余 蕾， 韓 冰， 田 甜， 鄭 璐， 楊 婷， 劉 幸， 湯 雷， 羅 軒， 楊 勤， 謝汝佳

(貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550000)

辛二酰苯胺異羥肟酸通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡*

余 蕾， 韓 冰， 田 甜， 鄭 璐， 楊 婷， 劉 幸， 湯 雷， 羅 軒， 楊 勤△， 謝汝佳△

(貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550000)

目的探討辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)對人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖與凋亡的影響及其可能的機制。方法分別給予不同濃度的SAHA處理HepG2細(xì)胞48 h，采用實時無標(biāo)記細(xì)胞分析法檢測細(xì)胞增殖情況；Western blot法檢測組蛋白H3K9和H3K27的乙?；剑约捌咸烟钦{(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)和p-PERK蛋白水平的變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果與對照組相比，0.1和1 μmol/L SAHA處理48 h對HepG2細(xì)胞增殖無明顯抑制作用，6和12 μmol/L SAHA組HepG2細(xì)胞增殖率明顯下降(P<0.05)；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，不同濃度的SAHA處理細(xì)胞48 h后，acH3K9和acH3K27表達(dá)水平明顯升高，GRP78蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，PERK蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，而p-PERK的蛋白水平顯著增加(P<0.05)；流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，隨著SAHA濃度的增高，HepG2細(xì)胞的凋亡逐漸增加。結(jié)論SAHA可上調(diào)HepG2細(xì)胞中組蛋白H3K9和H3K27的乙?；揎椝剑⑼ㄟ^激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡通路來誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。

肝細(xì)胞癌； 細(xì)胞凋亡； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 辛二酰苯胺異羥肟酸

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最高發(fā)的惡性腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第5位，死亡率第3位[1]，而我國的肝癌發(fā)病人數(shù)占全球的51%。HCC是一種易侵襲、易轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，目前以手術(shù)治療為主，輔以化療，早期發(fā)現(xiàn)預(yù)后較好，5年生存率高于70%；由于肝癌發(fā)生較為隱匿，大多數(shù)患者就診時已屬晚期，手術(shù)切除率低，預(yù)后較差，致使5年生存率低于16%[2]。目前有研究證實肝癌細(xì)胞中組蛋白乙酰化水平下調(diào)可能與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]，因此，使用組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)抑制劑治療肝細(xì)胞癌成為一種潛在的治療途徑。

辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)作為首個被美國FDA批準(zhǔn)臨床使用的HDAC抑制劑[4]，其抗腫瘤的作用已受到廣泛關(guān)注，但其抗腫瘤的機制尚未被完全闡明。有研究發(fā)現(xiàn)，SAHA可通過上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p53和p21等進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。由于腫瘤的發(fā)生除了與細(xì)胞增殖過度有關(guān)，也與細(xì)胞凋亡減少密切相關(guān)，因此本實驗用不同濃度的SAHA作用于人肝癌細(xì)胞HepG2，觀察其對組蛋白H3K9和H3K27乙?；揎椝?、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡通路中相關(guān)蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步闡明SAHA抗腫瘤的機制提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

人肝癌細(xì)胞株HepG2(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心上海細(xì)胞庫，編號KCB 200507YJ)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco)；胰酶和彩虹Marker(北京索萊寶科技有限公司)；DMSO(Sigma)；細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒和Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)有限公司)；抗β-actin抗體、山羊抗兔IgG+H、兔抗乙酰化H3K9(acetylated H3K9，acH3K9)抗體、兔抗乙?；疕3K27(acetylated H3K27，acH3K27)抗體和SAHA(Abcam)。

2 主要方法

2.1實時無標(biāo)記細(xì)胞分析法(real-time cellular ana-lysis，RTCA)檢測不同濃度SAHA對HepG2細(xì)胞增殖的影響 RTCA DP細(xì)胞功能分析系統(tǒng)通過 E-Plate底部的電極檢測貼壁細(xì)胞的電阻抗，可反映細(xì)胞的數(shù)量、活力、 形態(tài)以及貼壁情況，以細(xì)胞指數(shù)(cell index，CI)作為檢測指標(biāo)。取對數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞制成細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，以每孔1×104細(xì)胞的密度接種于E-Plate，10 h后分別加入終濃度為0.1、1、6、12、25、50和100 μmol/L的SAHA處理細(xì)胞，對照組不予SAHA處理，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。連續(xù)動態(tài)監(jiān)測72 h，觀察不同濃度SAHA對HepG2細(xì)胞增殖的影響，每15 min記錄1次。RTCA軟件分析處理CI值。根據(jù)RTCA實驗結(jié)果確定后續(xù)實驗中SAHA的給藥濃度。

2.2倒置顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時，將細(xì)胞隨機分為對照組(不予SAHA處理)、1 μmol/L SAHA組、6 μmol/L SAHA組及12 μmol/L SAHA組(SAHA給藥濃度由RTCA實驗結(jié)果確定)。觀察不同濃度SAHA處理HepG2細(xì)胞48 h后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，在每個無包被的塑料皿(10 cm)中鋪1×106個細(xì)胞，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機分為對照組(不予SAHA處理)、1 μmol/L SAHA組、6 μmol/L SAHA組及12 μmol/L SAHA組，給藥48 h后用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，制備密度為1×108/L的細(xì)胞懸液，取1 mL離心除去上清液，加入Annexin-V-FITC結(jié)合液195 μL重懸，再先后加入Annexin V-FITC 5 μL和碘化丙啶染色液10 μL，在室溫下避光孵育20 min后置于冰浴中，流式細(xì)胞儀檢測。

2.4Western blot法檢測組蛋白H3K9和H3K27的乙酰化水平及葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)和p-PERK蛋白水平的變化 收集各組細(xì)胞，分別加入蛋白裂解液，冰上裂解10 min，收集細(xì)胞懸液，超聲破碎，12 000 r/min、4 ℃離心20 min，棄沉淀，收集上清，使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取40 μg總蛋白上樣，行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉90 min，分別加入1∶1 500稀釋的兔抗GRP78、PERK和p-PERK抗體，1∶5 000稀釋的兔抗acH3K9抗體及1∶1 000稀釋的兔抗 acH3K27抗體，4 ℃搖床孵育過夜。第2天用TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶4 000)，室溫孵育90 min，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光成像，分別以β-actin和H3為內(nèi)參照。條帶用Image Lab圖像分析軟件對每個條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RTCA 動態(tài)監(jiān)測HepG2細(xì)胞增殖情況

鋪板約10 h 后進(jìn)行加藥處理，取此時 CI 值標(biāo)準(zhǔn)化為 1。RTCA動態(tài)監(jiān)測結(jié)果顯示，與對照組比較，0.1 μmol/L和1 μmol/L SAHA處理HepG2細(xì)胞48 h均對HepG2細(xì)胞無明顯的抑制作用，6 μmol/L SAHA組在藥物作用48 h后，可明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖(P<0.05)，隨著SAHA濃度增加，HepG2細(xì)胞增殖進(jìn)一步受到抑制，且濃度越高對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯，見圖1。

Figure 1. Dynamic monitoring of the normalized cell index and the viability (48 h) of HepG2 cells treated with different concentrations of SAHA detected by RTCA xCELLigence system. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group.

圖1RTCAxCELLigence系統(tǒng)動態(tài)監(jiān)測不同濃度SAHA處理HepG2細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞指數(shù)和處理48h的細(xì)胞存活率

2 觀察不同濃度SAHA處理對HepG2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響

分別采用1 μmol/L、6 μmol/L和12 μmol/L SAHA處理HepG2 細(xì)胞48 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果可見，對照組HepG2 細(xì)胞聚團生長，細(xì)胞間連接緊密，邊緣光滑，上清液中幾乎沒有漂浮死亡的細(xì)胞；1 μmol/L SAHA處理組細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比，形態(tài)學(xué)變化不明顯，少數(shù)細(xì)胞體積縮小，上清液中可見少許漂浮的死亡細(xì)胞；以6 μmol/L和12 μmol/L SAHA處理細(xì)胞后，細(xì)胞生長明顯受到抑制，活細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞邊緣不光滑，折光率下降，貼壁不良，見圖2。

Figure 2. The effect of SAHA on the morphological changes of HepG2 cells observed under inverted microscope (×100).

圖2倒置顯微鏡下觀察不同濃度SAHA處理HepG2細(xì)胞48h對細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度SAHA對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度SAHA 作用于 HepG2細(xì)胞48 h 后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞凋亡率為(10.10±1.73)%，1 μmol/L SAHA 組細(xì)胞凋亡率為(14.63±0.86)%，較對照組顯著增加(P<0.05)；隨著SAHA濃度的增高，6 μmol/L及12 μmol/L SAHA組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增高，分別為(19.77±2.06)%及(36.60±1.64)%，與對照組及1 μmol/L SAHA 組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。這說明SAHA作用于HepG2細(xì)胞48 h能明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡。

Figure 3. The effect of SAHA at different concentrations for 48 h on the apoptotic rate of HepG2 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vs1 μmol/L SAHA group.

圖3不同濃度SAHA處理HepG2細(xì)胞48h對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

4 不同濃度 SAHA處理HepG2 細(xì)胞48 h 后組蛋白H3K9和H3K27乙?；郊癎RP78、PERK和p-PERK蛋白水平的變化

Western blot法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，1 μmol/L SAHA 處理HepG2細(xì)胞48 h后，組蛋白H3K9和H3K27 乙酰化修飾水平增加不明顯；6 μmol/L SAHA 組和12 μmol/L SAHA組細(xì)胞組蛋白H3K9和H3K27乙酰化修飾水平明顯增加(P<0.05)。與對照組比較，1 μmol/L、6 μmol/L和12 μmol/L SAHA組細(xì)胞中GRP78和p-PERK蛋白表達(dá)水平均明顯增加(P<0.05)，而PERK蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)，見圖4。

討 論

組蛋白乙?；?去乙?；徽J(rèn)為是調(diào)控真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的一種關(guān)鍵機制。組蛋白乙?；饺Q于組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases，HATs)和HDACs兩個酶家族之間的動態(tài)平衡。體內(nèi)HATs和HDACs的動態(tài)平衡一旦被打破，就會導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的失調(diào)，引起原癌基因的激活和抑癌基因的失活，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖失常而引發(fā)腫瘤的發(fā)生[5]。目前研究證實，在腫瘤細(xì)胞中組蛋白大多呈低乙酰化狀態(tài)，而其中由HDACs異常導(dǎo)致的組蛋白乙?；癄顟B(tài)失衡與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系[6-7]。大量的實驗研究表明，肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在著HDACs高表達(dá)及組蛋白乙?；较抡{(diào)[8]，因此，采用去乙?；敢种苿┮种艸DACs的活性成為抗腫瘤的方法之一。SAHA作為一種已經(jīng)應(yīng)用于臨床試驗的組蛋白去乙?；敢种苿?，它以微摩爾濃度即可提高組蛋白乙?；?，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長停滯、分化或凋亡。

本實驗采用不同濃度的SAHA作用于HepG2細(xì)胞，通過RTCA法動態(tài)監(jiān)測其對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著SAHA濃度的增加，它對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用也隨之增加，這與Kim等[9]的研究結(jié)果是一致的。目前認(rèn)為SAHA抑制腫瘤細(xì)胞增殖的可能機制是提高組蛋白乙?；?，有利于染色質(zhì)的重塑，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長停滯、分化和凋亡。通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，6 μmol/L和12 μmol/L SAHA處理HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞中H3K9和H3K27乙?；揎椝矫黠@增加。提示SAHA對肝癌細(xì)胞的抑制作用可能與H3K9和H3K27的乙酰化修飾水平上調(diào)有關(guān)，但其具體的機制還不十分清楚。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞重要的細(xì)胞器之一，是蛋白質(zhì)合成、折疊和轉(zhuǎn)運的場所。但是一些病理因素，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣代謝紊亂、缺血再灌注損傷和氧化應(yīng)激等可導(dǎo)致ERS的發(fā)生[9]。ERS 可使細(xì)胞產(chǎn)生未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein reaction，UPR)來緩解ERS，從而使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能恢復(fù)穩(wěn)定[10]。目前認(rèn)為ERS主要涉及的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜效應(yīng)蛋白有需肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)、PERK和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)[11]。 正常情況下，這3種蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)都與GRP78結(jié)合而處于無活性狀態(tài)，當(dāng)發(fā)生ERS時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中有大量未折疊蛋白聚集，由于GRP78與未折疊蛋白具有更高的親和力，導(dǎo)致GRP78與 PERK、ATF6和IRE1解離。解離后的GRP78可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的未折疊蛋白結(jié)合，由此促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊，對細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。 然而，當(dāng)ERS嚴(yán)重或持續(xù)得不到緩解，則通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡通路而觸發(fā)細(xì)胞死亡[12]。本實驗通過Western blot檢測各組HepG2 細(xì)胞中GRP78蛋白水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度SAHA處理細(xì)胞后，GRP78蛋白表達(dá)水平較對照組顯著增高。由于GRP78是ERS的標(biāo)志蛋白，提示SAHA可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生ERS。關(guān)于SAHA誘導(dǎo)GRP78表達(dá)增高的機制可能與SAHA上調(diào)組蛋白H3K9和H3K27的乙?；接嘘P(guān)。因為組蛋白乙酰化水平上調(diào)后可使染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位——核小體的結(jié)構(gòu)變得松弛，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子與DNA分子的接觸，進(jìn)而上調(diào)GRP78的表達(dá)。有研究人員發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA可通過抑制HDAC1增加GRP78的表達(dá)[13]；還有研究發(fā)現(xiàn)組蛋白H3總的乙?；缴险{(diào)可以促進(jìn)GRP78的表達(dá)[14]，這與我們的研究結(jié)果是一致的。

Figure 4. The protein levels of acH3K9, acH3K27, GRP78, PERK and p-PERK in the HepG2 cells exposed to SAHA at different concentrations for 48 h. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖4不同濃度SAHA處理HepG2細(xì)胞48h對組蛋白H3K9和H3K27的乙酰化水平及GRP78、PERK和p-PERK蛋白水平的影響

本次研究還發(fā)現(xiàn)不同濃度SAHA處理HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞中PERK蛋白的表達(dá)水平較對照組顯著減少，而p-PERK蛋白的水平則較對照組顯著增加。引起這一變化的原因可能是SAHA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生ERS后，GRP78與PERK解離，解離后的PERK發(fā)生自身二聚化和磷酸化而激活，從而使細(xì)胞中PERK的表達(dá)水平降低，而p-PERK的蛋白水平增高。有研究發(fā)現(xiàn)p-PERK能特異性上調(diào)細(xì)胞中ATF4和CHOP的表達(dá)，從而激活ERS誘導(dǎo)的凋亡信號通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15-16]。本次實驗中采用不同濃度SAHA處理HepG2細(xì)胞48 h后，檢測其凋亡發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的增加，HepG2細(xì)胞的凋亡隨之增加，推測可能是由于SAHA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生ERS后激活了ERS誘導(dǎo)的凋亡信號通路的結(jié)果。

綜上所述，HDAC抑制劑SAHA可抑制HepG2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。SAHA激活ERS相關(guān)的凋亡通路從而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡可能是其抗肝癌的機制之一。

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Suberoylanilide hydroxamic acid induces apoptosis of HepG2 cells by endoplasmic reticulum stress apoptotic pathway

YU Lei, HAN Bing, TIAN Tian, ZHENG Lu, YANG Ting, LIU Xing, TANG Lei, LUO Xuan, YANG Qin, XIE Ru-jia

(DepartmentofPathophysiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550000,China.E-mail:xierujia790319@163.com；qinyang@gmc.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) on the proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells and to explore its possible mechanism.METHODSHepG2 cells were treated with SAHA at different concentrations for 48 h. The proliferation of HepG2 cells was detected by real-time cellular analysis. The protein levels of acetylated histones H3K9 and H3K27, glucose-regulated protein 78 (GRP78), protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) and p-PERK were determined by Western blot. The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry.RESULTSCompared with control group, treatment with SAHA at 0.1 μmol/L and 1 μmol/L for 48 h showed no significant inhibitory effect on the proliferation of HepG2 cells, while SAHA at 6 μmol/L and 12 μmol/L significantly inhibited the proliferation of HepG2 cells (P<0.05). The results of Western blot showed that the protein levels of acH3K9, acH3K27, GRP78 and p-PERK increased significantly after treated with SAHA at diffe-rent concentrations for 48 h, while the protein level of PERK was decreased significantly (P<0.05). The results of flow cytometry analysis showed that the apoptotic rates of the HepG2 cells increased with the increase in SAHA concentration.CONCLUSIONSAHA up-regulates the acetylation of H3K9 and H3K27 in the HepG2 cells and induces apoptosis of HepG2 cells by activating the endoplasmic reticulum stress-related apoptosis pathway.

Hepatocellular carcinoma; Apoptosis; Endoplasmic reticulum stress; Suberoylanilide hydroxamic acid

1000- 4718(2017)12- 2151- 06

2017- 05- 23

2017- 08- 07

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81560105)；貴州省教育廳自然科學(xué)研究項目(黔教合KY字 [2014]269)；貴州省科技廳基金資助項目(黔科合LH字[2014]7074)

△通訊作者 謝汝佳 Tel: 13985441220； E-mail: xierujia790319@163.com； 楊 勤 Tel: 13985013402； E-mail: qinyang@gmc.edu.cn

R329.21； R735.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.007

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)