劉 明，鄧 穎，劉 楊，陳 運(yùn)

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550025； 2.國家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴陽 550002)

飛龍掌血提取物對(duì)高脂血癥心肌缺血小鼠氧化 損傷的影響

劉 明1,2，鄧 穎1，劉 楊1，陳 運(yùn)1

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550025； 2.國家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴陽 550002)

研究報(bào)告

目的觀察飛龍掌血提取物(Toddaliaasiaticaextract，TAE)對(duì)高脂血癥心肌缺血小鼠氧化損傷的影響，初步探討TAE對(duì)心血管保護(hù)作用的機(jī)制。方法選用雄性KM小鼠，隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、辛伐他汀組、TAE高、低劑量組，除對(duì)照組外，其余各組均用牛奶代替水自由飲用，誘導(dǎo)高脂血癥。同時(shí)灌胃給予相應(yīng)的藥物，每天一次，連續(xù)28 d。于試驗(yàn)結(jié)束72 h前分3次皮下注射鹽酸異丙腎上腺素(isoprenaline hydrochloride，Iso)，造成心肌缺血模型。檢測小鼠體重、心電圖、心臟和肝臟指數(shù)、心肌含水量、血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GPx)活性。結(jié)果TAE可改善模型小鼠心肌缺血心電圖變化，降低體重，抑制心臟、肝臟指數(shù)，降低心肌含水量；降低血清TC、TG、LDL-C含量，升高血清HDL-C含量；降低血清MDA含量，升高血清SOD、GPx活性。結(jié)論TAE可能通過調(diào)節(jié)氧自由基代謝，改善氧化損傷，發(fā)揮其保護(hù)心血管的作用。

飛龍掌血；高脂血癥；心肌缺血；氧化損傷

盡管醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得了長足的發(fā)展，但心血管疾病仍然是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因之一，每年大約有1800萬人死于心血管疾病[1]。動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病的根本原因，脂質(zhì)代謝異常是動(dòng)脈粥樣硬化最重要的危害因素[2]。大量研究表明，脂質(zhì)過氧化參與心血管疾病從發(fā)生到發(fā)展以及惡化的全過程，調(diào)控氧自由基代謝是心血管疾病治療的一種可靠、有效的手段[3,4]。

飛龍掌血為蕓香科植物飛龍掌血ToddaliaasiaticaLam.的根或根皮，為貴州苗族習(xí)用藥材[5]。藥理研究表明其具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗病毒、保護(hù)心肌等作用[6,7]。因此，飛龍掌血顯示潛在的對(duì)心血管疾病的治療作用。本研究利用牛奶誘導(dǎo)高脂血癥及異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌缺血小鼠模型，探討飛龍掌血是否通過調(diào)節(jié)氧自由基代謝、降血脂等環(huán)節(jié)，實(shí)現(xiàn)對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠，雄性，體重(20±2)g，50只，購自中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK-(軍)2014-0011]。動(dòng)物飼養(yǎng)于貴州省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工程技術(shù)中心[SYXK(黔)2012-0001]，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(25±2)℃和濕度(55±2)%，自由進(jìn)食，每日光照/黑暗各12 h。并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑

飛龍掌血提取物(TAE)是由飛龍掌血根皮提取獲得(飛龍掌血根皮購自貴陽市藥材市場，加8倍70%乙醇回流提取2次，濾液經(jīng)水沉淀后，濃縮干燥，提取率為10%)，臨床人日用生藥量為10～30 g，本研究依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬定人日用生藥量為12 g，折算為提取物為1.2 g；辛伐他汀片(每片10 mg)，山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司；鹽酸異丙腎上腺素注射液(1 mg/mL)，上海禾豐制藥有限公司；TC、TG、LDL、HDL、SOD、MDA、GPx試劑盒，南京建成生物工程研究所；山花純牛奶(每袋200 mL)，貴陽三聯(lián)乳業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

MS-200生物信號(hào)記錄儀，成都泰盟科技有限公司；TGL-12 GB-C臺(tái)式高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；FA3204電子分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；721分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；ZS-3型酶標(biāo)儀，北京新風(fēng)機(jī)電廠。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組、給藥及高脂血癥模型制備

將50只小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組(control)、模型組(model)、辛伐他汀組(SVTT，5 mg/kg)、飛龍掌血提取物高、低劑量組(TAE，400、100 mg/kg)，每組10只，灌胃給予相應(yīng)的藥物，20 mL/kg，每天一次，連續(xù)28 d，對(duì)照組和模型組灌胃等容積生理鹽水。同時(shí)，參照文獻(xiàn)方法[8]制備高脂血癥模型：除對(duì)照組外，其余各組小鼠每天以牛奶代替水飲用(在飲水瓶中加入足量牛奶，每天更換新鮮牛奶)，各組均以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食。

1.4.2 小鼠冠狀動(dòng)脈痙攣性心肌缺血的誘導(dǎo)

參照文獻(xiàn)方法[9]造模：于末次給藥前72 h，除空白對(duì)照組外，于灌胃給藥30 min后，各組動(dòng)物皮下注射Iso 20 mg/kg，對(duì)照組給予等容量的生理鹽水，連續(xù)3次，每間隔24 h，誘發(fā)冠狀動(dòng)脈痙攣心肌缺血。

1.4.3 觀察指標(biāo)及檢測

第3次皮下注射Iso前，小鼠用20%烏拉坦(7.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，與MS-200生物信號(hào)記錄儀相連，先描記一段注射Iso前的心電圖，然后皮下注射Iso，記錄30 min的II導(dǎo)聯(lián)心電圖。主要觀察陽性標(biāo)準(zhǔn)T波和ST段，參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[10]，具備以下條件之一者即可判斷為心肌缺血陽性，①心電圖ST段水平上抬或向下偏移>0.1 mV；②T波高聳超過同導(dǎo)聯(lián)R波的1/2及以上者。每間隔10 min記錄一次小鼠II導(dǎo)聯(lián)心電圖，共記錄30 min，分別測量Ⅱ?qū)?lián)在各時(shí)刻ST段偏移的幅度，計(jì)算各組Ⅱ?qū)?lián)注射Iso前與注射Iso后各時(shí)刻ST段偏移幅度的差值△ST。

上述檢測完成后，心臟取血，3500 r/min離心15 min，取上清液，按照試劑盒說明書操作，檢測血清TC、TG、LDL、HDL、SOD、MDA、GPx含量。

取心臟、肝臟，用實(shí)際分度值為0.1 mg的電子分析天平精密稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器重÷體重×100%。

將心臟置于烘箱中80℃烘干，取出精密稱重，計(jì)算心肌含水量。心肌含水量=(心臟濕重-心臟干重)÷心臟濕重×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體重、臟器指數(shù)及心肌含水量的變化

結(jié)果顯示模型組小鼠體重明顯增加，心臟和肝臟指數(shù)、心肌含水量顯著升高；與模型組相比，TAE高劑量組能顯著降低小鼠心臟指數(shù)，TAE高、低劑量組均能明顯降低小鼠體重、肝臟指數(shù)和心肌含水量(P< 0.01，P< 0.05)。如表1所示。

2.2 心電圖變化

模型組小鼠S-T段缺血改變明顯，各時(shí)刻ST段偏移幅度的差值顯著增加；與模型組相比，TAE高、低劑量組均能明顯改善小鼠心肌缺血變化，各時(shí)刻ST段偏移幅度的差值顯著下降(P< 0.01，P< 0.05)。如表2、圖1所示。

2.3 血清血脂水平的變化

模型組小鼠血清TC、TG、LDL含量顯著升高，血清HDL含量明顯降低；與模型組相比，TAE高劑量組能顯著降低小鼠血清LDL含量，TAE高、低劑量組均能顯著降低血清TC、TG含量并升高血清HDL含量(P< 0.01，P< 0.05)。如表3所示。

2.4 血清SOD、MDA、GPx水平的變化

模型組小鼠血清SOD、GPx含量明顯降低，MDA含量顯著升高；與模型組相比，TAE高、低劑量組均能顯著降低血清MDA含量，升高SOD、GPx含量(P< 0.01，P< 0.05)。如圖2所示。

表1 對(duì)模型小鼠體重和臟器指數(shù)的影響Tab.1 Effects of TAE on the body weight, heart and liver indexes of the model mice

注：與模型組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。表2、3、4同。

Note.Compared with the model group，*P< 0.05，**P< 0.01. The same as in Tab. 2, 3, 4.

表2 對(duì)模型小鼠心電圖的影響Tab.2 Effects of TAE on electrocardiogram of the model mice

圖1 對(duì)模型小鼠心電圖的影響Fig.1 Effects of TAE on electrocardiogram of the model mice表3 對(duì)模型小鼠血清TC，TG，LDL，HDL含量的影響Tab.3 Effects of TAE on the serum contents of TC，TG，LDL and HDL of the model mice

組別Groups劑量/mg/kgDosesTCTGLDLHDL對(duì)照組Controlgrouo—087±016?058±018??056±016??046±017?模型組Modelgroup—104±016088±019080±014030±011辛伐他汀組SVTTgroup5089±015?070±018?062±015?041±014?飛龍掌血組400086±023?071±021?067±015?043±018?TAEgroup100083±017?066±017?070±021044±016?

注：與模型組相比，* P< 0.05，** P< 0.01。圖2 對(duì)模型小鼠血清SOD、MDA、GPx水平的影響Note.Compared with the model group，* P< 0.05，** P< 0.01.Fig.2 Effects of TAE on the levels of serum SOD, MDA and GPx of the model mice.

3 討論

引起高脂血癥的原因很多，其中最常用的是給動(dòng)物喂飼高脂飼料或高脂乳劑，但因飼料過于油膩、膽鹽具有苦味等而影響動(dòng)物的進(jìn)食，動(dòng)物的體重并無明顯增長，不能形成肥胖癥；且在不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)動(dòng)物血脂檢測TC、TG、HDL、LDL的差異較大[11]；且油脂對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)境也造成一定的污染。吳爭榮等[8]用牛奶喂養(yǎng)小鼠，成功建立了高脂血癥動(dòng)物模型。該方法與常用的高脂血癥造模方法相比，投入成本相對(duì)較少，又避免了室內(nèi)由于高脂飼料導(dǎo)致氣味難聞等缺點(diǎn)，造模比較簡單、經(jīng)濟(jì)、有效，且小鼠在比較自然的條件下造模，所以更加符合人類高脂血癥的形成特點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，給小鼠飲用牛奶，可使小鼠的進(jìn)食量明顯增加，牛奶和飲食量過多，導(dǎo)致體內(nèi)脂肪蛋白過剩，進(jìn)而引起體內(nèi)脂肪累積，引起高脂血癥，造成模型組小鼠的體重明顯增加，肝臟指數(shù)顯著升高，血清TC、TG、LDL含量顯著升高，血清HDL水平明顯下降。經(jīng)飛龍掌血治療后，小鼠的體重明顯降低，肝臟指數(shù)顯著下降，血清TC、TG、LDL含量顯著降低，血清HDL水平明顯上升，表明飛龍掌血對(duì)牛奶引發(fā)的高脂血癥具有顯著的抑制作用。

近年研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的缺血性心臟病是由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)引起的，高脂血癥是AS的重要促進(jìn)因素[12]。高脂血癥本身引起的死亡并不多見，但高脂血癥由于脂質(zhì)代謝紊亂、脂質(zhì)過氧化、血液流變學(xué)異常等[13]，易引起AS、冠心病、高血壓、糖尿病等多種疾病，嚴(yán)重危害人類健康，因此高脂血癥及其引發(fā)的疾病的預(yù)防和治療已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)。大量研究表明，高脂血癥造成機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂的同時(shí)及心肌缺血時(shí)均會(huì)引起機(jī)體氧化與抗氧化平衡失調(diào)，即機(jī)體氧自由基產(chǎn)生增加而自由基相關(guān)清除酶活力下降[14,15]。SOD是體內(nèi)清除氧自由基的關(guān)鍵酶，反映機(jī)體清除氧自由基的能力。MDA 是過氧化脂質(zhì)氧化分解的產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞膜及細(xì)胞功能具有一定的損傷作用，同時(shí)干擾脂肪酸的氧化降解。GPx 是一種重要的過氧化物分解酶，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對(duì)細(xì)胞的損傷。本研究結(jié)果顯示，飛龍掌血對(duì)高脂血癥心肌缺血小鼠心肌具有保護(hù)作用，表現(xiàn)為小鼠心臟指數(shù)顯著降低、心肌含水量下降，明顯改善心電圖S-T段，降低血清MDA含量，升高血清SOD、GPx水平，說明飛龍掌血通過增加高脂血癥心肌缺血小鼠的心肌抗氧化能力和減少氧自由基的產(chǎn)生，以減少細(xì)胞損傷，保護(hù)心肌細(xì)胞。

本研究對(duì)飛龍掌血提取物降血脂、抗心肌缺血和抗氧化的作用機(jī)制做了初步的探討，發(fā)現(xiàn)飛龍掌血提取物可有效降低高血脂和改善心肌缺血損傷，改善脂質(zhì)代謝紊亂和脂質(zhì)過氧化，為進(jìn)一步開發(fā)利用飛龍掌血植物資源和研制新藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

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ProtectiveeffectsofToddaliaasiaticaextractonoxidativedamagesinmicewithmyocardialischemiaandhyperlipidemia

LIU Ming1,2， DENG Ying1， LIU Yang1， CHEN Yun1

(1.Basic Medical School，Guiyang College of Chinese Medicine，Guiyang 550025，China; 2.National Engineering and Technological Research Center of Miao Medicine，Guiyang 550002)

ObjectiveTo explore the effects ofToddaliaasiaticaextract(TAE)on oxidative damages in mice with myocardial ischemia and hyperlipidemia.MethodsFifty SPF male KM mice were randomly divided into 5 groups：control group，model group，simvastatin group (5 mg/kg)，high-dose TAE group (400 mg/kg) and low-dose TAE group (100 mg/kg). Hyperlipidemia was induced by feeding milk for 4 weeks. At the same time，the corresponding drug was given by oral administration with 20 mL/kg for 28 d. At the end of four-week treatment, isoprenaline hydrochloride (Iso) was subcutaneously injected every 24 hours for three times. The body weight, electrocardiogram, heart and liver indexes, myocardial water content, and the serum levels of TC, TG, HDL, LDL, SOD, MDA and GPx were measured.ResultsTAE significantly improved the electrocardiogram changes induced by Iso and milk in the mice, weight lose, inhibited the heart and liver indexes, reduced the myocardial water content, decreased the levels of TC, TG, LDL and MDA, and increased the contents of HDL, SOD and GPx.ConclusionsTAE may play an important role in cardiovascular protection by regulating oxygen free radical metabolism and improving oxidative damages.

Toddaliaasiatica; Hyperlipidemia; Myocardial ischemia; Oxidative damages

貴州省科學(xué)技術(shù)基金(黔科合J字[2012]2087號(hào))；貴陽中醫(yī)學(xué)院博士基金(2011年)；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合院士站[2014]4013號(hào))。

劉明(1981-)，男，博士，副教授，研究方向：中藥、民族藥防治心腦血管疾病藥理研究。E-mail： 393617518@qq.com

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0051-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.009

2017-05-24