呂經(jīng)緯，王佳婧，胡 剛

(1.白城醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，吉林 白城 137000； 2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 大連 116000)

谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增 殖、凋亡及膠原合成的影響

呂經(jīng)緯1，王佳婧1，胡 剛2

(1.白城醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，吉林 白城 137000； 2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 大連 116000)

研究報(bào)告

目的探索谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(keloid fibroblasts，KF)抑制作用的研究。方法0(對(duì)照組)，3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的谷甾醇-3-O-葡萄糖苷作用KF細(xì)胞48 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，EdU染色法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞中COL I、COL III含量。結(jié)果3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL谷甾醇-3-O-葡萄糖苷能顯著的降低KF細(xì)胞活力(P< 0.01)，提高細(xì)胞增殖抑制率(P< 0.01)，IC50=(27.54±2.18)μg/mL。與對(duì)照組比較，12.5、25、50 μg/mL谷甾醇-3-O-葡萄糖苷能顯著的降低細(xì)胞增殖率(P< 0.01)，提高細(xì)胞早期及晚期凋亡率(P< 0.01)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期(P< 0.01)，同時(shí)還能顯著的降低細(xì)胞中COL I、COL III含量(P< 0.01)。結(jié)論谷甾醇-3-O-葡萄糖苷能顯著的抑制KF細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)還能抑制膠原的合成。

谷甾醇-3-O-葡萄糖苷；瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞；增殖；凋亡；抑制

瘢痕疙瘩是皮膚受損后，創(chuàng)傷部位在愈合過(guò)程中成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖導(dǎo)致膠原過(guò)度沉積的結(jié)果，又稱(chēng)為結(jié)締組織增生癥[1-3]。在臨床上，瘢痕疙瘩呈現(xiàn)類(lèi)似腫瘤樣，不僅能夠無(wú)限增殖還具有浸潤(rùn)性，能夠侵襲正常組織，且復(fù)發(fā)率極高[1-3]。瘢痕疙瘩在過(guò)度增生的過(guò)程中會(huì)使患者產(chǎn)生嚴(yán)重的瘙癢、疼痛，不僅影響患者的外觀，甚至?xí)o患者帶來(lái)心理疾病及功能障礙[1-3]。獨(dú)角蓮(Typhonium giganteum Engl.)又稱(chēng)為“白附子”，是我省著名的中草藥，屬于天南星科(Araceae)犁頭尖屬植物，具有清熱解毒、祛風(fēng)止攣等功效，目前藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)獨(dú)角蓮具有顯著的抗腫瘤作用，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，療效較為顯著[4-6]。同時(shí)課題組前期還證實(shí)獨(dú)角蓮根莖水提取物對(duì)于瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞具有顯著的抑制作用，但是提取物是混合物，成分復(fù)雜，并沒(méi)有闡明其具體作用機(jī)制[7]。而本課題組先前研究證實(shí)谷甾醇-3-O-葡萄糖苷是獨(dú)角蓮根莖提取物主要成分之一，且谷甾醇-3-O-葡萄糖苷又稱(chēng)為胡蘿卜苷，對(duì)于多種腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力的抑制效果較佳，并闡述了相關(guān)機(jī)制[8-11]，因此本研究推測(cè)谷甾醇-3-O-葡萄糖苷可能也會(huì)對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，所以本課題組將對(duì)此展開(kāi)研究。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

谷甾醇-3-O-葡萄糖苷購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、膠原酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI流式雙染試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司；EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州市銳博生物科技技術(shù)有限公司；COL I、COL III酶聯(lián)免疫吸附試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；MK3酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；TS100倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(KF)的制備

本研究所需要的瘢痕疙瘩組織塊由吉林大學(xué)附屬二院整形科提供。在無(wú)菌條件下用PBS緩沖液清洗組織塊，并用手術(shù)剪將組織塊沿著無(wú)菌的小燒杯壁剪成1 mm3左右的組織塊，后將組織塊平鋪于培養(yǎng)瓶中，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在3～5 d左右的時(shí)候?qū)⒏≡谂囵B(yǎng)基中組織塊洗去，并加入少量新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)觀察組織塊中細(xì)胞游離出來(lái)的情況，當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞密度達(dá)到80%的時(shí)候，把培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液棄去，換成新鮮培養(yǎng)液，并用0.25%的胰蛋白酶消化，以1∶2的比例進(jìn)行傳代，取第3～5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。同時(shí)參考相關(guān)文獻(xiàn)，在倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，用免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞中CD73、CD90、CD105陽(yáng)性率，結(jié)果均證實(shí)KF細(xì)胞純度達(dá)到98%以上，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[2, 3]。

1.2.2 MTT法檢測(cè)KF細(xì)胞活力

將8×103個(gè)KF細(xì)胞接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后，0(對(duì)照組)，3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的谷甾醇-3-O-葡萄糖苷作用KF細(xì)胞48 h后，加入20 μL的MTT(終濃度為5 mg/mL)孵育4 h后，小心將96孔板中的上清液吸取并舍棄，再加入150 μL的二甲基亞砜，震蕩使結(jié)晶物溶解，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)560 nm處測(cè)OD值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1 - 實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.3 EdU染色檢測(cè)KF細(xì)胞增殖情況

將8×103個(gè)KF細(xì)胞接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后，12.5、25、50 μg/mL的谷甾醇-3-O-葡萄糖苷作用細(xì)胞48 h后，每孔加入50 μM的EdU染液100 μL并孵育2 h，PBS洗滌3次；接著加入4%多聚甲醛固定30 min，后加入50 μL濃度為2 mg/mL的甘氨酸搖床孵育5 min，同時(shí)加入100 μL的0.5%的TritonX-100進(jìn)行滲透加強(qiáng)，PBS洗滌3次。緊接著每孔加入100 μL的1× Apollo染色液于室溫避光反應(yīng)30 min，PBS洗滌3次。每孔繼續(xù)加入100 μL的Hoechst 33342染色液，于室溫避光反應(yīng)30 min，PBS洗滌3次。最后于熒光顯微鏡下觀察并拍照。EdU染紅色，Hoechst染藍(lán)色。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)KF細(xì)胞凋亡情況

將1.0×104個(gè)KF細(xì)胞接種到6孔板，12.5、25、50 μg/mL的谷甾醇-3-O-葡萄糖苷作用細(xì)胞48 h后，每組首先收集1×105/mL個(gè)細(xì)胞，再將500 μL的結(jié)合緩沖液加入細(xì)胞中并吹打混勻后，接著將5 μL的Annexin V-FITC及5 μL的PI按順序加入已混合均勻的細(xì)胞中，繼續(xù)吹打混勻，并在室溫條件下避光孵育10 min，于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)KF細(xì)胞周期

將1.0×104個(gè)KF細(xì)胞接種到6孔板，12.5、25、50 μg/mL的谷甾醇-3-O-葡萄糖苷作用細(xì)胞48 h后，每組首先收集1×105/mL個(gè)細(xì)胞，再加入5 μL的RNase(終濃度為10 mg/mL)，吹打混勻后，37℃孵育1 h，再加入PI染液，吹打混勻并于室溫避光孵育30 min，1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)分析。

注：與對(duì)照組比較，** P< 0.01。圖1 不同濃度的谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)KF細(xì)胞活力的影響 Note.Compared with the control group,** P< 0.01.Fig.1 Effect of different doses of sitostero-3-O-glucoside on KF cell viability

1.2.6 ELISA法檢測(cè)KF細(xì)胞中COL I、COL III 含量

將1.0×104個(gè)KF細(xì)胞接種到6孔板，12.5、25、50 μg/mL的谷甾醇-3-O-葡萄糖苷作用細(xì)胞48 h后，利用0.25%胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，接著分別按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞中COL I、COL III 含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)KF細(xì)胞活力的影響

如圖1所示，0(對(duì)照組)、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的谷甾醇-3-O-葡萄糖苷作用KF細(xì)胞48 h，經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著給藥濃度的增加，KF細(xì)胞活力逐漸降低(P< 0.01)，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高(P< 0.01)，且IC50=(27.54±2.18)μg/mL，所以本實(shí)驗(yàn)選擇12.5、25、50 μg/mL的谷甾醇-3-O-葡萄糖苷作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的作用濃度。

2.2 谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)KF細(xì)胞增殖能力的影響

如圖2所示，0(對(duì)照組)，12.5，25，50 μg/mL的谷甾醇-3-O-葡萄糖苷作用KF細(xì)胞48 h，經(jīng)EdU實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，12.5、25、50 μg/mL能顯著的降低KF細(xì)胞增殖率(P< 0.01)。

2.3 谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)KF細(xì)胞凋亡的影響

如圖3，表1所示，0(對(duì)照組)、12.5、25、50 μg/mL的谷甾醇-3-O-葡萄糖苷作用KF細(xì)胞48 h，經(jīng)Annexin V-FITC/PI流式雙染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，12.5、25、50 μg/mL能顯著的提高KF細(xì)胞早期凋亡率及晚期凋亡率(P< 0.01)。

2.4 谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)KF細(xì)胞周期的影響

如表1所示，0(對(duì)照組)、12.5、25、50 μg/mL的谷甾醇-3-O-葡萄糖苷作用KF細(xì)胞48 h，經(jīng)流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，12.5、25、50 μg/mL能逐漸的使KF細(xì)胞周期阻滯在G期(P< 0.01)。

2.5 谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)KF細(xì)胞中COL I、COL III含量的影響

如表2所示，0(對(duì)照組)、12.5、25、50 μg/mL的谷甾醇-3-O-葡萄糖苷作用KF細(xì)胞48 h，經(jīng)ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，12.5、25、50 μg/mL能逐漸的降低KF細(xì)胞中COL I、COL III 含量(P< 0.01)。

3 討論

成纖維細(xì)胞是瘢痕疙瘩的主要效應(yīng)細(xì)胞，眾多研究證實(shí)在皮膚受損時(shí)候，原本處于靜止?fàn)顟B(tài)的成纖維細(xì)胞大量增殖，同時(shí)合成膠原對(duì)受損的機(jī)體進(jìn)行修復(fù)，但是當(dāng)矯枉過(guò)正后，導(dǎo)致創(chuàng)面的局部組織過(guò)度的膠原纖維化，形成了蟹足樣的外觀，影響患者形態(tài)，并使患者產(chǎn)生巨大的心理負(fù)擔(dān)，甚至引起了功能障礙[1-3]。因此抑制成纖維細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減少膠原的合成并促進(jìn)膠原的降解成為瘢痕疙瘩治療的主要方式。谷甾醇-3-O-葡萄糖苷又稱(chēng)為胡蘿卜苷，是本課題組從獨(dú)角蓮提取物中分離出來(lái)，本課題組先前研究證實(shí)獨(dú)角蓮的水提取物對(duì)于KF細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用[7]。另外研究還表明谷甾醇-3-O-葡萄糖苷能顯著的抑制肝癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲[8-11]，進(jìn)而提示谷甾醇-3-O-葡萄糖苷可能對(duì)KF細(xì)胞生物學(xué)行為具有顯著的影響。

注：與對(duì)照組比較，##P < 0.01。圖2 谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)KF細(xì)胞增殖能力的影響Note.Compared with the control group,##P < 0.01.Fig.2 Effect of sitostero-3-O-glucoside on KF cell proliferation

圖3 谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)KF細(xì)胞增殖凋亡的影響Fig.3 Effect of sitostero-3-O-glucoside on KF cell apoptosis表1 谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)KF細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響Tab.1 Effect of sitostero-3-O-glucoside on KF cell apoptosis and cell cycle

組別Groups細(xì)胞凋亡Cellapoptosis細(xì)胞周期Cellcycle早期凋亡率/%Earlyapoptoticrate晚期凋亡率/%LateapoptoticrateG1期G1phageS期SphageG2期G2phage對(duì)照組Controlgroup232±024342±0344032±4032242±0223726±372125μg/mL組125μg/mLgroup459±126??1228±123??4638±464??1909±020??3453±345??25μg/mL組25μg/mLgroup789±078??1790±172??5475±547??1834±018??2691±269??50μg/mL組50μg/mLgroup4019±402??1957±196??6793±679??1377±014??1830±183??

注：與對(duì)照組比較，**P< 0.01。

Note.Compared with the control group,**P< 0.01.

表2 谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)KF 細(xì)胞中COL I、COL III含量的影響Tab.2 Effect of sitostero-3-O-glucoside on the level of COL I and COL III in KF cells

注：與對(duì)照組比較，**P< 0.01。

Note.Compared with the control group,**P< 0.01.

所以本研究首先利用MTT法檢測(cè)3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)KF細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明隨著給藥濃度的增加，KF細(xì)胞活力逐漸降低，細(xì)胞增殖抑制率逐漸提高，且IC50=(27.54±2.18)μg/mL，所以本實(shí)驗(yàn)選擇12.5、25、50 μg/mL的谷甾醇-3-O-葡萄糖苷作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的作用濃度。接著本研究繼續(xù)采用EdU染色檢測(cè)谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)KF細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明谷甾醇-3-O-葡萄糖苷能顯著的降低細(xì)胞增殖率。為進(jìn)一步證實(shí)谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)KF細(xì)胞增殖的抑制作用，本研究接著利用annexin V-FITC/PI流式雙染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)KF細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明谷甾醇-3-O-葡萄糖苷能顯著的提高KF細(xì)胞早期凋亡率及晚期凋亡率。另外細(xì)胞的凋亡受限制，細(xì)胞的無(wú)限增殖來(lái)源于細(xì)胞周期的不可控制，特別是在細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)G1，G2及S期，這幾個(gè)調(diào)控點(diǎn)也是腫瘤藥物作用靶點(diǎn)之一[12, 13]。所以本研究繼續(xù)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)KF細(xì)胞周期的影響，結(jié)果表明谷甾醇-3-O-葡萄糖苷能使細(xì)胞周期阻滯于G1期，說(shuō)明谷甾醇-3-O-葡萄糖苷能阻斷細(xì)胞于DNA復(fù)制前期，進(jìn)而遏制細(xì)胞有絲分裂，最終阻斷細(xì)胞復(fù)制增殖。同時(shí)瘢痕的形成是膠原不斷沉積的后果，膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，研究發(fā)現(xiàn)在疙瘩瘢痕形成過(guò)程中COL I、COL III轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，在組織中含量豐富[14]。因此一定程度上的減少膠原的合成也能減輕疙瘩瘢痕的進(jìn)一步發(fā)展。所以本研究繼續(xù)利用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)KF細(xì)胞中膠原含量的影響，結(jié)果表明谷甾醇-3-O-葡萄糖苷能顯著的降低COL I、COL III 含量。

而細(xì)胞的增殖、凋亡受細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等相關(guān)基因的調(diào)控，如Bcl-2家族、PCNA、Cyclin D1、CDK4/CDK6等，且上述蛋白在疙瘩瘢痕組織中的作用較為明確[1]。另外疙瘩瘢痕組織中的膠原沉積與TGF-β信號(hào)通路關(guān)系最為密切，TGF-β信號(hào)通路不僅能夠促進(jìn)KF細(xì)胞增殖還能夠誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)成分的不斷合成，進(jìn)一步的促進(jìn)膠原沉積[15]。因此進(jìn)一步的探討谷甾醇-3-O-葡萄糖苷對(duì)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及TGF-β信號(hào)通路的影響，將可能是本課題將來(lái)的研究方向。

綜上所述，12.5，25，50 μg/mL的谷甾醇-3-O-葡萄糖苷能顯著的降低KF細(xì)胞活力及增殖率，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，同時(shí)還能減少細(xì)胞中COL I、COL III 的合成。

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Effectofsitostero-3-O-glucosideonproliferation,apoptosisandcollagensynthesisofkeloidfibroblasts

LV Jing-wei1， WANG Jia-jing1， Hu Gang2

(1.Baicheng Medical College，Baicheng 137000，China； 2.The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116000)

ObjectiveTo explore the effect of sitostero-3-O-glucoside on proliferation, apoptosis and collagen synthesis of keloid fibroblasts (KF).MethodsCell viability was measured by MTT assay after cells were cultured with 0 (control), 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL sitostero-3-O-glucoside. Cell proliferation was measured by EdU staining. Cell apoptotic rate and cell cycle were measured by flow cytometry. The level of COL I and COL III was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Results3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL sitostero-3-O-glucoside reduced cell viability (P< 0.01), increased inhibitory rate of cell proliferation (P< 0.01), IC50=27.54±2.18 μg/mL. Compared with the control group, 12.5, 25, 50 μg/mL sitostero-3-O-glucoside reduced the cell proliferation rate (P< 0.01), increased the cell early and late apoptotic rates (P< 0.01), the cell cycle was arrested at G1 phase (P< 0.01), and the levels of COL I and COL III were down-regulated (P< 0.01).ConclusionsThe results show that sitostero-3-O-glucoside can significantly inhibit the proliferation, induce cell apoptosis and inhibit the synthesis of collagen of keloid fibroblasts.

Sitostero-3-O-glucoside; Keloid fibroblasts(KF); Collagen fibers; Proliferation; Apoptosis; Inhibition

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究規(guī)劃項(xiàng)目(吉教科合字[2014]第451號(hào))。

呂經(jīng)緯(1983-)，男，碩士研究生，研究方向：疤痕疙瘩。E-mail： 185985928@qq.com

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0046-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.008

2017-04-28