張廣宇， 賈延劼， 王 軍， 李三松， 唐國皓， 王明梅， 王以文， 朱登納△

(鄭州大學(xué) 1第三附屬醫(yī)院兒童康復(fù)科， 2第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 河南 鄭州 450052)

氯化鋰通過調(diào)節(jié)自噬通路促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞分化*

張廣宇1， 賈延劼2， 王 軍1， 李三松1， 唐國皓1， 王明梅1， 王以文1， 朱登納1△

(鄭州大學(xué)1第三附屬醫(yī)院兒童康復(fù)科，2第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 河南 鄭州 450052)

目的研究氯化鋰(LiCl)對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)神經(jīng)分化的影響，并探討自噬通路在其中的作用。方法體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，細胞分為LiCl組和對照組，采用β-巰基乙醇誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細胞分化，免疫熒光法和Western blot法檢測誘導(dǎo)后神經(jīng)元標志蛋白神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)以及自噬標志蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)的表達變化。進一步采用自噬激活劑雷帕霉素(rapamycin)及自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)干預(yù)自噬，Western blot法觀察NSE和MAP-2的表達變化。結(jié)果誘導(dǎo)分化后，LiCl組及對照組細胞均有NSE和MAP-2表達，LiCl組細胞NSE和MAP-2蛋白陽性表達率及表達量均大于對照組(P<0.05)；此外，LiCl組細胞LC3陽性熒光點以及LC3-Ⅱ表達量亦多于對照組(P<0.05)。加用雷帕霉素可進一步促進LiCl處理的細胞NSE和MAP-2蛋白的表達(P<0.05)，而3-MA則抑制LiCl處理的細胞NSE和MAP-2蛋白的表達(P<0.05)。結(jié)論氯化鋰可能通過調(diào)節(jié)自噬通路促進大鼠骨髓骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞分化。

氯化鋰； 間充質(zhì)干細胞； 自噬； 神經(jīng)細胞； 分化

骨髓間充質(zhì)干細胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是一種成熟干細胞，具有自我更新及向多種細胞分化的潛能，如骨細胞神經(jīng)元和脂肪細胞等[1]，誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細胞分化為神經(jīng)系統(tǒng)疾病如神經(jīng)退行性疾病和缺血缺氧性腦病等的治療帶來了希望[2-3]。但MSCs向神經(jīng)細胞分化的低效率限制了其臨床應(yīng)用，因此設(shè)法提高MSCs向神經(jīng)細胞分化的效率將改善MSCs治療效果。

鋰作為情緒穩(wěn)定劑用于治療雙向性情感障礙已經(jīng)超過60年[4]。近些年，有研究發(fā)現(xiàn)鋰在缺血性卒中、創(chuàng)傷性腦損傷和神經(jīng)性退行性疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護作用[5-7]。在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型中，鋰在腦損傷早期階段能發(fā)揮抗凋亡作用，同時也能發(fā)揮抗炎以及促進神經(jīng)再生的作用[8]。鄧許勇等[9]在體外發(fā)現(xiàn)氯化鋰(lithium chloride，LiCl)能夠促進臍血MSCs向神經(jīng)細胞分化。但LiCl在體外是否能夠促進大鼠MSCs神經(jīng)分化尚不清楚。

細胞的分化過程涉及到形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變，這一過程涉及大量能量需求，各種蛋白(尤其是與干細胞多能性維持相關(guān)的蛋白)和細胞器的分解，同時伴有新的蛋白和新的細胞器的合成。而自噬是細胞內(nèi)蛋白降解的重要機制[10-11]，因此自噬可能在MSCs分化過程中發(fā)揮重要作用。本研究將觀察LiCl對大鼠MSCs神經(jīng)分化以及自噬的影響，了解氯化鋰是否通過調(diào)節(jié)自噬通路促進MSCs神經(jīng)分化。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

SPF級SD大鼠，雌雄不限，體重80～100 g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(豫)2010-0002。

2 主要試劑

低糖DMEM液體培養(yǎng)基購自HyClone；胎牛血清購自Thermo Fisher；兔抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3， LC3)、LC3-Ⅱ多克隆抗體購自Cell Signaling；兔抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase， NSE)、微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein-2， MAP-2)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein， GFAP)多克隆抗體，CD29、CD90、CD34和CD45單克隆抗體均購自Santa Cruz。LiCl、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和雷帕霉素(rapamycin)購自Sigma；Cy3標記的山羊抗兔IgG(H+L)購自上海碧云天公司；其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1細胞的培養(yǎng)及鑒定 全骨髓貼壁法體外分離并培養(yǎng)大鼠MSCs，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為低糖DMEM+10%胎牛血清，傳至第3代時，收獲生長狀態(tài)良好細胞，胰蛋白酶消化制成細胞懸液后，分別加入抗CD29、CD90、CD34和CD45單克隆抗體，同時每管樣品設(shè)立同型陰性對照。避光冰上孵育45 min，用PBS洗滌細胞以除去未結(jié)合抗體，細胞重懸后用流式細胞儀進行檢測分析。

3.2分組及體外誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細胞分化 實驗分為2組：LiCl組和對照(control)組。參考Woodbury等[12]的方法，去除DMEM完全培養(yǎng)基，PBS液清洗3次，加入預(yù)誘導(dǎo)液(DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1 mmol/L β-巰基乙醇)，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。預(yù)誘導(dǎo)后，LiCl組加入誘導(dǎo)液(DMEM培養(yǎng)基+10 mmol/L β-巰基乙醇)和 3 mmol/L LiCl，對照組加入誘導(dǎo)液(DMEM培養(yǎng)基+10 mmol/L β-巰基乙醇)，分別置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6 d。當(dāng)進行自噬干預(yù)實驗時，誘導(dǎo)液除了加入β-巰基乙醇和LiCl，還分別加入1 mmol/L 3-MA或250 nmol/L 雷帕霉素。

3.3免疫熒光染色法 將各組細胞用4%多聚甲醛固定后，封閉液封閉，分別加入稀釋后的 I 抗[LC3-Ⅱ(1∶100)、NSE(1∶100)、MAP-2(1∶100)和GFAP(1∶100)]，4 ℃孵育過夜。Cy3標記的山羊抗兔IgG(1∶200)室溫孵育1 h，DAPI復(fù)染細胞核。在激光共聚焦顯微鏡或倒置熒光顯微鏡下觀察。每組獨立的實驗采集超過20個區(qū)域的細胞，在明視野下所采集的每幅圖像都盡量包含相近的細胞數(shù)目。計數(shù)暗視野陽性細胞數(shù)與明視野細胞總數(shù)，計算陽性細胞比例。

3.4Western blot實驗 分別收集各組細胞，按照1×106加入100 μL Western細胞裂解液[20 mmol/L Tris (pH 7.5)、150 mmol/L NaCl、1% Triton X-100、焦磷酸鈉、β-磷酸甘油、EDTA、Na3VO4和亮肽素等]的比例充分裂解細胞，4 ℃ 12 000×g離心10 min，保留上清，-80 ℃貯存?zhèn)溆?，以BCA法測定總蛋白濃度。SDS-PAGE分離結(jié)束后，取出凝膠轉(zhuǎn)移至同等大小的PVDF膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，加入稀釋后的 I 抗[LC3(1∶1 000)、NSE(1∶1 000)、MAP-2(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)]，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶耦聯(lián)抗兔IgG(1∶2 000)，室溫孵育2 h，用ECL法顯色，暗室中膠片曝光，存儲X光膠片并進行分析。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，符合正態(tài)分布的兩組計量資料采用獨立樣品t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠MSCs表面標記物的鑒定

流式細胞術(shù)檢測大鼠第3代MSCs表面標記物的表達，結(jié)果顯示CD29和CD90陽性率分別為99.15%和98.94%，而CD34和CD45呈陰性，符合MSCs特征，說明MSCs培養(yǎng)成功，見圖1。

Figure 1. The expression of the surface markers in the MSCs analyzed by flow cytometry.

圖1流式細胞術(shù)檢測MSCs表面標記物的表達

2 LiCl對大鼠MSCs神經(jīng)分化的影響

2.1誘導(dǎo)后細胞形態(tài)的變化 對照組誘導(dǎo)6 d后，部分細胞胞體收縮呈圓形和錐形，細胞突起細長，有數(shù)個分支，部分在局部形成網(wǎng)絡(luò)、形成較典型的神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)，少部分細胞脫壁、死亡；LiCl組細胞形態(tài)變化更為迅速和顯著，較少細胞脫壁、死亡。

2.2MSCs誘導(dǎo)后神經(jīng)元標志物的表達 免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)誘導(dǎo)處理6 d后,免疫熒光法觀察到LiCl組細胞NSE和MAP-2蛋白陽性表達率分別為(85.5±4.0)%和(83.5±3.7)%，顯著高于對照組(P<0.05)，各組GFAP表達率均小于1%，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖2A。Western blot實驗結(jié)果顯示誘導(dǎo)后2組NSE和MAP-2均有表達，而LiCl組細胞的NSE和MAP-2蛋白表達均高于對照組(P<0.05)，見圖2B。

3 誘導(dǎo)前后自噬的變化

3.1免疫熒光的觀察結(jié)果 LC3是自噬的生物學(xué)標志蛋白，正常情況下以可溶性的LC3-Ⅰ的形式存在于胞漿中，當(dāng)自噬激活后，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ被募集到自噬體膜上。而通過LC3-Ⅱ免疫熒光染色，自噬體呈現(xiàn)點狀熒光，誘導(dǎo)前細胞未發(fā)現(xiàn)明顯LC3-Ⅱ陽性熒光點，誘導(dǎo)6 d后2組細胞胞漿內(nèi)均可見LC3-Ⅱ陽性熒光點，而LiCl組細胞LC3-Ⅱ陽性熒光點多于對照組(P<0.05),見圖3A。

3.2Western blot實驗結(jié)果 LC3-Ⅱ的多少或者LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值反映了自噬體的形成程度，間接反應(yīng)自噬活性。通過Western blot方法發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)前僅有LC3-Ⅰ表達，未見明顯LC3-Ⅱ表達，而誘導(dǎo)6 d后2組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均相應(yīng)增加，而LiCl組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值高于對照組(P<0.05)，見圖3B。

4 調(diào)控自噬對LiCl組大鼠MSCs神經(jīng)分化的影響

為調(diào)控自噬，將自噬激活劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-MA分別與LiCl同時加入誘導(dǎo)液中，Western blot實驗結(jié)果顯示加入雷帕霉素后NSE和MAP-2表達量較LiCl單處理組明顯增加(P<0.05)，而加入自噬抑制劑3-MA后和NSE、MAP-2表達量較LiCl單處理組明顯減少(P<0.05)，見圖4A、B。

Figure 2. The expression of neuronal markers NSE and MAP-2 in differentiated MSCs. A: immunofluorescence staining of NSE and MAP-2 in differentiated MSCs (×200); B: the protein expression of NSE and MAP-2 in differentiated MSCs was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2誘導(dǎo)分化后的MSCs神經(jīng)元標志物NSE和MAP-2的表達

Figure 3. The expression of autophagic marker LC3 in differentiated MSCs. A: immunofluorescence staining of LC3-Ⅱ in differentiated MSCs (scale bar=20 μm; arrows show LC3-Ⅱ positive dots); B: the protein expression of LC3-I and LC3-II in differentiated MSCs was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3誘導(dǎo)分化后的MSCs自噬標志蛋白LC3的表達

討 論

鋰劑是一種治療雙向情感障礙等精神疾病的常用藥物，而研究發(fā)現(xiàn)它還有促進神經(jīng)再生、抗炎、抗凋亡的功效[13-14]。在腦出血大鼠模型中，鋰通過抑制糖原合成酶激酶3β活性從而減輕出血部位的炎癥反應(yīng)，同時減少血腫周圍細胞的死亡[15]。在大鼠海馬神經(jīng)元中，鋰不僅能夠增加神經(jīng)元樹突長度和數(shù)量，并且還能夠減輕谷氨酸導(dǎo)致的細胞毒性，而其機制在于鋰能夠促進腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，以及抑制促凋亡基因Bax、Bad和caspases-3等的表達[16]。體外研究發(fā)現(xiàn)LiCl能夠促進大鼠神經(jīng)干細胞增殖以及分化為多巴胺神經(jīng)元，并且分化的神經(jīng)元移植到帕金森模型大鼠后能夠存活，并能改善模型大鼠的運動功能，同時也能改善學(xué)習(xí)和記憶能力[17]。當(dāng)用大鼠MSCs移植治療大鼠脊髓損傷時，鋰能夠提高移植后的MSCs的存活率，并且能夠促進移植后的MSCs向神經(jīng)細胞分化[18]。而本研究發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)劑中同時加入3 mmol/L LiCl，誘導(dǎo)6 d后，LiCl組細胞神經(jīng)元標志蛋白NSE和MAP-2陽性表達率及表達量顯著高于對照組，這說明LiCl能夠促進大鼠MSCs向神經(jīng)細胞分化，但具體機制尚不清楚。

Figure 4. The effects of autophagy modulation on the neuronal differentiation of MSCs with LiCl. The protein expression of NSE and MAP-2 in differentiated MSCs after autophagy modulation was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsLiCl group.

圖4自噬調(diào)節(jié)對LiCl處理的MSCs神經(jīng)分化的影響

本研究發(fā)現(xiàn)LiCl組細胞誘導(dǎo)分化后LC3-Ⅱ陽性熒光點明顯高于對照組，且Western blot實驗結(jié)果也顯示LiCl組細胞誘導(dǎo)分化后LC3-Ⅱ表達量較對照組多，提示LiCl能夠提高MSCs的自噬活性。自噬是一個高度保守的胞漿內(nèi)物質(zhì)的蛋白降解機制[19]。目前越來越多證據(jù)表明自噬也參與到發(fā)育及分化過程。在胚胎干細胞誘導(dǎo)分化為成牙本質(zhì)細胞過程中，自噬關(guān)鍵蛋白之一的Atg5表達增加，當(dāng)采用siRNA沉默法抑制Atg5表達后，胚胎干細胞分化效率下降，而采用自噬激活劑雷帕霉素能夠促進胚胎干細胞誘導(dǎo)分化為成牙本質(zhì)細胞[20]。在精子生成過程中，自噬通過降解細胞骨架重組的負調(diào)控蛋白PDLIM1以促進細胞骨架的重組，從而促進精細胞的分化[21]。Notch信號通路是腦內(nèi)神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元的重要的負調(diào)控因子，而Wu等[22]研究發(fā)現(xiàn)自噬能夠降解Notch1進一步抑制Notch信號通路從而促進神經(jīng)再生。既往研究表明大鼠MSCs神經(jīng)分化過程中自噬活性增加，提示自噬可能參與MSCs神經(jīng)分化過程[23]。但LiCl是否通過調(diào)節(jié)自噬而促進MSCs神經(jīng)分化尚不明確。本研究進一步采用自噬激活劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-MA干預(yù)LiCl處理的MSCs自噬水平，結(jié)果顯示加入自噬激活劑雷帕霉素后神經(jīng)元標志蛋白NSE和MAP-2表達量上升，而加入自噬抑制劑3-MA后神經(jīng)元標志蛋白NSE和MAP-2表達量下降，提示提高自噬活性能夠促進MSCs神經(jīng)分化?；谏鲜鼋Y(jié)果我們推測LiCl通過激活自噬從而促進大鼠MSCs向神經(jīng)元方向分化。

綜上所述，我們研究發(fā)現(xiàn)在大鼠MSCs誘導(dǎo)分化過程中加入LiCl能夠提高其神經(jīng)分化效率及細胞自噬活性，因此LiCl可能通過調(diào)節(jié)自噬通路促進大鼠MSCs向神經(jīng)細胞分化，這為進一步探討MSCs神經(jīng)分化機制奠定了基礎(chǔ)。

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Lithium chloride promotes neuronal differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells by modulating autophagy

ZHANG Guang-yu1, JIA Yan-jie2, WANG Jun1, LI San-song1, TANG Guo-hao1, WANG Ming-mei1, WANG Yi-wen1, ZHU Deng-na1

(1DepartmentofChildrenRehabilitation,TheThirdAffiliatedHospital，2DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China.E-mail:zhudengna@126.com)

AIM: To study the influence of lithium chloride (LiCl) on the neuronal differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs), and to explore whether autophagy was involved in this process.METHODSMSCs were isolated and culturedinvitro. The cells were divided into LiCl group and control group. MSCs were treated with β-mercaptoethanol as an inducer for triggering the cells to differentiate into neurons. The expression of neuronal markers-neuron specific enolase (NSE) and microtubule-associated protein-2 (MAP-2), and autophagic marker-microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) were measured by immunofluorescence method and Western blot. An autophagy activator rapamycin and autophagy inhibitor 3-methyladenine (3-MA) were applied to modulate the autophagy in the LiCl treated-cells. The protein expression of NSE and MAP-2 were determined by Western blot.RESULTSAfter induction, the expression of NSE and MAP-2 were increased. The percentage of NSE- and MAP-2-positive cells and the expression of NSE and MAP-2 in the LiCl group were greater than those in control group (P<0.05). After induction, the number of LC3-positive dots and the expression of LC3-Ⅱ in LiCl group were greater than those in control group (P<0.05). The expression of NSE and MAP-2 increased when the autophagy was modulated by rapamycin in LiCl treated-cells, and on the contrary, the expression of NSE and MAP-2 were inhibited as autophagy was modulated by 3-MA.CONCLUSIONLithium chloride may promote the neuronal differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells by modulating autophagy.

Lithium chloride; Mesenchymal stem cells; Autophagy; Neuron; Differentiation

1000- 4718(2017)12- 2128- 06

2017- 04- 20

2017- 08- 03

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 87371385)

△通訊作者 Tel: 0371-66903751； E-mail: zhudengna@126.com

R363; R741

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.003

(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)