韓 園， 南 克， 項(xiàng)芳芳， 方錢娟， 黃晨苗， 雍慧媛， 曹 紅， 李 軍

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院麻醉科， 浙江 溫州 325027)

高遷移率族蛋白1對(duì)Aβ25-35刺激下BV-2細(xì)胞NF-κB表達(dá)的作用*

韓 園， 南 克， 項(xiàng)芳芳， 方錢娟， 黃晨苗， 雍慧媛， 曹 紅， 李 軍△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院麻醉科， 浙江 溫州 325027)

目的探討高遷移率族蛋白1(HMGB1)對(duì)β-淀粉樣蛋白(Aβ)25-35刺激下的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2中核因子-κB(NF-κB)表達(dá)的影響。方法將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BV-2細(xì)胞分為4組：正常細(xì)胞組(不做任何處理)、模型組(加入40 μmol/L Aβ25-35)、RNA干擾組(采用RNA干擾HMGB1后加入40 μmol/L的Aβ25-35)和溶劑對(duì)照組(加入終濃度為0.1%的DMSO)。各組細(xì)胞孵育72 h后(Aβ25-35處理24 h)采用Western blot法檢測(cè)HMGB1和NF-κB p65的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果CCK-8結(jié)果顯示40 μmol/L Aβ25-35為最佳造模濃度。選擇30 nmol/L帶GFP熒光基團(tuán)的HMGB1-siRNA轉(zhuǎn)染BV-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率約為80%～90%。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HMGB1-siRNA片段干擾后BV-2細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；Aβ25-35刺激BV-2細(xì)胞后，胞內(nèi)HMGB1和核內(nèi)NF-κB p65表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，HMGB1-siRNA作用后，HMGB1和核內(nèi)NF-κB p65表達(dá)均明顯下降(P<0.05)。結(jié)論RNA干擾HMGB1表達(dá)可減少Aβ25-35刺激的BV-2細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá)。

高遷移率族蛋白1； β-淀粉樣蛋白； BV-2細(xì)胞； 核因子-κB； RNA干擾

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)和tau蛋白功能異常引起的最常見的癡呆類型之一[1]。據(jù)美國(guó)2016年阿爾茨海默病現(xiàn)狀報(bào)道，現(xiàn)約有540萬美國(guó)人罹患此病，預(yù)計(jì)本世紀(jì)中葉，將增長(zhǎng)到1 380萬人，即每66 s將有1例新診斷患者[2]。研究表明AD患者腦內(nèi)高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)表達(dá)明顯增高，并可釋放至胞外而增加Aβ的神經(jīng)毒性[3]。HMGB1是存在于真核細(xì)胞核內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，在炎癥和創(chuàng)傷等刺激下可以釋放出細(xì)胞，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子樣作用并調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫[4]。小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia，MG)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，具有巨噬細(xì)胞樣作用。AD動(dòng)物模型研究表明膠質(zhì)細(xì)胞的激活可促進(jìn)神經(jīng)炎癥的發(fā)生[5]，當(dāng)其功能異常時(shí)Aβ清除減少，導(dǎo)致Aβ級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)。本研究采用Aβ活性片段(Aβ25-35)刺激小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2，體外模擬AD患者腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的病理生理過程，同時(shí)通過RNA干擾(RNA interference， RNAi)抑制細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)，觀察HMGB1對(duì)Aβ25-35處理的BV-2細(xì)胞核因子(nuclear factor-κB，NF-κB)表達(dá)的影響，初步闡述HMGB1在AD發(fā)生發(fā)展中的可能作用。

材 料 和 方 法

1 藥物和試劑

Aβ25-35購于Sigma，配成終濃度500 μmol/L，-20 ℃保存， 使用時(shí)采用37 ℃水浴箱孵育7 d即為Aβ25-35的老化狀態(tài)； LipoJetTM轉(zhuǎn)染試劑購于SignaGen；抗HMGB1抗體和抗NF-κB p65抗體購于Abcam；抗β-actin抗體購于Bioword；DMEM高糖培養(yǎng)基和南美胎牛血清購于Gibco；CCK-8試劑盒購于Dojindo；核蛋白和胞漿提取試劑盒購于南京凱基。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株BV-2購于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。培養(yǎng)液為含5%胎牛血清、100 mg/L青霉素以及100 mg/L 鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，按1×107/L密度接種到培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈半貼壁狀態(tài)生長(zhǎng)，細(xì)胞匯集至80%～90%時(shí)，約2～3 d按1∶3傳代，至細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。

2.2RNA干擾HMGB1 在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information， NCBI)核苷酸序列中查找到HMGB1的核苷酸序列，Gene ID：15289， 種屬：Mus musculus C57BL/6J，其siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，總共3對(duì)：siRNA1(Hmgb1-mus-356)為5’-CUCGUU-AUGAAAGAGAAAUTT-3’(Forward)和5’-AUUUCUCUUUCAUAACGAGTT-3’(Reverse)； siRNA2 (Hmgb1-mus-573)為5’-GCAGCCCUAUGAGAAGAAATT-3’(Forward)和5’-UUUCUUCUCAUAGGGCUGCTT-3’(Reverse)； siRNA3(Hmgb1-mus-1792)為5’-CCA-GCGAAGGCUAUCACAATT-3’(Forward)和5’-UUG-UGAUAGCCUUCGCUGGTT-3’(Reverse)。經(jīng)BLAST同源性比對(duì)無明顯同源性。

將干粉狀siRNA溶于DEPC水，配制成20 μmol/L的溶液，分裝后-20 ℃保存。BV-2細(xì)胞按每孔4.5×104的密度接種于6孔板上。待細(xì)胞貼壁匯集達(dá)30%時(shí)更換成無血清、無雙抗的完全培養(yǎng)液(即轉(zhuǎn)染前30～60 min)。配制LipoJetTM轉(zhuǎn)染緩沖液(5×)成工作液時(shí)，用雙蒸水(ddH2O)按1∶4進(jìn)行稀釋。吸取100 μL工作液，加入至各組不同濃度梯度siRNA靜置5 min，加入3 μL LipoJetTM轉(zhuǎn)染試劑，靜置10 min，將上述復(fù)合物加入6孔板相應(yīng)細(xì)胞組中，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞。

2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 BV-2細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，輕吹成懸液，按5×107/L的密度接種于96孔板上。當(dāng)細(xì)胞匯聚達(dá)70%時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入不同濃度梯度的Aβ25-35，對(duì)照組細(xì)胞加入培養(yǎng)基空白組為無細(xì)胞孔加入培養(yǎng)基。繼續(xù)孵育24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，避光繼續(xù)培養(yǎng)1 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度(A)值并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(A處理組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

2.4實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)期BV-2細(xì)胞分為4組：正常細(xì)胞組(normal組)，不做任何處理；模型組(Aβ25-35組)，加入終濃度為40 μmol/L的Aβ25-35(收集細(xì)胞前)；RNAi組，采用HMGB1-siRNA處理細(xì)胞后加入40 μmol/L的Aβ25-35；溶劑對(duì)照組(solvent組)，加入轉(zhuǎn)染試劑和溶解Aβ25-35所需溶劑(0.1%的DMSO)。各組細(xì)胞孵育72 h后(Aβ25-35處理24 h)，用Western blot法檢測(cè)HMGB1和NF-κB p65蛋白的表達(dá)情況。

2.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)量 裂解各組細(xì)胞提取蛋白,一部分細(xì)胞用于提取全蛋白，一部分細(xì)胞根據(jù)核蛋白提取試劑盒提取核蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，蛋白上樣量40 μg，行SDS-PAGE分離蛋白，再轉(zhuǎn)到PVDF膜上，室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，然后使用兔抗HMGB1抗體(1∶1 000)、兔抗NF-κB p65抗體(1∶1 000)和兔抗內(nèi)參照β-actin抗體(1∶5 000)4 ℃孵育過夜，PBS洗膜后采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育1.5 h。加ECL溶液1 min，GE成像系統(tǒng)曝光并采集圖像。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Aβ25-35對(duì)BV-2細(xì)胞存活率的影響

分別以5、10、20、30、40和50 μmol/L的Aβ25-35作用24 h后，30～50 μmol/L組BV-2細(xì)胞活力明顯下降(P<0.05)，通過計(jì)算得到Aβ25-35的半數(shù)抑制濃度(IC50)為 59.82 μmol/L，故最終選擇Aβ25-35的造模濃度為40 μmol/L，見圖1。

Figure 1. The cell viability of BV-2 cells stimulated by different concentrations of Aβ25-35detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs5 μmol/L Aβ25-35group.

圖1CCK-8法測(cè)定不同濃度Aβ25-35對(duì)BV-2細(xì)胞活力的影響

2 不同濃度的siRNA干擾抑制HMGB1表達(dá)的情況

轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，各孔細(xì)胞同時(shí)加入不同濃度(3個(gè)片段混合的HMGB1-siRNA，終濃度為0、10、20、30、40和50 nmol/L)的HMGB1-siRNA。與0 nmol/L組相比，各濃度干擾組HMGB1表達(dá)均下降(P<0.05)，說明HMGB1-siRNA干擾技術(shù)可成功抑制HMGB1蛋白的表達(dá),見圖2。

Figure 2. The effects of HMGB1-siRNA transfection at different concentrations on the protein expression of HMGB1 in the BV-2 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 nmol/L siRNA group.

圖2Westernblot法測(cè)定不同濃度HMGB1-siRNA干擾抑制HMGB1表達(dá)的情況

3 HMGB1-siRNA的轉(zhuǎn)染效率

用帶GFP熒光基團(tuán)的siRNA轉(zhuǎn)染BV-2細(xì)胞，在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，siRNA轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞內(nèi)可見綠色熒光，30 nmol/L的siRNA的轉(zhuǎn)染效率為80%～90%[轉(zhuǎn)染效率(%)=顯示綠色熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%]，為最佳濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖3。

Figure 3. The protein expression of GFP followed by RNA interference in BV-2 cells observed under fluorescence microscopy (×100). A: bright field; B: fluorescence; C: merged.

圖3HMGB1-siRNA的轉(zhuǎn)染效率觀察

4 各干擾序列抑制HMGB1表達(dá)效果

選定siRNA濃度為30 nmol/L，空白對(duì)照(blank control，CON)組不做任何處理，陰性對(duì)照(negative control，NEG)組加入scramble siRNA，Hmgb1-mus-356、Hmgb1-mus-573和Hmgb1-mus-1792 3個(gè)干擾組分別命名為siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組。CON組中HMGB1的表達(dá)水平與NEG組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；與NEG組相比，siRNA1、siRNA2和siRNA3各組HMGB1的表達(dá)均下降(P<0.05)，見圖4。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)中將3個(gè)片段混合進(jìn)行RNA干擾。

Figure 4. The protein expression of HMGB1 in different sequence of siRNA detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsNEG group.

圖4Westernblot法測(cè)定不同序列干擾抑制HMGB1表達(dá)的情況

5 干擾抑制HMGB1對(duì)Aβ25-35刺激下BV-2細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響

與normal組相比，Aβ25-35組細(xì)胞內(nèi)HMGB1和核內(nèi)NF-κB p65的表達(dá)均升高(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染HMGB1-siRNA后，胞內(nèi)HMGB1和核內(nèi)NF-κB p65的表達(dá)均較Aβ25-35組明顯下降(P<0.05)，而正常對(duì)照組與溶劑對(duì)照組間HMGB1和NF-κB p65表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；各組間總NF-κB p65表達(dá)的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖5。

Figure 5. The protein expression of HMGB1 and NF-κB detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsAβ25-35group.

圖5Westernblot法測(cè)定HMGB1-siRNA對(duì)HMGB1和NF-κB表達(dá)的影響

討 論

本研究結(jié)果顯示，BV-2細(xì)胞株在Aβ25-35刺激下，細(xì)胞活力降低，NF-κB表達(dá)量較正常組上調(diào)，提示BV-2細(xì)胞在Aβ25-35刺激下存在功能障礙及神經(jīng)炎癥發(fā)生的可能；而RNA干擾可有效減少HMGB1在BV-2中的表達(dá)，并下調(diào)NF-κB的表達(dá)量，提示干擾HMGB1能減輕神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展。

“Aβ級(jí)聯(lián)瀑布假說”認(rèn)為在AD患者腦內(nèi)的Aβ毒性是造成突觸功能紊亂和進(jìn)而繼發(fā)神經(jīng)退行性病變的主要原因[6]。AD神經(jīng)病理的發(fā)生發(fā)展也與基因的表達(dá)調(diào)控、補(bǔ)體級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)的激活、細(xì)胞因子和趨化因子受體的上調(diào)、反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞的增生、小膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及線粒體的氧化應(yīng)激相關(guān)[7]。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦組織中的單核-巨噬細(xì)胞，在AD患者腦中可以觀察到炎癥改變，特別是Aβ沉積部位，而激活且功能異常的小膠質(zhì)細(xì)胞處往往Aβ數(shù)目最多[8]。本研究采用的BV-2細(xì)胞株是從攜帶癌基因v-raf/v-myc的反轉(zhuǎn)錄病毒J2感染的小鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞獲得，可穩(wěn)定培養(yǎng)，且高度純化，可用于體外研究，為探討AD的發(fā)病機(jī)制提供線索。有研究發(fā)現(xiàn)Aβ作用于BV-2細(xì)胞后，炎癥因子表達(dá)增加，通過激活NF-κB磷酸化促進(jìn)IL-1β和TNF-α的表達(dá)[9]。也有研究表明Aβ對(duì)BV-2細(xì)胞并無明顯毒性作用，但對(duì)細(xì)胞形態(tài)有一定影響[10]。本實(shí)驗(yàn)中，在Aβ25-35刺激下，BV-2細(xì)胞株NF-κB表達(dá)量升高，活力降低，但毒性并不強(qiáng)，這可能與小膠質(zhì)細(xì)胞復(fù)雜的活化分化功能有關(guān)。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)Aβ25-35活化誘導(dǎo)后，原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中HMGB1表達(dá)明顯升高[11]；在AD大鼠中HMGB1 的胞漿和胞外釋放量增加[12]。在腦梗死動(dòng)物模型中，HMGB1大量合成與釋放，同時(shí)病灶區(qū)的神經(jīng)元大量凋亡，而給予HMGB1抑制劑后，神經(jīng)元的損失明顯減少[13]。而李滿等[14]近期研究發(fā)現(xiàn)在缺血/再灌注損傷腦內(nèi)，HMGB1的表達(dá)升高可促進(jìn)損傷部位神經(jīng)干細(xì)胞增殖，具有促進(jìn)組織修復(fù)的作用。

研究表明，AD小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中HMGB1與DNA或RNA偶聯(lián)復(fù)合體激活晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation end products， RAGE)表達(dá)而增加斑塊負(fù)荷[15]。另有研究也表明，HMGB1表達(dá)升高伴隨著HMGB1的結(jié)合受體RAGE、Toll樣受體-2和Toll樣受體4的表達(dá)升高，HMGB1與受體結(jié)合促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)脫髓鞘的神經(jīng)炎癥進(jìn)展[16]。NF-κB作為核轉(zhuǎn)錄因子，在免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，在固有免疫和適應(yīng)性免疫中，調(diào)控組織和細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)育等過程。本實(shí)驗(yàn)中，RNA干擾HMGB1明顯降低了Aβ25-35刺激下的BV-2細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá)，說明HMGB1可能在 Aβ25-35刺激的BV-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其確切的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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Eeffect of HMGB1 on expression of NF-κB in BV-2 cells stimulated with Aβ25-35

HAN Yuan, NAN Ke, XIANG Fang-fang, FANG Qian-juan, HUANG Chen-miao, YONG Hui-yuan, CAO Hong, LI Jun

(DepartmentofAnesthesiology,TheSecondAffiliatedHospitalandYuyingChildren’sHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China.E-mail:lijun0068@163.com)

AIM: To investigate the effect of high mobility group box-1 protein (HMGB1) on the expression of nuclear factor-κB (NF-κB) in BV-2 cells stimulated with amyloid β-protein (Aβ)25-35.METHODSCultured BV-2 cells in logarithmic growth phase were divided into 4 groups: normal cell group (without any treatment)， model group (treated with Aβ25-35at 40 μmol/L)， RNA interference (RNAi) group (conducted with HMGB1-siRNA followed by Aβ25-35stimulation) and solvent control group (treated with 0.1% DMSO). After treatment with Aβ25-35for 24 h, the protein levels of HMGB1 and NF-κB in BV-2 cells were determined by Western blot.RESULTSAβ25-35at 40 μmol/L was used to stimulate BV-2 cells. The GFP fluorescence-tagged HMGB1-siRNA (30 nmol/L) was used to transfect BV-2 cells and its transfection efficiency was about 80%～90%. The results of Western blot showed that the protein level of HMGB1 was significantly decreased after the interference of siRNA fragment (P<0.05). The protein levels of HMGB1 and nucleic NF-κB p65 were dramatically increased in BV-2 cells stimulated with Aβ25-35(P<0.05). After RNA interference with HMGB1, the expression of HMGB1 and nucleic NF-κB p65 were significantly decreased in BV-2 cells stimulated with Aβ25-35(P<0.05).CONCLUSIONRNA interference with HMGB1 reduces the expression of nucleic NF-κB in BV-2 cells stimulated with Aβ25-35.

High mobility group box-1 protein; Amyloid β-protein; BV-2 cells; Nuclear factor-κB; RNA interference

1000- 4718(2017)12- 2134- 05

2017- 04- 27

2017- 07- 14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81271204)；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. LY17H090015)；浙江省科技廳公益項(xiàng)目(No. 2016C37098)

△通訊作者 Tel： 0577-88002925； E-mail： lijun0068@163.com

R363.2； R749.1+6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.004

(責(zé)任編輯： 盧 萍， 余小慧)