟禾‘午夜2號’)在遭受到低溫脅迫時會引起H2O2含量和O2-·產(chǎn)生速率的增加，其 WY-2葉片內(nèi)ROS積累的程度高于BJ；同時，低溫脅迫也引起B(yǎng)J和WY-2葉片內(nèi)MDA含量的增加，且BJ的MDA含量在整個脅迫過程中始終低于WY-2，這兩個結(jié)果同時說明BJ受短期的低溫脅迫的損害程度較WY-2低，對低溫具有較強的耐受性?；葜衩返萚28]的研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫可導(dǎo)致葡萄幼苗體內(nèi)H2O2、OH·的含量及O2-·的產(chǎn)生速率、MDA 的含量的增加，本研究結(jié)果與其相似。Prasad等[29]使用低溫處理玉米4 h，出現(xiàn)H2O2積累峰值，處理18 h后過氧化氫酶出現(xiàn)峰值，此時H2O2含量已下降至初始值，此與本研究中H2O2含量和O2-·產(chǎn)生速率先升高后降低的趨勢相符。

3.2 低溫脅迫下早熟禾的抗氧化酶防御系統(tǒng)

植物在長期的進化過程中形成了一套復(fù)雜而精密的系統(tǒng)以保證自身體內(nèi)ROS產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡[11]。抗氧化酶類催化的一系列酶促反應(yīng)是植物體內(nèi)ROS清除最直接和有效的方法，這些抗氧化酶主要有超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)等[30]。SOD和CAT位于植物體內(nèi)ROS清除體系的最前線，這兩種酶不僅可以阻止更多ROS的形成，還在細胞內(nèi)H2O2信號傳導(dǎo)過程中扮演著必不可少的角色[31]。APX和GR 則參與AsA-GSH循環(huán)中，通過維持抗壞血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)在細胞內(nèi)的含量來清除ROS[32]。

Kazemi-Shahandashti 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，鷹嘴豆(Cicerarietinum)的抗氧化酶在抵御短期的低溫脅迫時呈現(xiàn)出相互協(xié)同的作用。本研究表明，在WY-2和BJ遭受到低溫脅迫時，SOD活性均出現(xiàn)了下降，說明植物體內(nèi)ROS的清除系統(tǒng)已啟動。BJ葉片內(nèi)的CAT和APX活性表現(xiàn)為先上升后下降，而WY-2葉片CAT活性表現(xiàn)為先下降后上升又下降，且WY-2以上各酶變化幅度均大于BJ，說明BJ體內(nèi)抗氧化酶的調(diào)節(jié)能力強于WY-2。而GR活性在BJ葉片內(nèi)始終低于WY-2，低溫脅迫初期并無明顯變化，在冷凍處理8 h才出現(xiàn)了顯著降低，表明谷胱甘肽調(diào)節(jié)途徑啟動較晚。各種氧化酶的變化時間不同說明葉片內(nèi)抗氧化酶的相互協(xié)同作用來防御短期的低溫脅迫，先是SOD，再是CAT和APX，最后是GR。此外，在酶活性降低的同時，植物體內(nèi)應(yīng)激發(fā)相應(yīng)的基因表達來產(chǎn)生抗氧化酶。本研究對低溫脅迫期間早熟禾葉片內(nèi)的抗氧化酶基因表達分析后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)早熟禾遭受到脅迫時抗氧化酶基因的相對表達量出現(xiàn)了顯著升高，WY-2抗氧化酶相關(guān)基因的相對表達量要普遍高于BJ，此與WY-2酶系統(tǒng)活性變化幅度較大相符，也同時說明了BJ的抗氧化調(diào)節(jié)能力強于WY-2。其他關(guān)于草坪草響應(yīng)低溫脅迫的研究同樣表明低溫脅迫可導(dǎo)致抗氧化酶活性(SOD，CAT和APX)的下降[13-14]，而與抗氧化酶活性降低相對應(yīng)的是抗氧化酶相關(guān)基因的上調(diào)表達[15]。

基因轉(zhuǎn)錄和表達水平跟品種，組織類型、脅迫強度和脅迫事件等密切相關(guān)，因此抗氧化酶基因的表達情況相對比較復(fù)雜[33]。本研究中各抗氧化酶相關(guān)基因表達升高均早于抗氧化酶活性的變化，跟酶活性不呈一致性，這一點尤其表現(xiàn)在GR的酶活性在脅迫初期基本與0 h沒有顯著性差異，而GR的相對表達量則在低溫適應(yīng)和冷凍脅迫期間較0 h有明顯的提高。在草地早熟禾響應(yīng)干旱和鹽堿脅迫時同樣觀察到了這種抗氧化酶活性與相關(guān)基因的表達量不一致的情況[27,34-35]，造成這種不一致性的可能原因是這種酶的活性是由轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用控制的，而不是直接由轉(zhuǎn)錄水平所決定[35]。

3.3 低溫脅迫下早熟禾逆境相關(guān)基因的表達情況

低溫脅迫可引起一系列與誘導(dǎo)冷調(diào)節(jié)蛋白基因相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這些冷調(diào)節(jié)蛋白基因包括CBF(C-repeat binding factor)，又稱作DREB(dehydration responsive element binding protein)轉(zhuǎn)錄因子，其屬于ERF乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子家族，多個報道表明CBF基因的表達與植物低溫脅迫能力有關(guān)[36-37]。Zhang等[16]用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對低溫脅迫下草地早熟禾抗寒相關(guān)基因進行了分析，CBFs是草地早熟禾響應(yīng)低溫脅迫的重要轉(zhuǎn)錄因子，同時，SWEET(sugars will eventually be exported transporter)蛋白、HSP(熱激蛋白)和CSP(冷激蛋白)基因也參與草地早熟禾響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。SWEET基因被稱作糖運輸?shù)鞍谆?，糖運輸在植物滲透調(diào)節(jié)和抗逆性能中起到重要作用，并且過表達AtSWEET16的擬南芥表現(xiàn)出較強的抗凍能力[38]。HSP在植物受到各種逆境脅迫時均會出現(xiàn)過表達，在植物遇到低溫脅迫時也不例外[39]。

本研究表明，BJ葉片內(nèi)的DREB1、CSP和HSP在低溫脅迫后均表現(xiàn)出明顯的上調(diào)表達，且變化程度明顯大于這些基因在WY-2葉片內(nèi)的表達變化。ERF在BJ葉片內(nèi)呈明顯的上調(diào)表達，DREB2卻下調(diào)表達，與Zhang 等[16]的研究結(jié)果相似，而WY-2葉片內(nèi)ERF表達下調(diào)，DREB2呈上調(diào)表達。此結(jié)果表明ERF和DREB2的轉(zhuǎn)錄表達情況可能與BJ具有較強的耐寒性有很大關(guān)系。

4 結(jié)論

短期的低溫脅迫可引起午夜二號草地早熟禾和青海扁莖早熟禾葉片內(nèi)活性氧的積累和MDA含量的增加，扁莖早熟禾活性氧的積累程度和MDA含量均低于午夜二號。同時，低溫脅迫可導(dǎo)致兩種早熟禾葉片內(nèi)的抗氧化酶活性的變化和引發(fā)抗氧化酶相關(guān)基因的上調(diào)表達，并且引起一些冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)表達。扁莖早熟禾抗氧化酶活性并非都強于午夜二號，但其酶相關(guān)基因變化幅度均大于午夜二號，且其一部分冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子均較午夜二號大幅度上調(diào)表達，這些基因變化可能與BJ具有較強的耐寒性有很大的關(guān)系。然而，本研究只是對BJ和WY-2響應(yīng)短期低溫脅迫的抗氧化系統(tǒng)和一些逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子進行了初步的研究，有關(guān)BJ和WY-2在高海拔地區(qū)的越冬情況是否存在差異以及這兩種材料響應(yīng)低溫脅迫的代謝和分子機理有待進一步的研究。

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EffectoffreezingstressonROSmetabolismandcold-inducedgenesinPoapratensisvar.ancepscv.Qinghai

SHI Yi1, NIU Kui-Ju1, YU Qian-Qian2, LIU Wen-Hui3, MA Hui-Ling1*

1.CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation;Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China; 2.CollageofHorticulture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510640,China; 3.KeyLaboratoryofSuperiorForageGermplasmintheQinghai-TibetanPlateau,QinghaiAcademyofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,Xining810016,China

To explore the mechanism of cold tolerance ofPoapratensisvar.ancepscv. Qinghai (BJ) plants were exposed to cold acclimation (10/5 ℃) for 3 d followed by freezing stress (-10 ℃) for 24 h, withP.pratensisvar. ‘Midnight II’ (WY-2) as control, and ROS accumulation, antioxidant enzyme activity and stress related gene expression were monitored. Rate of the production of O2-·, levels of H2O2and MDA, activity of SOD, CAT, APX, GR and the relative expression of the antioxidant enzyme genes were measured, as well as several cold induced genes. The results demonstrated that freezing stress increased the O2-·production rate, and H2O2and MDA levels in both BJ and WY-2. ROS accumulation and MDA content of BJ were lower than those in WY-2. SOD, APX and GR activity was depressed by freezing stress in BJ, while CAT activity initially increased and then decreased. Only APX in BJ showed higher activity than that in WY-2. At the same time, the expression levels ofCu/ZnSOD,CAT,APXandGRrelated genes were increased in the two varieties. The relative expression of the enzyme related genes in BJ was higher than WY-2. The cold induced gene DREB2 was down-regulated in BJ, while theERF,DREB1,CSP, andHSPgenes were up-regulated. Among these genes,ERF,CSPandHSPshowed higher expression levels in BJ than in WY-2. In conclusion, the accumulation of ROS in BJ was lower than that in WY-2 under cold and freezing stress. Meanwhile antioxidant enzyme related genes and cold related transcription factors showed higher relative expression levels in BJ than in WY-2 under cold and freezing stress. Those differences may contribute to the higher cold tolerance of BJ.

Poapratensisvar.ancepscv. Qinghai; kentucky bluegrass; ROS; antioxidant enzyme; gene expression

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SHI Yi, NIU Kui-Ju, YU Qian-Qian, LIU Wen-Hui, MA Hui-Ling. Effect of freezing stress on ROS metabolism and cold-induced genes inPoapratensisvar.ancepscv. Qinghai. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(12): 98-107.

2017-02-17；改回日期：2017-05-04

國家自然科學(xué)基金(31160482)資助。

史毅(1987-)，女，甘肅蘭州人，在讀博士。E-mail：shiyi214@126.com*通信作者Corresponding author. E-mail：mahl@gsau.edu.cn