林 潔， 陳小巖， 李潔羽， 王麗萍， 陳惠玉， 林萬(wàn)松△

(1福建省立醫(yī)院病理科， 福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院， 福建 福州 350001； 2福建省腫瘤醫(yī)院腫瘤免疫學(xué)研究室， 福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院， 3福建省轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350014)

FERMT2在肝癌組織中的表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控*

林 潔1， 陳小巖1， 李潔羽2, 3， 王麗萍1， 陳惠玉1， 林萬(wàn)松2, 3△

(1福建省立醫(yī)院病理科， 福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院， 福建 福州 350001；2福建省腫瘤醫(yī)院腫瘤免疫學(xué)研究室， 福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，3福建省轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350014)

目的觀察fermitin家族同源蛋白2(FERMT2)在肝細(xì)胞癌(HCC)組織中的表達(dá)，并以體外實(shí)驗(yàn)分析FERMT2基因敲除對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)及相關(guān)調(diào)控分子表達(dá)的影響。方法采用real-time PCR及免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FERMT2在HCC及癌旁正常肝組織中的表達(dá)情況；采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建FERMT2基因敲除的穩(wěn)定MHCC97H細(xì)胞系，通過(guò)WST-1法和流式細(xì)胞術(shù)比較其與野生型MHCC97H細(xì)胞活力、細(xì)胞周期和凋亡狀態(tài)的改變，并采用Western blot檢測(cè)相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果FERMT2在HCC組織中的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于癌旁組織，且FERMT2蛋白的高表達(dá)與HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)(P<0.05)；成功構(gòu)建了FERMT2基因敲除的穩(wěn)定MHCC97H細(xì)胞系；與野生型細(xì)胞相比，F(xiàn)ERMT2基因敲除后細(xì)胞活力明顯減弱，S期細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞凋亡增加，且細(xì)胞內(nèi)增殖細(xì)胞核抗原、細(xì)胞周期蛋白及細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶2的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)；細(xì)胞凋亡抑制因子survivin及Bcl2的表達(dá)也明顯下降(P<0.05)，并可檢測(cè)到cleaved caspase-3。結(jié)論FERMT2在肝癌組織中呈高表達(dá)，它可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白及抗凋亡蛋白的表達(dá)影響肝癌細(xì)胞的活力、細(xì)胞周期及凋亡，進(jìn)而在肝癌形成及發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促癌作用。

肝細(xì)胞癌； CRISPR/Cas9技術(shù)； Fermitin家族同源蛋白2； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞周期； 細(xì)胞凋亡

Fermitin家族同源蛋白2(fermitin family homolog 2，F(xiàn)ERMT2)，又稱(chēng)Kindlin-2，屬于細(xì)胞質(zhì)中fermitin家族成員，由位于人染色體14q22.1的FERMT2基因所編碼。FERMT2與整合素(integrin)相互作用，參與早期肌形成和胚胎發(fā)育等重要生理過(guò)程[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ERMT2在胃癌、食管癌和膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)[3-8]，可通過(guò)多種信號(hào)途徑調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡[5-6， 9-10]。有研究報(bào)道FERMT2可能是肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者預(yù)后不良的一個(gè)指標(biāo)[11]，但其在HCC發(fā)生發(fā)展中的具體作用及相關(guān)分子機(jī)制還不明確。本研究采用real-time PCR及免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)技術(shù)檢測(cè)FERMT2在HCC及癌旁正常肝組織中的表達(dá)情況，并分析其與HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系，采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建FERMT2基因敲除的穩(wěn)定肝癌細(xì)胞系MHCC97H，并比較其與野生型MHCC97H細(xì)胞活力、細(xì)胞周期和凋亡狀態(tài)的變化以及相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)情況，初步探討FERMT2對(duì)HCC發(fā)生發(fā)展的作用。

材 料 和 方 法

1 病理組織標(biāo)本及材料

收集福建省立醫(yī)院肝膽外科2015年1月～2015年6月期間手術(shù)切除的HCC組織及相應(yīng)的癌旁正常肝組織標(biāo)本30例，其中男性25例，女性5例，患者年齡35～77歲，中位年齡59歲。所有患者術(shù)前均未行放療、化療、肝動(dòng)脈栓塞或生物治療。標(biāo)本離體取材后分為2份，1份在液氮中速凍后，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，留待提取組織mRNA；另1份立即固定于10%中性福爾馬林溶液，常規(guī)脫水、石蠟包埋、HE染色，于顯微鏡下觀察證實(shí)為原發(fā)性HCC。癌旁肝組織距離腫瘤2 cm以上，且顯微鏡下證實(shí)無(wú)癌細(xì)胞。對(duì)患者隨訪至2017年6月，獲得完整復(fù)發(fā)情況資料30例，其中術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)病例23例。復(fù)發(fā)定義為臨床影像學(xué)和/或病理學(xué)證實(shí)原發(fā)部位再次出現(xiàn)腫瘤或遠(yuǎn)隔部位出現(xiàn)腫瘤。

人HCC細(xì)胞系MHCC97H購(gòu)于復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所；293T細(xì)胞及stbl3感受態(tài)細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；LentiCRISPRv2載體、psPAX2和pMD2G慢病毒包裝載體購(gòu)于Addgene；BsmB I 購(gòu)于Fermentas；WST-1細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Roche；細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于BD；抗FERMT2鼠單克隆抗體購(gòu)于Millipore；抗增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)鼠單克隆抗體(2586)、抗細(xì)胞凋亡抑制因子survivin兔單克隆抗體(2808)、抗Bcl-2兔多克隆抗體(2872)、抗caspase-3兔單克隆抗體(9665)、抗周期蛋白依賴(lài)性激酶2(cyclin-dependent kinases 2， CDK2)兔單克隆抗體(2546)、抗p-CDK2兔多克隆抗體(2561)、抗細(xì)胞周期蛋白B1(cyclin B1)兔單克隆抗體(12231)及HRP標(biāo)記的羊抗兔 II 抗(7074)購(gòu)于CST；抗cyclin A1+A2兔單克隆抗體(ab185619)、抗cyclin E1兔單克隆抗體(ab33911)、抗GAPDH鼠單克隆抗體(ab8245)及HRP標(biāo)記的羊抗鼠 II 抗(ab97023)購(gòu)于Abcam。

2 方法

2.1Real-time PCR實(shí)驗(yàn) 用TRIzol試劑提取HCC及相應(yīng)癌旁肝組織總RNA，經(jīng)55 ℃、 30 min逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照LightCycler 480 SYBR Green定量PCR試劑盒(Roche)說(shuō)明配制反應(yīng)液，在Roche LightCycler 480 PCR儀上運(yùn)行，循環(huán)參數(shù)為95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。FERMT2的上游引物序列為 5’-TGAAATCTGGCTTCGTTGT-3’，下游引物序列為5’-CTCGCTGTTATCTGCTTGT-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-GCCGCATCTTCTTTTGCGTC-3’，下游引物序列為5’-TACGACCAAATCCGTTGACTCC-3’。以2-ΔΔCt法計(jì)算HCC及癌旁肝組織中FERMT2的相對(duì)表達(dá)量。

2.2免疫組織化學(xué)染色 采用EliVisionTMPlus二步法，予HCC與癌旁肝組織以抗FERMT2抗體(1∶100)進(jìn)行 I 抗孵育。免疫組化染色結(jié)果由2名病理醫(yī)師在不參考臨床病理資料的情況下對(duì)染色強(qiáng)度及染色范圍進(jìn)行評(píng)定。染色強(qiáng)度在表達(dá)最強(qiáng)的區(qū)域按著色程度評(píng)分：無(wú)著色為0分、淡染色為1分、中強(qiáng)染色為2分、強(qiáng)染色為3分；染色范圍按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例評(píng)分：≤10% 為0分、11%～25% 為1分、26%～50% 為2分、51%～75% 為3分、≥76% 為4分。染色總分≥3分為蛋白高表達(dá)，<3分為蛋白低/無(wú)表達(dá)。

2.3細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，使用含10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)MHCC97H、293T及stbl3細(xì)胞。

2.4小向?qū)NA(small-guide RNA， sgRNA)靶點(diǎn)選擇及設(shè)計(jì) 查詢(xún)Pubmed的GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得FERMT2基因序列號(hào)為NM_006832，基因大小為2 043 bp。FERMT2基因有3個(gè)異構(gòu)體，3者N端序列一致，差別在于中間和C端序列，且其第1外顯子(exon)主要為mRNA的5’端非翻譯區(qū)(5’-UTR)，因此設(shè)計(jì)的sgRNA靶向其第2外顯子。進(jìn)入sgRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站(http://crispr.mit.edu/)，輸入FERMT2基因的exon2序列，根據(jù)結(jié)果選取前3個(gè)得分最高的sgRNA序列進(jìn)行載體構(gòu)建，同時(shí)在靶位點(diǎn)上、下游各設(shè)計(jì)1條鑒定引物，用于后續(xù)PCR或測(cè)序檢測(cè)陽(yáng)性克隆，sgRNA及引物序列見(jiàn)表1。

表1靶向FERMT2基因的sgRNA和鑒定引物序列

Table 1. Three small-guide RNA (sgRNA) sequences targetingFERMT2 and the primer sequences for verifying clones withFERMT2 knockout

NameThesequencehFERMT2-sgRNA-F1CACCGCAGATGGCTGCTACGCGGAChFERMT2-sgRNA-R1AAACGTCCGCGTAGCAGCCATCTGChFERMT2-sgRNA-F2CACCGCGCGGTTCAGGTCCGTCACAhFERMT2-sgRNA-R2AAACTGTGACGGACCTGAACCGCGChFERMT2-sgRNA-F3CACCGTCAGGGTGACATCGCGGTTChFERMT2-sgRNA-R3AAACGAACCGCGATGTCACCCTGAChKindlin2-genomic-FCTGCGAATTCGGTGGGAThKindlin2-genomic-RTTCTCAAATGGGCCCCTC

2.5構(gòu)建重組質(zhì)粒 LentiCRISPRv2單載體系統(tǒng)已包含hSpCas9表達(dá)盒，用限制性核酸內(nèi)切酶BsmB I單切空載體，將線性化的載體與sgRNA連接，常規(guī)轉(zhuǎn)化，挑取克隆，用PCR測(cè)序鑒定所構(gòu)建的質(zhì)粒。

2.6病毒包裝 將LentiCRISPRv2質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2G按3∶2∶1的比例混合，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，12 h后換液，于48 h和72 h分別收集上清液，離心，0.45 μm濾器過(guò)濾獲得病毒液，濃縮后保存于-80 ℃以備后用。

2.7FERMT2基因敲除的穩(wěn)定HCC細(xì)胞系的建立及鑒定 將上述制備的病毒液感染MHCC97H細(xì)胞(MOI=10)，72 h后用嘌呤霉素(終濃度為2 mg/L)篩選穩(wěn)定細(xì)胞系，未感染病毒的細(xì)胞作為對(duì)照組也使用相同濃度的嘌呤霉素處理；3～4 d后待對(duì)照組細(xì)胞全部死亡，停止加藥，將病毒感染的細(xì)胞稀釋成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，并確保每孔最多1個(gè)細(xì)胞，每3～5 d換液1次；生長(zhǎng)20～25 d后，待單克隆細(xì)胞長(zhǎng)滿，接種于24孔板；繼續(xù)生長(zhǎng)10 d左右，將24孔板內(nèi)的細(xì)胞一分為二，其中一份待細(xì)胞長(zhǎng)滿后提取總蛋白用于Western blot檢測(cè)FERMT2的表達(dá)，另一份待相應(yīng)Western blot結(jié)果鑒定為FERMT2蛋白缺失表達(dá)后，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)提取基因組DNA，使用鑒定引物擴(kuò)增目的片段后送DNA測(cè)序分析，鑒定FERMT2基因編輯情況。

2.8WST-1法檢測(cè)細(xì)胞活力 按照WST-1試劑的操作說(shuō)明，消化細(xì)胞，按每孔5×103接種至96孔板中，每組細(xì)胞接種15孔(設(shè)3個(gè)復(fù)孔，按鋪板后0、24、48、72和96 h檢測(cè))，每孔100 μL，常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞；于各檢測(cè)時(shí)點(diǎn)加入WST-1試劑10 μL，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2.9流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡 按照CycletestTMPlus DNA Reagent Kit的說(shuō)明操作，采用碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料標(biāo)記細(xì)胞DNA，于FACS Canto II流式細(xì)胞儀(BD)檢測(cè)，Cell Quest 軟件自動(dòng)獲取2～3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/樣品， ModFit LT細(xì)胞周期擬和軟件分析細(xì)胞的DNA倍體數(shù)及細(xì)胞周期分布情況。

按照PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I with 7-AAD的說(shuō)明書(shū)操作，采用Annexin V和7-氨基放線菌素(7-aminoactinomycin D，7-AAD)雙染法標(biāo)記細(xì)胞，于FACS Canto II流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析細(xì)胞的凋亡情況。

2.10Western blot實(shí)驗(yàn) 提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量，取20 μg總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，分別予以抗FERMT2(1∶2 000)、PCNA(1∶2 000)、survivin(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、caspase-3、(1∶1 000)、CDK(1∶1 000)、p-CDK2(1∶1 000)、cyclin A1+A2(1∶1 000)、cyclin B1(1∶1 000)、cyclin E1(1∶2 000)和GAPDH(1∶3 000)抗體進(jìn)行 I 抗的孵育，4 ℃過(guò)夜，洗滌后加入相應(yīng) II 抗(1∶3 000)孵育2 h，加入化學(xué)發(fā)光底物并置于Bio-Rad ChemiDoc XRS成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影及圖像分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用t檢驗(yàn)對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行組間比較，采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)對(duì)配對(duì)樣本的等級(jí)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對(duì)2個(gè)獨(dú)立樣本的等級(jí)資料進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 FERMT2在HCC組織中高表達(dá)

IHC結(jié)果顯示，F(xiàn)ERMT2蛋白定位于正常肝細(xì)胞和HCC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，間質(zhì)中的纖維細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞也呈陽(yáng)性表達(dá)，以此作為內(nèi)部的陽(yáng)性對(duì)照；在HCC組織中，F(xiàn)ERMT2的表達(dá)明顯高于相應(yīng)的癌旁肝組織。Real-time PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)ERMT2在HCC中的表達(dá)量為3.82±0.89，相應(yīng)的癌旁肝組織則為1.95±0.46，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同時(shí)，F(xiàn)ERMT2高表達(dá)可能與HCC患者的復(fù)發(fā)有關(guān)，免疫組化結(jié)果顯示，在23例手術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)的患者中，有17例(17/23， 73.91%)癌組織中FERMT2呈高表達(dá)，而術(shù)后2年未復(fù)發(fā)的7例患者，則全部呈低水平表達(dá)。見(jiàn)圖1、2。

Figure 1. FERMT2 expression in HCC and adjacent liver tissues by IHC staining (×100). A: FERMT2 expression is upregulated in HCC tissues; B: FERMT2 expression is downregulated in adjacent liver tissues.

圖1免疫組化染色檢測(cè)FERMT2在HCC及癌旁肝組織中的表達(dá)

Figure 2. FERMT2 expression in HCC and adjacent liver tissues by real-time PCR. Mean±SD.n=30.**P<0.01vsadjacent liver group.

圖2Real-timePCR檢測(cè)FERMT2在HCC及癌旁肝組織中的表達(dá)

2 FERMT2基因敲除質(zhì)粒的鑒定

分別將3對(duì)退火的sgRNA oligo與線性化的LentiCRISPRv2載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞stbl3，挑取陽(yáng)性克隆，行PCR鑒定，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種培養(yǎng)并送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分別與3對(duì)sgRNA序列比對(duì)，結(jié)果完全一致，證實(shí)3個(gè)重組敲除質(zhì)粒均構(gòu)建成功，見(jiàn)圖3。

Figure 3. Validation of recombinant lentivirusFERMT2 knock-out vector. A: amplification of recombinant lentivirusFERMT2 knock-out vector by PCR. 1～3: LentiCrisprv-hFERMT2-sgRNA-1; 4～6: LentiCrisprv-hFERMT2-sgRNA-2; 7～9: LentiCrisprv-hFERMT2-sgRNA-3; B: sequence ofFERMT2 recombinant lentivirus knock-out vector. Upper:hFERMT2-sgRNA-1; middle:hFERMT2-sgRNA-2; lower:hFERMT2-sgRNA-3. Sequence with red underline represents sgRNA sequence.

圖3重組慢病毒FERMT2敲除質(zhì)粒的鑒定

3 FERMT2基因敲除穩(wěn)定HCC細(xì)胞系的鑒定

本實(shí)驗(yàn)共獲得22個(gè)細(xì)胞克隆，選取其中7個(gè)細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)良好的克隆，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)每個(gè)單克隆細(xì)胞中FERMT2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，第1、4和7號(hào)克隆FERMT2蛋白仍然正常表達(dá)，而第2、3、5和6號(hào)克隆均不表達(dá)FERMT2，見(jiàn)圖4A。提取第2、5和6號(hào)細(xì)胞克隆的基因組DNA，擴(kuò)增sgRNA靶向的FERMT2第2外顯子片段，回收送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，第5號(hào)細(xì)胞克隆在sgRNA-2靶向序列處缺失了2個(gè)堿基，出現(xiàn)移碼突變，見(jiàn)圖4B；第2與第6號(hào)細(xì)胞克隆FERMT2基因編輯情況類(lèi)似，分別缺失了5個(gè)及2個(gè)堿基。實(shí)驗(yàn)選擇5號(hào)細(xì)胞克隆進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，命名為97H-ko-FERMT2，未轉(zhuǎn)染的野生型MHCC97H細(xì)胞為其對(duì)照，命名為97H-wt-FERMT2。

Figure 4. Validation of stable MHCC97H cells infected with the sgRNA-Cas9 knockout vector. A: Western blot analysis of FERMT2 expression in different clones of stable MHCC97H cells infected with the sgRNA-Cas9 knockout vector; B: sequence map of the region ofFERMT2 that misses bases in clone No. 5 of the stable CRISPR/Cas9-knockout MHCC97H cells. The red box highlights the missing two bases. The target site of sgRNA-2 is underlined in blue.

圖4FERMT2基因穩(wěn)定敲除的MHCC97H細(xì)胞的鑒定

4 敲除FERMT2抑制HCC細(xì)胞的活力

WST-1法分別檢測(cè)97H-ko-FERMT2和97H-wt-FERMT2細(xì)胞在體外的活力。結(jié)果顯示，自接種24 h起，各時(shí)點(diǎn)97H-ko-FERMT2細(xì)胞的WST-A450與0 h的WST-A450的比值(A450/fold)明顯低于97H-wt-FERMT2細(xì)胞(P<0.05)，說(shuō)明敲除FERMT2抑制HCC細(xì)胞的活力，見(jiàn)圖5。

5 敲除FERMT2使處于細(xì)胞周期S期的HCC細(xì)胞比例降低

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與97H-wt-FERMT2細(xì)胞相比，97H-ko-FERMT2處于S期的細(xì)胞比例顯著降低(P<0.01)；以S期與G2/M期細(xì)胞比例之和反映細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn),97H-ko-FERMT2細(xì)胞的活力明顯低于97H-ko-FERMT2細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖6。

Figure 5. Effect ofFERMT2 knockout on HCC cell viability. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs97H-wt-FERMT2 group.

圖5敲除FERMT2基因?qū)CC細(xì)胞活力的影響

Figure 6. Effect ofFERMT2 knockout on cell-cycle distribution of HCC cells measured by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs97H-wt-FERMT2 group.

圖6敲除FERMT2基因?qū)CC細(xì)胞周期的影響

6 敲除FERMT2促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與97H-wt-FERMT2細(xì)胞相比，97H-ko-FERMT2細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P<0.05)，敲除FERMT2具有促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡的作用，見(jiàn)圖7。

Figure 7. Effect ofFERMT2 knockout on the apoptosis of HCC cells measured by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs97H-wt-FERMT2 group.

圖7敲除FERMT2基因?qū)CC細(xì)胞凋亡的影響

7 敲除FERMT2對(duì)HCC細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與97H-wt-FERMT2細(xì)胞相比，97H-ko-FERMT2細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白PCNA，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin A1+A2、cyclin B1、cyclin E1、CDK2和p-CDK2及凋亡相關(guān)蛋白survivin和Bcl-2的表達(dá)均明顯減弱(P<0.01)，并且可檢測(cè)到裂解后的cleaved caspase-3，見(jiàn)圖8。

討 論

Kindlin家族已被證實(shí)能夠誘導(dǎo)整合素的活化，通過(guò)與整合素的相互作用不僅可調(diào)節(jié)機(jī)體的生理過(guò)程，還可調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12-14]。目前研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ERMT2在多種內(nèi)胚層來(lái)源的組織器官發(fā)生惡性腫瘤時(shí)表達(dá)上調(diào)，如食管癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌等[3-5, 8, 15]。肝細(xì)胞由內(nèi)胚層細(xì)胞發(fā)育分化而來(lái)，本研究中IHC及real-time PCR結(jié)果均證實(shí)FERMT2在HCC中的表達(dá)要明顯高于癌旁肝組織，與前期研究結(jié)果一致。

在目前已研究的相關(guān)腫瘤中，F(xiàn)ERMT2的主要功能為調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。FERMT2可與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)和表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)等信號(hào)通路相互作用，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖[5-6]，還可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡蛋白酶和Bcl-xL等的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生及生長(zhǎng)[9-10]。Ge等[11]已證實(shí)，F(xiàn)ERMT2的表達(dá)水平可影響HCC患者的總生存期。本研究也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ERMT2高表達(dá)的HCC患者約70%在術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)，而術(shù)后2年未復(fù)發(fā)的7例患者，全部呈低水平表達(dá)。FERMT2自發(fā)現(xiàn)之時(shí)就被證實(shí)為一種有絲分裂原誘導(dǎo)基因[16]，能夠調(diào)控細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，隨后在多種腫瘤中也被發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖并抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[5-6, 9-10]。那么，F(xiàn)ERMT2是否也可通過(guò)調(diào)控HCC細(xì)胞的增殖和凋亡進(jìn)而促進(jìn)HCC的發(fā)生及進(jìn)展？

Figure 8. Effect ofFERMT2 knockout on the expression of functional related protein in HCC cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs97H-wt-FERMT2 group.

圖8敲除FERMT2基因?qū)CC細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

正常組織細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂周期的精密調(diào)控維持了細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)平衡及組織正常的結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)腫瘤發(fā)生時(shí)，這些調(diào)控出現(xiàn)異常，惡性腫瘤細(xì)胞獲得了其最重要的一個(gè)特性持續(xù)增殖的能力[17]。本研究采用WST-1實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)評(píng)價(jià)HCC細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除FERMT2基因后，MHCC97H細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)速度明顯減慢，標(biāo)志細(xì)胞增殖的PCNA蛋白表達(dá)也明顯減弱；同時(shí)，敲除FERMT2基因后，處于S期及S+G2/M期的細(xì)胞比例明顯下降。結(jié)果提示FERMT2具有促HCC細(xì)胞增殖的作用。但這一作用是如何實(shí)現(xiàn)的？既往研究已證實(shí)，cyclin E與cyclin A均能夠與CDK2結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，啟動(dòng)并促進(jìn)DNA的復(fù)制，cyclin B1則能夠促進(jìn)G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)時(shí)期的移位，起始細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂[18-19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲除FERMT2基因后，MHCC97H細(xì)胞內(nèi)cyclin A1+A2、cyclin E1以及CDK2(尤其是活化狀態(tài)的p-CDK2)表達(dá)均明顯減弱，cyclin B1的表達(dá)也明顯減弱。推測(cè)FERMT2可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，加速細(xì)胞進(jìn)入S期和/或M期，從而促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖。

抵抗凋亡是惡性腫瘤細(xì)胞的另一個(gè)重要生物學(xué)特性，其對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及抗腫瘤治療過(guò)程都有著重要意義[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲除FERMT2基因后，MHCC97H細(xì)胞的凋亡比率明顯增加，抗凋亡蛋白Bcl-2和survivin的表達(dá)也明顯減弱。Bcl-2可結(jié)合并抑制凋亡啟動(dòng)因子Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)和Bcl-2同源拮抗劑(Bak)的功能，進(jìn)而抑制線粒體細(xì)胞色素C等凋亡信號(hào)蛋白的釋放和下游caspase-3的活化[20-21]。Caspase-3又被稱(chēng)為“死亡執(zhí)行蛋白酶”，是多個(gè)凋亡途徑共同的下游效應(yīng)分子，占據(jù)著凋亡過(guò)程的核心地位。Caspase-3本身不具有催化活性，必須先經(jīng)顆粒酶B或caspase-10剪切后才被部分活化，并進(jìn)行下一步的自我催化，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)出cleaved caspase-3的存在[22]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，敲除FERMT2基因后，MHCC97H細(xì)胞中caspase-3前體減少，并出現(xiàn)了cleaved caspase-3片斷。Survivin不僅可通過(guò)直接結(jié)合抑制caspase-3，還可通過(guò)p21間接抑制caspase-3的活性，同時(shí)survivin可選擇性地表達(dá)于G2/M期，對(duì)抗G2/M期的凋亡誘導(dǎo)，因此HCC中survivin高表達(dá)不僅能抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，還可促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的異常增殖[23]。

本研究成功構(gòu)建了FERMT2基因敲除穩(wěn)定HCC細(xì)胞系，通過(guò)體外功能實(shí)驗(yàn)結(jié)合臨床病理特征，初步證實(shí)了FERMT2通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白及抗凋亡蛋白的表達(dá)，調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖與凋亡，進(jìn)而在肝癌形成及發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促癌作用，為后續(xù)深入探索HCC腫瘤發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中FERMT2發(fā)揮的具體功能及參與的相關(guān)信號(hào)通路打下了基礎(chǔ)。

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FERMT2 expression in hepatocellular carcinoma and its effect on cell growth

LIN Jie1, CHEN Xiao-yan1, LI Jie-yu2, 3, WANG Li-ping1, CHEN Hui-yu1, LIN Wan-song2, 3

(1DepartmentofPathology,FujianProvincialHospital,ShengliClinicalMedicalCollegeofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China;2LaboratoryofImmuno-Oncology,FujianCancerHospital，AffiliatedCancerHospitalofFujianMedicalUniversity，3FujianProvincialKeyLaboratoryofTranslationalCancerMedicine,Fuzhou350014,China.E-mail:linwansong82@163.com)

AIM: To identify the expression of fermitin family homolog 2 (FERMT2) in hepatocellular carcinoma (HCC) tissues and the effect of FERMT2 on the cell growth and related protein expression.METHODSReal-time PCR and immunohistochemistry were used to detect FERMT2 expression in the HCC tissues. The technique of CRISPR/Cas9 was applied to construct stableFERMT2 knockout MHCC97H cell line. WST-1 assay and flow cytometry were used to measure the cell viability, cell-cycle distribution and cell apoptosis. Western blot was used to determine the expression of related proteins in the MHCC97H cells.RESULTSIn HCC tissues, the expression level of FERMT2 was higher than that in adjacent liver tissues (P<0.05). High expression of FERMT2 was significantly correlated with postoperative recurrence of tumor. Knockout ofFERMT2 gene evidently inhibited MHCC97H cell viability and accelerated cell apoptosis. Meanwhile, the expression levels of proliferating cell nuclear antigen, cyclins, cyclin-dependent kinases 2 and anti-apoptotic factors were significantly downregulated in MHCC97H cells withFERMT2 knockout (P<0.05).CONCLUSIONFERMT2 may function as a promoter of hepatocarcinogenesis and progression via regulating the cell viability, cell-cycle distribution and cell apoptosis, which is related with the expression of cell cycle regulators and anti-apoptotic factors．

Hepatocellular carcinoma; CRISPR/Cas9 technique; Fermitin family homolog 2; Cell proliferation; Cell cycle； Apoptosis

1000- 4718(2017)12- 2157- 08

2017- 07- 25

2017- 10- 19

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2016J01510)；福建省衛(wèi)生計(jì)生委青年科研課題(No. 2017-1-2)

△通訊作者 Tel: 13805087511; E-mail: linwansong82@163.com

R363.2; R735.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.008

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 宋延君)