吳蓮鳳， 陸 紅， 洪煒龍， 張 行， 劉樂(lè)平， 白永恒△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心， 2肝膽胰外科實(shí)驗(yàn)室， 浙江 溫州 325000)

M1/M2型巨噬細(xì)胞極化參與腎組織炎癥損傷和修復(fù)進(jìn)程*

吳蓮鳳1， 陸 紅1， 洪煒龍2， 張 行2， 劉樂(lè)平2， 白永恒2△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，2肝膽胰外科實(shí)驗(yàn)室， 浙江 溫州 325000)

目的研究M1/M2型巨噬細(xì)胞在腎組織炎癥損傷和修復(fù)進(jìn)程中的分布趨勢(shì)及作用。方法將45只雄性SD大鼠隨機(jī)分為缺血再灌注損傷(IRI)組和單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)組兩部分。IRI組分為假手術(shù)(sham)組及術(shù)后0、6、24和72 h組；UUO組分為sham組及梗阻3、7和14 d組；每個(gè)時(shí)相5只大鼠。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐和尿素氮水平；HE與免疫組織化學(xué)染色分別觀察腎組織損傷及CD68的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M1(CD68+、F4/80+和CD16/32+)和M2(CD68+、F4/80+和CD206+)型巨噬細(xì)胞的分布；ELISA檢測(cè)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。結(jié)果IRI早期，腎組織損傷程度隨再灌時(shí)間延長(zhǎng)而加劇，并與CD68+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)呈一致性變化趨勢(shì)；至24 h，組織損傷與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)最為嚴(yán)重；但之后隨時(shí)間延長(zhǎng)，損傷和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)反而減輕。UUO組中，腎損傷隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)而加劇，14 d時(shí)纖維化明顯；而巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)第7天最為嚴(yán)重，之后又有減輕。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示IRI和UUO損傷早期浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞以M1型為主，iNOS表達(dá)較高；IRI和UUO損傷后期巨噬細(xì)胞均向M2型極化，Arg-1水平明顯增加；巨噬細(xì)胞這種變化趨勢(shì)與腎組織在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)出現(xiàn)損傷與修復(fù)表征存在明顯相關(guān)性。深入分析發(fā)現(xiàn)，M1型巨噬細(xì)胞可通過(guò)誘導(dǎo)TNF-α高表達(dá)促進(jìn)早期炎癥損傷，M2型巨噬細(xì)胞通過(guò)提高TGF-β1水平促進(jìn)后期纖維增生性修復(fù)。結(jié)論UUO和IRI過(guò)程中均存在巨噬細(xì)胞極化：M1型巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)早期損傷，M2型巨噬細(xì)胞則參與損傷后期的纖維性修復(fù)。M1和M2型巨噬細(xì)胞在損傷修復(fù)過(guò)程中的極化特征可為臨床治療提供指導(dǎo)。

輸尿管梗阻； 缺血再灌注損傷； M1型巨噬細(xì)胞； M2型巨噬細(xì)胞； 極化

巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)腎小球和小管間質(zhì)是絕大多數(shù)腎損傷的主要病理特征[1]。巨噬細(xì)胞作為一類(lèi)可塑性和異質(zhì)性很強(qiáng)的細(xì)胞群體，在體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境中，可被極化成M1和M2兩種不同的表型，并具備不一樣的生理學(xué)功能[2]。目前，巨噬細(xì)胞這兩種活化表型在腎組織損傷和修復(fù)過(guò)程中的角色仍不十分清楚。研究發(fā)現(xiàn)：M1型巨噬細(xì)胞與腎損傷的誘導(dǎo)明顯相關(guān)，清除M1型巨噬細(xì)胞可降低腎損傷程度[3]；相反，M2型巨噬細(xì)胞可減少炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)[4]，可能為抗腎損傷的一種潛在治療工具。因此，研究不同活化表型巨噬細(xì)胞在腎損傷及修復(fù)過(guò)程中的變化趨勢(shì)及作用，對(duì)闡明疾病的分子機(jī)制及相關(guān)治療起到關(guān)鍵性作用。本研究以臨床上常見(jiàn)的缺血再灌注損傷 (ischemia-reperfusion injury，IRI)和單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)2種腎損傷類(lèi)型作為研究對(duì)象，通過(guò)比較不同活化表型的巨噬細(xì)胞在疾病不同時(shí)期的極化差異，明確巨噬細(xì)胞極化在腎損傷及修復(fù)過(guò)程中的作用。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物、試劑和儀器

45只雄性SD大鼠購(gòu)置于溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證編號(hào)為SCXK(溫)2013-0023，體重約220～240 g，飼養(yǎng)條件為(22±2) ℃室溫、12 h/12 h光暗環(huán)境、標(biāo)準(zhǔn)飼料進(jìn)食及自由飲水，隨機(jī)分為IRI組和UUO組。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)程序嚴(yán)格按照溫州醫(yī)科大學(xué)制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例執(zhí)行。

蘇木精-伊紅染色試劑(HE試劑，上海碧云天生物公司)；抗CD68單克隆抗體(Santa Cruz)；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、精氨酸酶1(arginase-1， Arg-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1， TGF-β1)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) ELISA檢測(cè)試劑盒(上海西唐生物公司)；流式抗體CD68、F4/80、CD16/32及CD206(BioLegend)。

FACSVerse流式細(xì)胞儀(BD)；Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能掃描儀(ThermoScientific)；DM4000 B LED熒光正置顯微鏡(Leica)；AU5800自動(dòng)化生化分析儀(Beckman Coulter)。

2 方法

2.1IRI模型的制備 將禁食1 d的IRI組大鼠，用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉。麻醉成功后常規(guī)消毒，于腹正中切口，分離右腎動(dòng)脈，將腎門(mén)處腎動(dòng)脈利用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉，不夾閉其側(cè)靜脈和輸尿管，腎臟由鮮紅色逐漸變?yōu)榘导t色，即表示缺血成功。后將腸管等恢復(fù)至腹腔內(nèi)，用血管鉗夾閉腹腔。45 min后再次打開(kāi)腹腔，去除動(dòng)脈夾，恢復(fù)血流，此時(shí)可見(jiàn)腎動(dòng)脈開(kāi)始充盈，并且由暗紅色逐漸變成鮮紅色，顯示再灌注成功，縫合腹壁。分別于術(shù)后0、6、24和72 h取腎組織，每個(gè)時(shí)相組5只大鼠，同時(shí)分離外周血清用于檢測(cè)肌酐和尿素氮水平。假手術(shù)組大鼠打開(kāi)腹腔，僅作分離右腎動(dòng)脈，但不進(jìn)行右腎動(dòng)靜脈及輸尿管的夾閉。

2.2UUO模型的制備 UUO組大鼠術(shù)前準(zhǔn)備同IRI組，10%水合氯醛成功麻醉后，常規(guī)消毒，腹正中線(xiàn)開(kāi)口，分離腎臟及輸尿管，將左側(cè)輸尿管靠近腎盂并與腎盂固定距離處進(jìn)行結(jié)扎，術(shù)中注意無(wú)菌操作，然后將腹內(nèi)臟器復(fù)位后，腹壁縫合。分別于術(shù)后3、7和14 d取腎組織，每個(gè)時(shí)相組5只大鼠，同時(shí)分離外周血清用于檢測(cè)肌酐和尿素氮水平；假手術(shù)組僅進(jìn)行分離腎臟及輸尿管，隨即縫合腹壁。

2.3HE染色 分別將2組模型大鼠腎臟按不同時(shí)相取出后，放入4%多聚甲醛中固定，然后進(jìn)行組織脫水、透明、浸蠟和包埋及切成組織切片，經(jīng)脫蠟、梯度乙醇脫水和HE染色，最后中性樹(shù)膠封片。通過(guò)顯微鏡觀察腎臟病理改變。

2.4免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CD68的表達(dá) 各組腎組織采用4%多聚甲醛固定后制成石蠟切片，連續(xù)進(jìn)行厚4 μm切片。CD68 I抗按1∶500稀釋。脫蠟至水，檸檬酸鹽高溫修復(fù)，以 II 抗相同來(lái)源的血清封閉。以I抗稀釋液代替I抗作為陰性對(duì)照，細(xì)胞內(nèi)或胞膜出現(xiàn)黃褐色為陽(yáng)性表達(dá)。最后檢測(cè)各組石蠟切片的平均吸光度(A)值(Image-Pro Plus 6.0軟件分析)。

2.5ELISA檢測(cè)iNOS、Arg-1、TGF-β1和TNF-α的含量 取200 mg腎組織，用2 mL的PBS進(jìn)行充分勻漿溶解，離心分離出上清液，制成100 g/L蛋白原液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用ELISA法，檢測(cè)樣品吸光度(A)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出樣本濃度。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化 取大鼠腎組織于生理鹽水中，無(wú)菌剪碎，用2.5 mL注射器將腎組織反復(fù)擠壓成勻漿，最后通過(guò)400目的鋼絲網(wǎng)，獲得單個(gè)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液為1×109/L，取標(biāo)本100 μL分別加入5 μL抗CD68、F4/80、CD16/32及CD206抗體，室溫下孵育25 min，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)試。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，方差分析中各組均數(shù)間的兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)；兩樣本關(guān)聯(lián)性比較采用相關(guān)性分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 IRI和UUO模型大鼠血肌酐和尿素氮水平的變化

與sham組相比，雖然IRI與UUO模型大鼠血肌酐和尿素氮水平在損傷后期有輕度增加，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。我們推測(cè)這與各模型組大鼠另一側(cè)腎發(fā)揮代償性作用有關(guān)。

Figure 1. The levels of serum creatinine and blood urea nitrogen in the kidneys of IRI and UUO rats. Mean±SD.n=5.

圖1IRI和UUO模型大鼠血肌酐與尿素氮水平

2 IRI模型大鼠腎組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度及CD68在其中的動(dòng)態(tài)表達(dá)

HE染色結(jié)果示，IRI模型中sham組腎小管及間質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、充血及水腫；在IRI 0 h時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞開(kāi)始腫脹，少數(shù)出現(xiàn)壞死；隨時(shí)間延長(zhǎng)，腎小管上皮細(xì)胞腫脹加劇，并出現(xiàn)凝固性壞死，呈空泡樣和顆粒樣變性，間質(zhì)明顯充血、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；在IRI 24 h時(shí)損傷程度最嚴(yán)重；而在IRI 72 h，腎小管損傷明顯減輕，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，提示組織進(jìn)入修復(fù)階段，見(jiàn)圖2A。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果示，與sham組相比，各時(shí)相IRI組織中CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量均升高；在IRI 24 h時(shí)，浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞達(dá)到最高值，之后下降；至IRI 72 h時(shí)，CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量較IRI 24 h明顯減少(P<0.05)，見(jiàn)圖2B、C。

3 UUO模型大鼠腎組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度及CD68在其中的動(dòng)態(tài)表達(dá)

HE染色結(jié)果示，與sham組相比，UUO組術(shù)后隨時(shí)間延長(zhǎng)，腎小管擴(kuò)張程度加劇，腎間質(zhì)面積明顯擴(kuò)大，在UUO 14 d時(shí)，腎皮質(zhì)已基本被間質(zhì)占據(jù)，提示梗阻后期出現(xiàn)纖維化表征；炎癥細(xì)胞在梗阻最初階段即有浸潤(rùn)，而后逐漸增加，UUO 7 d時(shí)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)最為明顯，但到14 d時(shí)，間質(zhì)炎癥細(xì)胞相對(duì)減少，這可能與間質(zhì)區(qū)域纖維基質(zhì)過(guò)度增生累積有關(guān)，見(jiàn)圖3A。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果可見(jiàn)，隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，腎組織中CD68+的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯升高；在UUO 7 d時(shí)，浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞達(dá)最高值，之后下降；在UUO 14 d時(shí)，CD68陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞數(shù)量較UUO 7 d明顯減少(P<0.05)，見(jiàn)圖3B、C。

4 M1和M2型巨噬細(xì)胞在IRI模型大鼠腎組織中的分布

IRI模型中，sham組巨噬細(xì)胞基本為M2型；IRI組0 h時(shí)，M1型相對(duì)含量開(kāi)始升高；到IRI 6 h時(shí)，M1型分布達(dá)最高值，而M2型相對(duì)含量則最低；之后，隨著缺血再灌時(shí)間延長(zhǎng)，M1型相對(duì)含量又開(kāi)始下調(diào)，M2型隨之升高(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 2. Tissue injury evaluated by HE staining (A,×200) and infiltration of CD68-positive macrophages determined by immunohistochemical staining (B and C,×400) in the kidneys of IRI rats. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsshan group.

圖2HE染色及免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)IRI模型大鼠腎損傷程度及CD68陽(yáng)性巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)

Figure 3. Tissue injury evaluated by HE staining (A，×200) and infiltration of CD68-positive macrophages determined by immunohistochemical staining (B and C，×400) in the kidneys of UUO rats. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group.

圖3HE染色及免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)UUO模型大鼠腎損傷程度及CD68+巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)

5 M1和M2型巨噬細(xì)胞在UUO模型大鼠腎組織中的分布

UUO模型中，sham組巨噬細(xì)胞基本為M2型；UUO組中，伴隨梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，M1型巨噬細(xì)胞相對(duì)含量明顯增加，而M2型不斷下調(diào)；到7 d時(shí)，M1型達(dá)高值，而M2型為低值；之后一直到梗阻14 d時(shí)，M1型巨噬細(xì)胞開(kāi)始下降，而M2型又開(kāi)始升高(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

6 巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物iNOS與Arg-1在IRI和UUO模型大鼠腎組織中含量的變化

在IRI組中，iNOS各時(shí)相的含量均較sham組高，并且高峰出現(xiàn)在IRI 24 h(P<0.05)；Arg-1各時(shí)相的活性表達(dá)與Sham組比較，先逐漸減低，至IRI 6 h最低，之后24 h又明顯增高(P<0.05)。在UUO組中，iNOS活性表達(dá)的峰值出現(xiàn)在UUO 3 d，之后出現(xiàn)遞減趨勢(shì)(P<0.05)；Arg-1各時(shí)相的活性表達(dá)與Sham組比較，先逐漸減低，至UUO 7 d最低，之后14 d又出現(xiàn)增高(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

Figure 4. Distribution of M1 and M2 macrophages in the kidneys of IRI rats determined by flow cytometry analysis. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group.

圖4流式細(xì)胞分析檢測(cè)M1和M2型巨噬細(xì)胞在IRI模型大鼠腎組織中的分布

Figure 5. The distribution of M1 and M2 macrophages in the kidneys of UUO rats determined by flow cytometry analysis. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group.

圖5流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè)M1和M2巨噬細(xì)胞在UUO模型大鼠腎組織中的分布

7 炎癥因子TNF-α及促纖維化因子TGF-β1在IRI和UUO模型腎組織中的表達(dá)

在IRI和UUO組中，炎癥因子TNF-α在損傷后隨即升高(P<0.05)，與損傷的時(shí)間無(wú)明顯的相關(guān)性；而促纖維化因子TGF-β1的含量雖然在損傷后表達(dá)開(kāi)始升高，尤其在UUO中、后期時(shí)增加更為明顯(P<0.05)，見(jiàn)圖7。這提示炎癥損傷在損傷過(guò)程中均發(fā)生，而纖維化表現(xiàn)在損傷后期才發(fā)生。

討 論

巨噬細(xì)胞是腎損傷發(fā)生過(guò)程中重要的炎癥細(xì)胞[1]。早期在動(dòng)物模型上進(jìn)行經(jīng)典的巨噬細(xì)胞損耗和補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)了巨噬細(xì)胞與腎損傷有著重要關(guān)系[5]；隨后的研究也證實(shí)了巨噬細(xì)胞不但可誘導(dǎo)腎損傷，而且也可能參與腎病的修復(fù)及緩解[6]。巨噬細(xì)胞在腎損傷中的這種生物學(xué)效應(yīng)差異與其表型異質(zhì)性有關(guān)。在不同的微環(huán)境下，巨噬細(xì)胞能極化為誘導(dǎo)炎癥損傷(M1型/經(jīng)典活化型)或促進(jìn)修復(fù)(M2型/替代活化型)兩種截然不同的功能狀態(tài)[2]。這兩種巨噬細(xì)胞不同活化表型可能參與了腎組織的炎癥損傷和修復(fù)進(jìn)程[7]。

Figure 6. The levels of iNOS and Arg-1 in the kidneys of IRI and UUO rats measured by ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham group.

圖6ELISA檢測(cè)IRI和UUO大鼠腎組織中iNOS及Arg-1的含量

Figure 7. The levels of TNF-α and TGF-β1 in the kidneys of IRI and UUO rats determined by ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSham group.

圖7ELISA檢測(cè)IRI和UUO大鼠腎組織中TNF-α和TGF-β1含量的變化

本研究構(gòu)建了IRI及UUO臨床上常見(jiàn)的兩種腎損傷模型(IRI模型為模擬損傷及修復(fù)過(guò)程，UUO模型為持續(xù)損傷過(guò)程)，從而觀察在腎損傷不同病理階段，不同極化亞型巨噬細(xì)胞參與極化的情況。雖然我們并未發(fā)現(xiàn)肌酐和尿素氮在損傷后水平明顯增加，但通過(guò)組織病理染色發(fā)現(xiàn)，IRI及UUO模型大鼠腎損傷程度隨時(shí)間延長(zhǎng)均呈現(xiàn)不同程度的損傷。在損傷早期，CD68陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量隨之損傷程度增加而增加；在IRI 24 h，浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞數(shù)量最多，此時(shí)腎損傷最為嚴(yán)重，之后腎損傷逐漸修復(fù)，CD68陽(yáng)性巨噬細(xì)胞數(shù)量也隨之減低；在UUO早期巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量與腎損傷程度呈現(xiàn)一致的變化趨勢(shì)，其在7 d時(shí)，浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞數(shù)量最多，損傷最嚴(yán)重，之后巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，但腎間質(zhì)出現(xiàn)明顯的纖維化表征。這些結(jié)果證實(shí)了IRI及UUO兩種腎損傷過(guò)程中都存在巨噬細(xì)胞的參與，這與之前的報(bào)道一致。炎癥損傷及修復(fù)機(jī)制可能與巨噬細(xì)胞向不同的M1和M2表型極化相關(guān)。

在損傷早期，浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞主要以M1表型為主。M1型巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，促進(jìn)一氧化氮的合成，并釋放各種炎癥因子如TNF-α、IL- 1及合成活化金屬酶等，造成腎小球固有細(xì)胞和基底膜損傷，進(jìn)而引起蛋白尿和腎小球炎癥[8]。我們實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了兩種模型動(dòng)物中TNF-α的表達(dá)水平出現(xiàn)不同程度的增加，提示TNF-α可能參與了M1型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥損傷過(guò)程。在損傷的后期，M1型巨噬細(xì)胞逐漸下降，相反地，M2型巨噬細(xì)胞明顯增加。IRI后期，腎組織表現(xiàn)為損傷修復(fù)，而UUO后期則表現(xiàn)為間質(zhì)纖維化。M2型巨噬細(xì)胞既可釋放抗炎因子抑制腎組織局部的炎癥損傷，同時(shí)也可以分泌TGF-β，抑制炎癥，促進(jìn)基質(zhì)累積，導(dǎo)致間質(zhì)的纖維化[9]。我們實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)IRI和UUO模型中TGF-β1表達(dá)水平明顯增加，尤其在UUO后期，這一變化趨勢(shì)與M2型巨噬細(xì)胞一致，提示TGF-β1可能參與了M2介導(dǎo)的組織修復(fù)及纖維化進(jìn)程。事實(shí)上，損傷適度且可控時(shí)，少量的基質(zhì)累積產(chǎn)生可能是有益的，可促進(jìn)組織修復(fù)；但在損傷為持續(xù)性且不可控狀態(tài)下，大量的基質(zhì)累積反而引起了間質(zhì)的纖維化。一方面，間質(zhì)纖維化引起了本研究觀察到的現(xiàn)象——浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞在腎組織單位面積上的減少，同時(shí)另一方面，我們推測(cè)腎損傷后出現(xiàn)纖維增生性修復(fù)這種差異性功能表現(xiàn)形式與M2型巨噬細(xì)胞有關(guān)[10]?？紤]到M2型巨噬細(xì)胞又可細(xì)分為M2a、M2b和M2c，這些亞型可能決定了巨噬細(xì)胞在不同微環(huán)境中的功能狀態(tài)[7]，故在未來(lái)的研究中，需要深入分析這些亞型的表型特征及功能，以進(jìn)一步明確其在腎損傷修復(fù)中的作用。

總而言之，在腎損傷及修復(fù)過(guò)程中，巨噬細(xì)胞極化起著關(guān)鍵的作用。M1型可誘導(dǎo)早期炎癥損傷，M2型則參與損傷后期的纖維性修復(fù)。M1和M2型巨噬細(xì)胞在損傷修復(fù)過(guò)程中的極化特征不僅可為分子機(jī)制的闡明提供理論依據(jù)，同時(shí)也為臨床治療提供一定的指導(dǎo)意義。

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M1/M2 macrophage polarization is involved in inflammatory injury and repair process of renal tissues

WU Lian-feng1, LU Hong1, HONG Wei-long2, ZHANG Xing2, LIU Le-ping2, BAI Yong-heng2

(1DepartmentofLaboratoryMedicine，2LaboratoryofHepato-Pancreato-BiliarySurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:baiyongheng@hotmail.com)

AIM: To investigate the distribution and mechanism of M1/M2 macrophages in inflammatory injury and repair process of renal tissues.METHODSSD male rats (n=45) were randomly divided into 2 parts: ischemia-reperfusion injury (IRI) and unilateral ureteral obstruction (UUO) renal injury. The rats with IRI were divided into sham operation group and operation groups (0, 6, 24, and 72 h after operation), and the rats with UUO were divided into sham operation group and operation groups (3, 7 and 14 d after operation). Automatic biochemical analyzer was used to detect serum levels of creatinine and urea nitrogen. The degree of renal injury in IRI group and UUO group were detected by HE staining. The expression of CD68 was examined by immunohistochemical staining. The levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS)， arginase-1 (Arg-1), transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were measured by ELISA. The polarizations of M1 (CD68+, F4/80+and CD16/32+) and M2 (CD68+, F4/80+and CD206+) macrophages were analyzed by flow cytometry.RESULTSIn IRI group, the infiltration of CD68+macrophages and the degree of injury were increased with the prolongation of time in the renal tissues. At 24 h, the tissue injury and macrophage infiltration were the most serious, but then decreased. At 72 h, the tissue damage and CD68+macrophage infiltration were significantly reduced. In UUO group, obstructive injury was increased with the prolongation of time, and at 14 d， marked fibrous hyperplasia occurred. The infiltration of CD68+macrophages at 7 d was the most serious, but then reduced at 14 d. Flow cytometry analysis showed that M1 macrophages were the majority in the early stages of UUO and IRI, and the result of ELISA identified the higher level of iNOS. At the late stage of injury, the M1 macrophages were decreased, while the M2 macrophages were increased with higher level of Arg-1. M1 macrophage-mediated early injury was due to the induction of TNF-α expression， and M2 macrophage-mediated later recovery was due to enhancing TGF-β1 levels.CONCLUSIONThe polarization of M1 and M2 macrophages is involved in the processes of UUO and IRI. M1 macrophages play a key role in early injury, and M2 macrophages contribute to the late stage of fibrotic repair. The polarization of macrophages during renal injury and repair provides a guiding significance for the clinical treatment.

Ureteral obstruction; Ischemia-reperfusion injury; M1 macrophages; M2 macrophages; Polarization

1000- 4718(2017)12- 2245- 07

2017- 06- 27

2017- 10- 01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81772264)；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. LY17H050005； No. LQ16H310005)；溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. Y20140402)

△通訊作者 Tel： 0577-55579309； E-mail： baiyongheng@hotmail.com

R691.6； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.021

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)