鄭禮平， 張 楠， 梁翠微， 杜均祥， 龔五星

(珠海市人民醫(yī)院， 暨南大學(xué)附屬珠海醫(yī)院腫瘤科， 廣東 珠海 519000)

miR-221通過下調(diào)PTEN促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞增殖

鄭禮平△， 張 楠， 梁翠微， 杜均祥， 龔五星

(珠海市人民醫(yī)院， 暨南大學(xué)附屬珠海醫(yī)院腫瘤科， 廣東 珠海 519000)

目的探討微小RNA-221(miR-221)對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響及其相關(guān)作用機(jī)制。方法通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 把miR-221 mimics轉(zhuǎn)染入肺癌細(xì)胞A549 內(nèi)，RT-qPCR檢測miR-221和PTEN mRNA的表達(dá)；Western blot檢測PTEN蛋白表達(dá)；CCK-8及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力。構(gòu)建含PTEN3’-UTR的螢光素酶報(bào)告載體，檢驗(yàn)miR-221對PTEN的靶向調(diào)控作用。結(jié)果轉(zhuǎn)染miR-221后肺癌細(xì)胞中miR-221表達(dá)水平明顯高于對照組及空白組(P<0.01)，PTEN mRNA及蛋白表達(dá)均顯著下降(P<0.05)；細(xì)胞增殖及集落形成能力明顯增強(qiáng)(P<0.05);miR-221能抑制PTEN的螢光素酶活性。結(jié)論miR-221能夠抑制肺癌A549細(xì)胞中PTEN的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞增殖。

肺癌； A549細(xì)胞； 微小RNA-221； PTEN蛋白； 細(xì)胞增殖

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢，對人類健康造成重大影響。2015年我國肺癌新發(fā)病例達(dá)73.3萬，死亡病例為61萬，發(fā)病率和死亡率均排在我國惡性腫瘤的首位[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一組進(jìn)化保守的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，是人體內(nèi)普遍表達(dá)的小型基因調(diào)控因子[2-3]。miRNA能與靶基因mRNA的互補(bǔ)序列結(jié)合，調(diào)控體內(nèi)多種蛋白的表達(dá)，對細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等產(chǎn)生重要影響[4]。miR-221基因定位在X染色體p11.3區(qū)的1 kb區(qū)域內(nèi)，屬于成簇分布的miRNA基因。研究發(fā)現(xiàn)miR-221在乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌等多種腫瘤均有高表達(dá)[5-7]，提示miR-221可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。我們前期運(yùn)用RT-qPCR技術(shù)檢測了10例肺癌組織及癌旁正常組織中miR-221的表達(dá)，結(jié)果顯示癌組織中miR-221是癌旁正常組織中的4.23倍。本課題通過研究miR-221過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制，為肺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

肺癌細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所;RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco;PTEN抗體購自Abcam；miR-221 mimics和miR-NC購自上海吉瑪制藥；CCK-8試劑購自日本同仁化學(xué)研究所；雙螢光素酶檢測試劑盒購自Promega;RNA提取試劑Trizol和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen。

2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

肺癌A549細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃、5% CO2、相對濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中。在細(xì)胞生長接近于90%融合時(shí)，用胰酶將細(xì)胞消化，并吹打成單細(xì)胞懸液后收集離心，然后用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，制成5×108/L的懸液。將細(xì)胞轉(zhuǎn)種于6孔培養(yǎng)板中,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在細(xì)胞融合為80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前2h更換成無血清的新鮮培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染miR-221 mimics；對照(control)組，轉(zhuǎn)染miR-NC；空白(blank)組，單用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染24～48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)檢測。

3 主要方法

3.1RT-qPCR檢測磷酸酶和張力蛋白同源蛋白(phosphatase and tensin homolog protein,PTEN)mRNA及miR-221的表達(dá) 在轉(zhuǎn)染24 h后，通過Trizol法進(jìn)行各組細(xì)胞總RNA的提取，后通過紫外分光光度計(jì)來檢測RNA的濃度以及純度，控制RNA的純度在1.8～2.0左右。按照RT-qPCR試劑盒給出的操作說明書進(jìn)行cDNA的合成。擴(kuò)增反應(yīng)條件設(shè)置為：95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s，55℃ 延伸20 s，72℃退火20 s，40個(gè)循環(huán)，以U6作為內(nèi)參照。運(yùn)用2-ΔΔCt法進(jìn)行運(yùn)算分析。

3.2Western blot檢測PTEN蛋白的表達(dá) 在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后，按照說明書進(jìn)行總蛋白的提取，BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定。取各樣品50 μg，進(jìn)行SDS-PAGE分離，其后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶于搖床上室溫封閉1 h；加入PTEN抗體和GAPDH抗體，在4℃孵育過夜。于次日用TBST在室溫漂洗3次；同樣方法稀釋Ⅱ抗，室溫孵育1 h，TBST進(jìn)行3次漂洗，最后用ECL化學(xué)發(fā)光法試劑盒進(jìn)行顯影及曝光。

3.3CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將上述3組對數(shù)期的A549細(xì)胞接種在96孔板內(nèi)，每孔1 000個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別在轉(zhuǎn)染10、20、30、40、50、60 h后，置換成不含血清的新鮮培養(yǎng)基。后向每孔加入10 μL CCK-8試劑，于37 ℃孵育2 h后終止培養(yǎng)。酶標(biāo)儀測定450 nm的吸光度(A)，每組平行重復(fù)5孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

3.4平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 按LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后用胰酶把細(xì)胞吹散為單細(xì)胞懸液，1 000/孔接種于平皿，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后用多聚甲醛進(jìn)行固定，1%結(jié)晶紫染色，流水緩慢清洗后于自然環(huán)境干燥。顯微鏡下計(jì)算克隆形成數(shù)(含有50個(gè)細(xì)胞以上的集落為1個(gè)克隆):克隆形成率(%)=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

3.5雙螢光素酶報(bào)告基因檢測 合成含有能夠和相應(yīng)miR-221互補(bǔ)結(jié)合的靶基因PTEN3’-UTR序列片段及突變的3’-UTR序列片段。將這2個(gè)片段分別克隆至pGL3-Luciferase基因下游的多克隆位點(diǎn)上。將A549細(xì)胞以4×108/L接種在6孔板中。將螢光素酶報(bào)告載體與miR-221 mimics及對照序列miR-NC進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，按LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行。在轉(zhuǎn)染48 h后將細(xì)胞收集處理，根據(jù)Promega公司雙螢光素酶報(bào)告基因進(jìn)行檢測。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-221 mimics轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中miR-221表達(dá)升高

RT-qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-221 mimics能夠顯著提高A549細(xì)胞中miR-221的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組miR-221表達(dá)量較空白組明顯升高(P<0.01)；對照組和空白組間miR-221含量無明顯差異，見圖1。

Figure 1. The miR-221 expression in lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖1肺癌A549細(xì)胞中miR-221的表達(dá)

2 miR-221抑制PTEN的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組PTEN的mRNA表達(dá)水平較空白組明顯下降，比值是0.33±0.08(P<0.05)；對照組和空白組間mRNA含量無明顯差異，見圖2。取PTEN/GAPDH的灰度值比值作為蛋白的相對表達(dá)水平，空白組灰度值為1，實(shí)驗(yàn)組及對照組分別為0.31±0.09和0.95±0.11。Western blot顯示實(shí)驗(yàn)組PTEN蛋白水平較對照組和空白組明顯降低(P<0.05),見圖3。

Figure 2. The mRNA expression of PTEN in lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖2肺癌A549細(xì)胞PTEN的mRNA表達(dá)

Figure 3. The protein expression of PTEN in lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖3肺癌A549細(xì)胞PTEN蛋白的表達(dá)

3 miR-221促進(jìn)A549細(xì)胞增殖

CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示,轉(zhuǎn)染miR-221 mimics的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在30～60 h，吸光度明顯高于對照組及空白組(P<0.05)；而對照組及空白組間無明顯差異，見圖4。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,miR-221 mimics組集落形成數(shù)比對照組和空白組明顯增加(P<0.05)，而對照組與空白組集落形成數(shù)量之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見圖5。

4 PTEN是miR-221的下游靶基因

運(yùn)用生物信息學(xué)軟件TargetScan進(jìn)行靶基因預(yù)測，顯示PTEN可能是miR-221的下游靶基因。雙螢光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示，在含野生型PTEN的3’-UTR序列細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-221 mimics組與對照組相比，螢光素酶活性明顯下降(P<0.05)；而在含突變型PTEN的3’-UTR序列細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組與對照組和空白組的螢光素酶活性無明顯差異,見圖6。

Figure 4. Proliferation curves of lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖4肺癌A549細(xì)胞的增殖曲線

Figure 5. Flat plate colony formation test results of lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖5肺癌A549細(xì)胞的克隆形成率

Figure 6. The effect of miR-221 on the target sequence ofPTENdetected by luciferase enzymatic activity. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖6螢光素酶活性檢測miR-221對PTEN靶序列的作用

討 論

miRNA是人體內(nèi)長度約22個(gè)核苷酸的非編碼雙鏈小RNA。 miRNA能與相應(yīng)的信使RNA的互補(bǔ)序列結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[8]。在多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程都存在miRNA的表達(dá)異常。根據(jù)miRNA對腫瘤細(xì)胞的影響，將其分為致癌miRNA和抑癌miRNA。研究發(fā)現(xiàn)，即使是同一種miRNA在不同的腫瘤中表達(dá)也會(huì)有差異，有時(shí)甚至截然不同，對腫瘤細(xì)胞的影響也千差萬別[9]。前期我們運(yùn)用PCR技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)miR-221在肺癌組織中表達(dá)較癌旁正常組織明顯增加，提示miR-221可能在肺癌的發(fā)展中起重要作用。

miR-221在人類組織及細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)比較早、存在范圍廣泛，并且在多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)其表達(dá)異常，其作用得到了越來越多的重視。研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中miR-221含量較正常肝細(xì)胞明顯升高，其負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子CDKN1B/p27以及CDKN1C/p57，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[10]。Pallante等[11]通過微陣列芯片分析甲狀腺癌組織及正常甲狀腺組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-221在癌組織中顯著升高；而沉默miR-221表達(dá)后，癌細(xì)胞的增殖水平明顯降低。在本研究中，在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-221 mimics后，肺癌細(xì)胞增殖能力明顯升高；集落形成數(shù)比對照組、空白組均明顯增加。這與我們前期發(fā)現(xiàn)miR-221在肺癌組織中表達(dá)增加是吻合的。

為了進(jìn)一步確定miR-221的下游作用靶點(diǎn)，我們運(yùn)用了公認(rèn)的TargetScan靶基因預(yù)測軟件，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，提示第10號(hào)染色體缺失的PTEN可能是其作用靶點(diǎn)之一。PTEN是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的有磷酸酶活性的抑癌基因，其編碼的蛋白含有脂質(zhì)磷酸酶及蛋白磷酸酶的雙重特異性酶活性，與腫瘤的關(guān)系密切[12]。研究發(fā)現(xiàn)在肺癌中PTEN表達(dá)的缺失會(huì)導(dǎo)致其不能抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)肺癌的發(fā)展[13]。在人白血病K562細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PTEN后，細(xì)胞生長明顯受到抑制，且能增強(qiáng)青蒿琥酯的抑癌作用[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miR-221 mimics后肺癌細(xì)胞中PTEN蛋白及mRNA表達(dá)明顯下降，且雙螢光素酶報(bào)告基因進(jìn)一步確定了PTEN為miR-221的下游靶基因。miR-221抑制PTEN表達(dá)后會(huì)如何影響下游信號(hào)通路還需我們進(jìn)一步地研究。

綜上所述，本研究通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染使miR-221在肺癌細(xì)胞中過表達(dá)，檢測細(xì)胞的增殖能力，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。研究結(jié)果表明miR-221能夠抑制PTEN的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖。本研究揭示肺癌中miR-221調(diào)控的新機(jī)制，有望為肺癌的治療提供可能的作用靶點(diǎn)。

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miR-221 promotes proliferation of lung cancer A549 cells by down-regulating PTEN

ZHENG Li-ping, ZHANG Nan, LIANG Cui-wei, DU Jun-xiang, GONG Wu-xing

(DepartmentofOncology,ZhuhaiPeople’sHospital,ZhuhaiHospitalAffiliatedtoJinanUniversity,Zhuhai519000,China.E-mail:zlpzs1987@126.com)

AIM: To explore the effect of microRNA-221 (miR-221) on the proliferation of lung cancer A549 cells， and to investigate its mechanism.METHODSThe A549 cells were transfected with miR-221 mimics by Lipofectamine 2000. The expression of miR-221 was detected by RT-qPCR. The expression of PTEN at mRNA and protein le-vels was detected by RT-qPCR and Western blot, respectively. The cell proliferation was examined by CCK-8 assay and colony formation assay. The 3’-UTR ofPTENwas cloned into luciferase reporter vector and its enzymatic activity was detected to verify whether miR-221 targeted toPTEN.RESULTSThe expression level of miR-221 in the A549 cells was significantly increased after transfection with miR-221 mimics as compared with negative control group and blank group (P<0.01). The mRNA and protein levels of PTEN were significantly down-regulated compared with control group and blank group (P<0.05). In addition, miR-221 over-expression significantly promoted the proliferation of A549 cells (P<0.05). Moreover, miR-221 inhibited the enzymatic activity of luciferase reporter vector ofPTEN.CONCLUSIONOver-expression of miR-221 significantly promotes the proliferation ability of human lung cancer A549 cells by down-regulation of PTEN.

Lung cancer; A549 cells; MicroRNA-221; PTEN protein; Cell proliferation

1000- 4718(2017)12- 2208- 04

2017- 05- 15

2017- 05- 27

△通訊作者 Tel: 0756-2158932; E-mail: zlpzs1987@126.com

R734.2; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.015

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)