夏子榮， 李 青， 夏 珍， 李菊香， 洪 葵， 吳延慶， 吳清華， 程曉曙

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 江西 南昌 330006)

剪切修復(fù)基因XPD抑制Ox-LDL誘導(dǎo)人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖*

夏子榮， 李 青， 夏 珍， 李菊香△， 洪 葵， 吳延慶， 吳清華， 程曉曙

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 江西 南昌 330006)

目的探討剪切修復(fù)基因——著色性干皮病D組基因(XPD)在氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)促血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制。方法將重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HUASMCs)，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、空載質(zhì)粒pEGFP-N2組、重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組、Ox-LDL組、Ox-LDL+pEGFP-N2組和Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD組。用MTT法和EdU法測(cè)定各組細(xì)胞的增殖率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期分布；利用Western blot法檢測(cè)XPD、caspase-3、Bcl-2 和Bax 的蛋白水平。結(jié)果Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，pEGFP-N2/XPD組的XPD表達(dá)增加(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功；MTT和EdU檢測(cè)結(jié)果顯示，pEGFP-N2/XPD組的細(xì)胞增殖率較空白對(duì)照組降低(P<0.05)；與Ox-LDL組比較，Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD組細(xì)胞增殖明顯被抑制(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，pEGFP-N2/XPD 組的S期細(xì)胞比例明顯減少(P<0.05)，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增多(P<0.05)；與Ox-LDL組比較，Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD組的S期細(xì)胞比例減少(P<0.05)，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增多(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，pEGFP-N2/XPD組的cleaved caspase-3和Bax 蛋白水平增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與Ox-LDL組比較，Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD組的cleaved caspase-3和Bax蛋白水平增加(P<0.01)，Bcl-2 蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。結(jié)論XPD能抑制HUASMCs的增殖并促其凋亡，還能抑制Ox-LDL的促HUASMCs增殖作用，有可能成為抗動(dòng)脈粥樣硬化治療的靶點(diǎn)。

著色性干皮病D組基因； 氧化低密度脂蛋白； 人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞； 動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)過度增殖是促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵因素。研究表明，小劑量的氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein， Ox-LDL)即可直接或間接誘惑血管平滑肌細(xì)胞增殖，Ox-LDL在動(dòng)脈粥樣硬化的形成過程中起著重要的作用[1]。因此，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖可能阻止AS的進(jìn)程。著色性干皮病D組蛋白(xeroderma pigmentosum D, XPD)是轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)ⅡH 9個(gè)亞基中的一個(gè)[2-3]。XPD可以激活DNA損傷檢控點(diǎn)，在核酸剪切修復(fù)中起重要作用，從而增加基因的穩(wěn)定性，進(jìn)而防止基因突變和疾病的產(chǎn)生[4-5]。目前對(duì)剪切修復(fù)基因XPD的研究，主要與腫瘤的發(fā)生及核酸剪切修復(fù)途徑中基因功能的缺失密切相關(guān)[6]。XPD除了在核苷酸切除修復(fù)和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮主要作用外，還參與抑制細(xì)胞增殖與促進(jìn)凋亡。因此，我們?cè)O(shè)想剪切修復(fù)基因XPD參與了抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在抑制AS的形成過程中起作用，可從中尋找抗AS的新途徑。本研究將重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human umbilical arterial smooth muscle cells，HUASMCs)，并給予Ox-LDL處理XPD高表達(dá)HUASMCs，觀察細(xì)胞增殖和凋亡的變化，探討XPD對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖作用的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

HUASMCs購自上海中喬新舟生物科技有限公司；本實(shí)驗(yàn)用到的空載質(zhì)粒pEGFP-N2及重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD由南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科張吉翔教授贈(zèng)予，pEGFP-N2/XPD通過PCR反應(yīng)、酶切及基因測(cè)序鑒定；DMEM 高糖培養(yǎng)基及胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自HyClone；Ox-LDL購自廣州奕源生物科技公司；DMSO購自Ameresco；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自 Invitrogen；抗XPD、cleave caspase-3、Bcl-2 和Bax抗體購自Cell Signaling Technology；抗β-actin 抗體購自Santa Cruz；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購自北京中杉；EdU(C10310-1)購自廣州市銳博生物科技有限公司；MTT購自北京索萊寶科技有限公司。

2 方法

2.1HUASMCs的培養(yǎng) HUASMCs用含12% FBS和雙抗(1×105U/L的青霉素和100 mg/L的鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于細(xì)胞玻璃培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、95%空氣濕度、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和Ox-LDL誘導(dǎo)HUASMCs增殖模型的建立 將上述培養(yǎng)的HUASMCs于轉(zhuǎn)染前1 d，用不含抗生素的培養(yǎng)基按每孔1.5×105的密度種于6孔板中。24 h后，待細(xì)胞融合度達(dá)約50%時(shí)可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別將每孔8 μg的空載質(zhì)粒pEGFP-N2及重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD稀釋于250 μL不含血清的培養(yǎng)基中，輕輕混勻。每孔加入10 μL的LipofectamineTM2000，用不含血清培養(yǎng)基稀釋(每孔250 μL)，輕輕混勻后在室溫下孵育5 min。將混合稀釋好的質(zhì)粒分別與稀釋好的LipofectamineTM2000輕輕混勻，室溫下孵育20 min形成復(fù)合物。用PBS清洗細(xì)胞，每孔加入2 mL不含抗生素的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后換有血清的培養(yǎng)基常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后提取各孔細(xì)胞的蛋白，通過Wes-tern blot實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染效果。

將HUASMCs 以5×107/L 接種在96孔板，每孔均為100 μL，并設(shè)置調(diào)零孔(只加培養(yǎng)液)。加入不同濃度(0、6.25、12.5、25、50和100 mg/L)的Ox-LDL ，得出最佳濃度后給予不同作用時(shí)間(0、6、12、24和36 h)得出最佳作用時(shí)間，并設(shè)正常對(duì)照組，每組6個(gè)平行孔。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、空載質(zhì)粒pEGFP-N2組、重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組、Ox-LDL組、Ox-LDL+pEGFP-N2組和Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD組。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均取用轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞。

2.3MTT法和EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 將對(duì)數(shù)生長期的 HUVSMCs以適量(因培養(yǎng)時(shí)間不同，確保行MTT檢測(cè)時(shí)細(xì)胞鋪至80%左右)接種于5塊 96孔板，每孔均為100 μL，并設(shè)置一調(diào)零孔(加等量培養(yǎng)液)，加入MTT約4 h后，棄上清液，每孔再加入 150 μL的 DMSO，用錫箔紙遮蓋避光，在搖床上振蕩10 min，使紫藍(lán)色結(jié)晶充分溶解。酶標(biāo)儀在492 nm 處測(cè)定各孔吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

同時(shí)采用EdU法檢測(cè)Ox-LDL對(duì)HUASMCs增殖的影響。以每孔4×103個(gè)細(xì)胞的密度種于96孔板，細(xì)胞貼壁后根據(jù)不同分組，給予重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD及空載體轉(zhuǎn)染，根據(jù)試劑盒進(jìn)行EdU標(biāo)記、細(xì)胞固定化及DNA染色，在熒光顯微鏡下計(jì)算染色細(xì)胞核占相應(yīng)總細(xì)胞的百分比，每組6個(gè)復(fù)孔。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 用PBS液洗滌細(xì)胞2次，吸去殘余液體。用不含EDTA的胰酶消化(注意胰酶不可過度消化細(xì)胞)，加培養(yǎng)基終止消化，獲得約2×105～1×106的細(xì)胞數(shù)量，用500 μL孵育緩沖液懸浮細(xì)胞，至暗室中，加1 mL試劑A及10 μL試劑B，振蕩5～10 s，室溫下避光反應(yīng)30 min后，使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。

2.5Western blot法檢測(cè)蛋白水平 在各組試劑作用24 h后吸凈6孔板內(nèi)培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS沖洗3次，加入細(xì)胞裂解200 μL，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，以每孔100 μg上樣，經(jīng)12% SDS-PAGE分離蛋白，蛋白轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉-TBST封閉 2h，分別用抗XPD、caspase-3、Bcl-2、Bax和β-actin的 I 抗(1∶1 000)孵育，4 ℃過夜，再加 II 抗孵育2 h，0.1% Tween-TBS洗3次，每次10 min顯色后置入Bio-Rad Image Lab成像系統(tǒng)中曝光成像。將圖片導(dǎo)出用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析每組條帶，結(jié)果表示為：(目的條帶灰度值-背景灰度值)/β-actin的灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)6次。采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組數(shù)據(jù)總體差異的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染效果

HUASMCs轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Western blot 檢測(cè)，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組中XPD表達(dá)明顯增高(P<0.01)，說明重組質(zhì)粒 pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染成功，見圖1。

Figure 1. The protein expression of XPD in HUASMCs after plasmid transfection determined by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后XPD在HUASMCs中的表達(dá)

2 Ox-LDL和XPD對(duì)HUASMCs增殖的影響

不同濃度的Ox-LDL孵育HUASMCs，使用MTT和EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖率，各組比較50 mg/L效果最佳，50 mg/L與100 mg/L比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。采用50 mg/L Ox-LDL孵育HUASMCs 6、12、24和36 h，24 h組效果最佳，24 h與36 h比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們選擇50 mg/L Ox-LDL孵化HUASMCs 24 h構(gòu)建模型，見圖2。

EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，Ox-LDL處理組的細(xì)胞增殖率明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)，而pEGFP-N2/XPD組的細(xì)胞增殖率明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)；Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD組細(xì)胞增殖明顯低于Ox-LDL組(P<0.05)；空白對(duì)照組與空載質(zhì)粒pEGFP-N2組細(xì)胞增殖的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Ox-LDL處理組與Ox-LDL+pEGFP-N2組細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Ox-LDL和XPD對(duì)細(xì)胞周期分布的影響

與對(duì)照組比較，pEGFP-N2/XPD組的S期細(xì)胞比例減少(P<0.05)，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增多(P<0.05)；與對(duì)照組比較，Ox-LDL組的S期細(xì)胞比例增多(P<0.05)，G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少(P<0.05)；與Ox-LDL組比較，Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD組S期細(xì)胞比例減少(P<0.05)，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增多(P<0.05)；對(duì)照組與空載質(zhì)粒pEGFP-N2組之間相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；Ox-LDL組與Ox-LDL+pEGFP-N2組及之間相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4及表1。

Figure 2. Dose-dependent and time-dependent effects of Ox-LDL on the proliferation of HUASMCs. A: MTT assay was used to detect the viability of the cells exposed to various concentrations of Ox-LDL; B: MTT assay was used to detect the viability of the cells incubated with Ox-LDL (50 mg/L) for various periods; C and D: EdU assay was used to detect the cell proliferation (×100). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (0 mg/L or 0 h) group；#P<0.05vs25 mg/L Ox-LDL group；△P<0.05vs12 h group.

圖2Ox-LDL促HUASMCs增殖作用的時(shí)間和劑量相關(guān)性

Figure 3. The proliferation ability of the HUASMCs transfected with pEGFP-N2/XPD and treated with Ox-LDL was detected by EdU assay (×100). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsOx-LDL group.

圖3EdU檢測(cè)pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染和Ox-LDL處理后HUASMCs增殖能力的變化

Figure 4. The cell cycle distribution of the HUASMCs analyzed by flow cytometry.

圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期的分布

表1Ox-LDL與XPD過表達(dá)對(duì)HUASMCs細(xì)胞周期的影響

Table 1. The changes of cell cycle distribution of HUASMCs transfected with pEGFP-N2/XPD and treated with Ox-LDL (%. Mean±SD.n=6)

GroupG0/G1phaseSphaseControl62.31±3.6123.12±2.47pEGFP-N261.57±3.2322.75±2.53pEGFP-N2/XPD76.82±4.83*15.68±3.46*Ox-LDL51.19±3.95*38.42±3.63*Ox-LDL+pEGFP-N250.76±3.6737.91±3.97Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD70.96±4.73#21.09±4.02#

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsOx-LDL group.

4 Western blot法檢測(cè)cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白水平

與空白對(duì)照組相比，pEGFP-N2/XPD組HUVSMCs中 Bax及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；與對(duì)照組比較，Ox-LDL組中Bax及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與Ox-LDL組比較，Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD組中Bax及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；對(duì)照組與pEGFP-N2組之間相比無顯著差異；Ox-LDL組與Ox-LDL+pEGFP-N2組及之間相比無顯著差異，見圖5、6。

討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，在高齡、高血脂、糖尿病及吸煙等AS的各種危險(xiǎn)因素下，VSMCs過度增殖是導(dǎo)致AS發(fā)生發(fā)展的一個(gè)極其重要的環(huán)節(jié)[7]。研究表明，小劑量的Ox-LDL即可直接或間接導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖，因此Ox-LDL 在動(dòng)脈粥樣硬化的形成過程中起著十分重要的作用[8-9]。本研究使用Ox-LDL刺激HUASMCs增殖，模擬AS的發(fā)生，通過MTT和EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖率比值，發(fā)現(xiàn)50 mg/L Ox-LDL孵化HUASMCs 24 h增殖效果最佳。

研究發(fā)現(xiàn)XPD在參與機(jī)體DNA損傷修復(fù)并維持基因組穩(wěn)定性中起十分重要作用，XPD是TFⅡH的組份之一，TFⅡH在哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)錄起始和核酸剪切修復(fù)中起重要作用，XPD作為一種ATP依賴的DNA解螺旋酶，是連接TFⅡH核心亞基與CDK-活化蛋白激酶的橋梁，參與單核苷酸剪切修復(fù)途徑。XPD的表達(dá)及功能缺陷可能導(dǎo)致機(jī)體不能有效修復(fù)突變基因，同時(shí)具有上調(diào)癌基因及下調(diào)抑癌基因的作用功能，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。XPD除了在核苷酸切除修復(fù)和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮主要作用外，還參與了抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖與促進(jìn)凋亡[11]。

本文假設(shè)XPD能抑制Ox-LDL介導(dǎo)的HUASMCs過度增殖，同時(shí)促進(jìn)其凋亡。因此將重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染HUASMCs后，使XPD表達(dá)升高，給予Ox-LDL 刺激HUASMCs增殖，觀察HUASMCs的凋亡與增殖變化情況。結(jié)果顯示，Ox-LDL能抑制HUASMCs的凋亡并促進(jìn)其增殖；但XPD高表達(dá)能抑制Ox-LDL的促增殖及抗凋亡作用。

Figure 5. The protein expression of Bcl-2， Bax and Bcl-2/Bax in HUASMCs transfected with pEGFP-N2/XPD and treated with Ox-LDL. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOx-LDL group.

圖5pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染和Ox-LDL處理后HUASMCs中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平及Bcl-2/Bax的變化

Figure 6. The protein level of cleaved caspase-3 in HUASMCs transfected with pEGFP-N2/XPD and treated with Ox-LDL. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsOx-LDL group.

圖6pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染和Ox-LDL處理后HUASMCscleavedcaspase-3蛋白水平的變化

本研究使用Ox-LDL刺激HUASMCs增殖，模擬AS的發(fā)生。上調(diào)XPD表達(dá)能抑制Ox-LDL的促進(jìn)增殖及抑制凋亡作用，這種現(xiàn)象提示我們可能通過上調(diào)VSMCs中的XPD表達(dá)來控制及治療AS的發(fā)生及發(fā)展。抑凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax在凋亡的各個(gè)階段起調(diào)節(jié)作用，是參與細(xì)胞凋亡調(diào)控關(guān)鍵的基因，Bcl-2表達(dá)上調(diào)和Bax表達(dá)下調(diào)可以認(rèn)為是凋亡被抑制[12]。本文發(fā)現(xiàn)在HUASMCs中，Ox-LDL可下凋Bax的表達(dá)并上調(diào)Bcl-2的表達(dá)；XPD高表達(dá)能上調(diào)Bax及下調(diào)Bcl-2 ，并且抑制Ox-LDL的上調(diào)Bcl-2及下調(diào)Bax的作用。

Caspase-3在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮極其重要的作用。Caspase-3被激活是細(xì)胞凋亡發(fā)生的標(biāo)志酶。而Bcl-2 蛋白可以通過抑制細(xì)胞色素C 與Apof-1結(jié)合從而抑制caspases 活化，通過抑制caspase-3過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[13-14]。同時(shí)caspase-3 具有裂解Bcl-2蛋白的作用，產(chǎn)生的裂解產(chǎn)物可激活下游caspase 而導(dǎo)致級(jí)聯(lián)反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)XPD能抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的Bcl-2上調(diào)及caspase-3下調(diào)。XPD促進(jìn)HUASMCs凋亡作用可能與上調(diào)caspase-3有關(guān)。

綜上所述，XPD能抑制HUASMCs的增殖并促進(jìn)其凋亡，還能抑制Ox-LDL的促HUASMCs增殖和抗凋亡作用，可能成為治療AS新的靶點(diǎn)，為AS治療提供新的思路。

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Effect of xeroderma pigmentosum group D gene on proliferation of human umbilical arterial smooth muscle cells induced by Ox-LDL

XIA Zi-rong, LI Qing, XIA Zhen, LI Ju-xiang, HONG Kui, WU Yan-qing, WU Qin-hua, CHENG Xiao-shu

(DepartmentofCardiovascularMedicine,TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:ljx912@126.com)

AIM: To investigate the effects of xeroderma pigmentosum group D (XPD) gene on the proliferation of human umbilical arterial smooth muscle cells (HUASMCs) induced by oxidized low-density lipoprotein (Ox-LDL).METHODSThe recombinant plasmid pEGFP-N2/XPD was transfected into HUASMCs by liposome. The cells were divided into blank control group, pEGFP-N2 group, pEGFP-N2/XPD group, Ox-LDL group, Ox-LDL+pEGFP-N2 group and Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD group. The proliferation rate of the cells was detected by MTT and EdU assays. The apoptotic rate and cell cycle distribution were analyzed by flow cytometry. The protein levels of XPD, caspase-3, Bcl-2 and Bax were determined by Western blot.RESULTSCompared with blank control group, the expression of XPD was increased in pEGFP-N2/XPD group (P<0.05). According to the results of MTT and EdU assays, the cell proliferation in pEGFP-N2/XPD group was reduced compared with blank control group (P<0.05). Compared with Ox-LDL group, the cell proliferation in Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD group was significantly inhibited (P<0.05). According to the results of flow cytometry, the cell proportion of S phase decreased and the G0/G1-phase cell proportion increased significantly in pEGFP-N2/XPD group and Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD group compared with blank control group and Ox-LDL group, repectively (P<0.05). Compared with blank control group and Ox-LDL group, the protein level of Bcl-2 decreased and the protein levels of Bax and cleaved caspase-3 increased in pEGFP-N2/XPD group and Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD group, respectively (P<0.05).CONCLUSIONXPD inhibits the proliferation of HUASMCs and promotes their apoptosis, and reduces the promoting effect of Ox-LDL on the proliferation of HUVSMCs. XPD may be the target for treatment of atherosclerosis.

Xeroderm pigmentosum group D gene; Oxidized low-density lipoprotein; Human umbilical arterial smooth muscle cells; Atherosclerosis

1000- 4718(2017)12- 2238- 07

2017- 01- 18

2017- 08- 08

江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2010GZY0254)

△通訊作者Tel: 13657092311; E-mail: ljx912@126.com

R543.1； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.020

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)