王立文，沈曉潔*，吳 倩

(1.無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術學校護理系，江蘇 無錫 214028； 2.中國藥科大學藥學院藥理系，南京 210009)

白藜蘆醇對大鼠血液高凝態(tài)的抑制作用及其 與NF-κB表達的關系

王立文1，沈曉潔1*，吳 倩2

(1.無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術學校護理系，江蘇 無錫 214028； 2.中國藥科大學藥學院藥理系，南京 210009)

研究報告

目的研究白藜蘆醇對于大鼠血液高凝態(tài)形成的影響及其與NF-κB表達的關系。方法SD大鼠分空白組、模型組、白藜蘆醇高劑量組(60 mg/kg)、白藜蘆醇低劑量組(30 mg/kg)和阿司匹林組(10 mg/kg)，連續(xù)灌胃給藥7 d，采用腎上腺素聯(lián)合冰浴法和凝血酶法建立高凝態(tài)大鼠模型，采集血樣測凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)及全血粘度；收集血管內皮細胞，采用蛋白印跡法測NF-κB表達情況。結果空白組、白藜蘆醇高劑量組和阿司匹林組較模型組PT、APTT顯著延長(P< 0.05)，血液粘度顯著降低(P< 0.05)；白藜蘆醇高劑量組血管內皮細胞NF-κB表達較模型組明顯降低(P< 0.05)。結論高劑量白藜蘆醇(60 mg/kg)可抑制大鼠血液高凝態(tài)形成，這種作用可能與其降低NF-κB的表達有關。

白藜蘆醇；高凝態(tài)；NF-κB；大鼠

高凝態(tài)(hypercoagulable state)即中醫(yī)理論中的血瘀證，是心血管疾病最常見的現(xiàn)象，具有血液凝固性增加、血液流變學異常等特點，血液高凝態(tài)人群的血栓栓塞率顯著高于正常人[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇(resveratrol，RSV)可抑制大鼠動靜脈旁路血栓和角叉菜膠小鼠致尾血栓的形成、延長小鼠凝血時間[3]；小鼠NF-κB水平提高時，其動脈血栓的發(fā)生顯著增加[4]。但白藜蘆醇對于高凝態(tài)的影響及其機制未見報道，本研究旨在探索白藜蘆醇對于大鼠血液高凝態(tài)形成的影響，及其與NF-κB表達的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠80只，雌雄各半，8周齡，體重180～220 g，由浙江省實驗動物中心提供[SCXK(浙)2014-0001]，在中國藥科大學藥學實驗動物中心進行實驗操作[SYXK(蘇)2016-0011]。所有動物于實驗開始一周前適應新環(huán)境，每天保持光照、黑暗各12 h的正常晝夜節(jié)律，自由飲食，溫度20～26℃，相對濕度40%～70%，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑及儀器

白藜蘆醇購自中美華東制藥有限公司(98%，HPLC)；阿司匹林購自湖北恒碩化工有限公司(98%，HPLC)；凝血酶購自湖南一格制藥有限公司(批號130722-2)；鹽酸腎上腺素注射液購自上海禾豐制藥有限公司(批號：10141102)；水合氯醛購自國藥集團化學試劑有限公司(批號：20150303)；PT試劑盒(凍干型)(批號：105252)、APTT試劑盒(批號：112176)購自上海太陽生物技術有限公司；NF-κB p65抗體購自Cell signal 公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司(批號：20160718)；DMEM 高糖培養(yǎng)基購自HyClone公司(批號：SH30243.01B)；Ⅰ型膠原酶購自Sigma公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司(批號： CW0014)；Western及IP細胞裂解液(批號：P0013)、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(批號：P0018)、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(5×)(批號：P0015)購自上海碧云天生物技術有限公司；牛血清白蛋白(BSA)購自武漢谷歌生物科技有限公司(批號：G5001)。

AYW8003半自動凝血分析儀(南京瑞麥科技開發(fā)有限公司)；酶標儀(BIO-RAD 680)；SA-5600自動血流變測試儀(北京賽科希德科技發(fā)展有限公司)；Bio-Rad 電泳儀(伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司)；5200 化學發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；常用玻璃、手術器皿等用具。

1.3 實驗方法

1.3.1 白藜蘆醇對腎上腺素聯(lián)合冰浴法致高凝態(tài)大鼠的影響

40只SD大鼠隨機分為五組，即空白組、模型組、白藜蘆醇高劑量組(60 mg/kg)、白藜蘆醇低劑量組(30 mg/kg)和阿司匹林組(10 mg/kg)，雌雄各半。各組均按 1 mL/100 g 給予藥液或生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d，第7天給藥于采血前30 min進行。于第6天進行造模處理：除空白組外其他各組大鼠分別皮下注射鹽酸腎上腺素溶液0.7 mg/kg；2 h后將大鼠置于4℃水浴游泳4 min；再2 h后皮下注射鹽酸腎上腺素溶液0.7 mg/kg?？瞻捉M大鼠皮下注射等體積生理鹽水；2 h給予常溫水浴游泳4 min；再2 h后皮下注射等體積生理鹽水。禁食不禁水飼養(yǎng)12 h后，各組大鼠按3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉，于頸總動脈取血，血樣分為2份，分別置于含枸櫞酸鈉離心管制備血漿和含EDTA離心管內制備全血樣品。血漿樣品用于測定PT、APTT，全血樣品用于血液流變學的測定。

1.3.2 白藜蘆醇對凝血酶致高凝態(tài)大鼠的影響

40只SD大鼠分組同1.3.1，各組均按 1 mL/100 g 給予藥液或生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。第7天給藥后30 min，各組大鼠按3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉，分別于股靜脈注射生理鹽水和凝血酶10 U/kg，60 s后頸總動脈采血制備血漿、全血樣品，測試PT、APTT和全血粘度。

1.3.3 蛋白質免疫印跡檢測大鼠血管內皮細胞NF-κB表達

大鼠經1.3.2處理后，分離并剪下頸動脈、腹主動脈和下腔靜脈，迅速轉移至超凈臺，4℃預冷的1× PBS洗滌血管管腔除去血細胞，縱向剪開血管；于培養(yǎng)皿中加入1 mL膠原酶(1000 U/mL)，血管內膜朝下置于培養(yǎng)皿內，37℃ CO2孵箱孵育60 min；加入6 mL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基沖洗血管內膜，轉移溶液和血管至離心管，吹打數(shù)次后棄去血管，1000 r/min離心5 min收集內皮細胞；4℃預冷的1×PBS洗滌細胞3次，置于冰上，加入RIPA裂解液裂解30 min，轉移裂解液及細胞碎片至1.5 mL離心管，4℃ 12 000 r/min離心15 min；收集上清，采用BCA法測定總蛋白濃度；取一定量蛋白上樣，于10%聚丙烯酰氨凝膠電泳分離，根據Marker切下目標蛋白所在部位凝膠，PVDE膜轉膜處理，5%BSA封閉；加入NF-κB、β-actin抗體4℃孵育過夜；TBST洗滌3次；加入二抗室溫孵育1 h；TBST洗滌三次；加入ECL化學發(fā)光試劑曝光顯影，Image J 軟件進行圖像數(shù)據分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 白藜蘆醇對腎上腺素冰浴致高凝態(tài)大鼠凝血指標和血液粘度的作用

各組大鼠經給藥、腎上腺素聯(lián)合冰浴造模處理后，其血漿PT、APTT數(shù)值如圖1所示，血液粘度值如表1所示。同模型組相比，空白組與阿司匹林組PT值顯著延長(P< 0.05)，白藜蘆醇高劑量與低劑量組PT值與模型組差異無顯著性?？瞻捉M、白藜蘆醇高劑量組和阿司匹林組APTT值較模型組顯著延長(P< 0.05)，而白藜蘆醇低劑量組APTT值與模型組差異無顯著性。低剪切力(5/s)和中剪切力(30/s)下，空白組、白藜蘆醇高劑量組、阿司匹林組較空白組血液粘度降低，白藜蘆醇低劑量組與空白組差異無顯著性；高剪切力(200/s)下，各組與模型組均差異無顯著性。

注：A：PT值；B：APTT值。同模型組相比，* P < 0.05。圖1 白藜蘆醇對腎上腺素聯(lián)合冰浴致高凝態(tài) 大鼠血漿PT、APTT值影響Note.A: PT value；B: APTT value. Compared with model, * P < 0.05.Fig.1 Effect of resveratrol on the plasma PT and APTT values in rats with hypercoagulable state caused by adrenaline and ice bath表1 白藜蘆醇對腎上腺素冰浴致高凝態(tài)大鼠血液粘度影響Tab.1 The effect of resveratrol on blood viscosity of rats with hypercoagulable state caused by adrenaline and ice bath

組別Group5/s30/s200/s空白組Control1466±073?780±054?558±046模型組Model1716±249931±086586±043RSV高劑量組RSV(H)1460±119?840±056?591±060RSV低劑量組RSV(L)1725±176892±102586±071阿司匹林組Aspirin1481±132?820±085?555±036

注：與模型組相比，*P< 0.05。

Note.Compared with the model group,*P< 0.05.

2.2 白藜蘆醇對凝血酶致高凝態(tài)大鼠凝血指標和血液粘度的作用

各組大鼠經給藥、凝血酶造模處理后，其血漿PT、APTT數(shù)值如圖2所示，血液粘度值如表2所示。同模型組相比，空白組與阿司匹林組PT值顯著延長(P< 0.05)，白藜蘆醇高劑量與低劑量組PT值與模型組無明顯差異?？瞻捉M、白藜蘆醇高劑量組和阿司匹林組APTT值較模型組顯著延長(P< 0.05)，而白藜蘆醇低劑量組APTT值與模型組差異無顯著性。低剪切力(5/s)下，空白組、白藜蘆醇高劑量組、阿司匹林組較空白組血液粘度降低，白藜蘆醇低劑量組與空白組差異無顯著性；中剪切力(30/s)下，空白組、阿司匹林組較模型組血液粘度顯著降低，白藜蘆醇高劑量和低劑量組與模型組差異無顯著性；高剪切力(200/s)下，各組與模型組均差異無顯著性。

2.3 蛋白質免疫印跡檢測白藜蘆醇對高凝態(tài)大鼠血管內皮中NF-κB表達的影響

大鼠經給藥、凝血酶造模后，血管內皮中NF-κB的表達情況如圖3所示；空白組和白藜蘆醇高劑量組NF-κB較模型組明顯減少(P< 0.05)，白藜蘆醇低劑量組和阿司匹林組與模型組差異無顯著性。

3 討論

高凝態(tài)或稱血栓前狀態(tài)(prethrombotic state)、促血栓狀態(tài)(prothrombotic state)、促凝狀態(tài)(procoagulant state)，因其誘發(fā)的動靜脈血栓栓塞事件在全球特別是發(fā)達國家逐漸增加，近二十年來相關的研究越來越受到重視[5]。高凝態(tài)多見于惡性疾病患者、孕婦、房顫和人工關節(jié)置換及老年人等人群[6]。2010年，全球因血栓栓塞死亡的人數(shù)占據總死亡人數(shù)的25%[7]。血液高凝態(tài)具有很強的血栓形成趨勢，但相關的研究及治療措施較少，因此針對高凝態(tài)的治療藥物及相關機制研究具有重要意義。

注：A：PT值；B：APTT值。同模型組相比，* P < 0.05。圖2 白藜蘆醇對凝血酶致高凝態(tài)大鼠血漿PT、APTT值影響Note.A: PT value；B: APTT value. Compared with model group，* P < 0.05.Fig.2 Effect of resveratrol on the plasma PT and APTT values in rats with hypercoagulable state caused by thrombin表2 白藜蘆醇對凝血酶致高凝態(tài)大鼠血液粘度影響Tab.2 Effect of resveratrol on the blood viscosity of rats with hypercoagulable state caused by thrombin

組別Groups5/s30/s200/s空白組Control1433±1．16?775±110?552±055模型組Model1695±2．50927±109589±045RSV高劑量組RSV(H)1452±1．05?856±085575±063RSV低劑量組RSV(L)1680±1．37917±104556±060阿司匹林組Aspirin1442±1．35?782±123?546±031

注：與模型組相比，*P< 0.05。

Note.Compared with the model group,*P< 0.05.

注：A：蛋白質免疫印跡的結果；B：NF-κB與β-actin 光密度之比。同模型組相比，* P < 0.05。圖3 白藜蘆醇對凝血酶致高凝態(tài)大鼠血管內皮 NF-κB表達的影響Note.A: Result of western blotting；B: Optical density ratio of NF-κB/β-actin. Compared with the model group, * P < 0.05.Fig.3 Effect of resveratrol on the expression of NF-κB in vascular endothelial cells of rats with hypercoagulable state caused by thrombin

白藜蘆醇是一種天然多酚化合物，最早發(fā)現(xiàn)于白藜蘆根部，存在于多種植物如漿果、花生特別是葡萄皮內，具有抗炎、抗氧化、抗增殖、心血管保護等作用[8-10]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過降低血小板聚集、增加血管內皮細胞一氧化氮的合成具有抗血栓活性[3]；在實驗性腦血栓研究中，白藜蘆醇可減輕腦血栓引發(fā)的伊文氏藍藍染和腦水腫，對腦血栓的發(fā)生具有抑制作用[11]。NF-κB家族包含五個成員：RelA/p65、RelB, c-Rel、NF-κB 1/p50, and NF-κB 2/p52，其中NF-κB p50/p65異源二聚體是轉錄因子Rel家族的主要成員，非活性狀態(tài)下NF-κB二聚體與IκB結合位于細胞質內，活化狀態(tài)下NF-κB二聚體與IκB分離并轉移入核[12,13]。小鼠動脈血栓研究發(fā)現(xiàn)，當NF-κB水平升高時，其血栓的發(fā)生顯著增加[4]；大鼠下腔靜脈結扎誘導深靜脈血栓研究顯示，正常靜脈內皮細胞中NF-κB表達極低，深靜脈血栓形成后其表達量明顯增加[14]；此外，大鼠骨損傷靜脈血栓的發(fā)生也伴隨著內皮細胞NF-κB表達的增加[15]，說明NF-κB可能參與血栓的發(fā)生。因此，本研究旨在探索白藜蘆醇對于大鼠血液高凝態(tài)的影響及NF-κB表達在其中的作用。

本研究以腎上腺素聯(lián)合冰浴法和凝血酶法建立高凝態(tài)大鼠模型[16，17]，以PT、APTT和血液粘度為高凝態(tài)檢測指標，以阿司匹林為陽性對照，探究白藜蘆醇對于高凝態(tài)大鼠凝血相關指標及血管內皮表達NF-κB的影響。研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠NF-κB/p65較空白組的表達明顯增加(P< 0.05)，提示大鼠血液高凝態(tài)的形成可能與血管內皮細胞NF-κB/p65的表達增加有關；高劑量白藜蘆醇(60 mg/kg)可顯著延長高凝態(tài)模型大鼠的PT和APTT值，降低全血粘度，同時降低NF-κB/p65的表達(P< 0.05)，提示白藜蘆醇抑制大鼠高凝態(tài)的形成可能與降低NF-κB的表達有關。綜上所述，高劑量白藜蘆醇(60 mg/kg)可抑制腎上腺素聯(lián)合冰浴法和凝血酶法所致的大鼠血液高凝態(tài)形成，這種抑制作用可能與其抑制血管內皮NF-κB的表達有關。

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InhibitoryeffectofresveratrolonthehypercoagulablestateinratsanditsrelationshipwiththeexpressionofNF-κB

WANG Li-wen1， SHEN Xiao-jie1*， WU Qian2

(1.Department of Nursing, Wuxi Healthcare Vocational Technology School, Wuxi 214028, China； 2.Faculty of Pharmacology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009)

ObjectiveThe topic of this study was to study the inhibitory effect of resveratrol on hypercoagulable state in rats and its relationship with the expression of NF-κB.MethodsRats were divided into control and model groups, and resveratrol (high dose, 60 mg/kg), resveratrol (low dose, 30 mg/kg) and aspirin (10 mg/kg) were given by intragastric administration for 7 d. Then, the rats were treated by adrenaline with ice bath or thrombin to generate hypercoagulable state. Blood samples were collected to test the prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT) and blood viscosity. Vascular endothelial cells were collected to detect the expression of NF-κB by western blotting.ResultsPT and APTT values of rats in the control, resveratrol (high dose) and aspirin groups were significantly increased than the model group (P< 0.05). Blood viscosity of rats in the control, resveratrol (high dose) and aspirin groups was significantly lower than the model group (P< 0.05). The expression of NF-κB was decreased than that of the model group (P< 0.05).ConclusionsResveratrol in high dose (60 mg/kg) can inhibit hypercoagulable state of rat, which may be related with its effect on decreasing the expression of NF-κB.

Resveratrol; Hypercoagulable state; NF-κB; Rats

無錫市醫(yī)院管理中心科研項目(YGZXM1533)。

王立文(1968-)，男，副教授，研究方向：外科、危急癥教學。E-mail:jshywxwlw@aliyun.com

沈曉潔(1971-)，女，副教授，研究方向：病理、病理生理研究。E-mail: wxwxsxj@sina.com

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0079-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.014

2017-04-05