董 翔，劉江偉，王金泉，許永華，李佳佳，馬 娜

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052； 2.新疆軍區(qū)總醫(yī)院新疆特殊環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830002)

姜黃素對沙漠干熱環(huán)境下大鼠腸黏膜損傷及氧 化應(yīng)激的影響

董 翔1,2，劉江偉2*，王金泉1*，許永華2，李佳佳2，馬 娜2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052； 2.新疆軍區(qū)總醫(yī)院新疆特殊環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830002)

研究報(bào)告

目的探討姜黃素預(yù)處理對沙漠干熱環(huán)境下大鼠腸黏膜的保護(hù)作用。方法雄性SPF級大鼠80只，隨機(jī)分為生理鹽水對照組(NC組)40只、姜黃素預(yù)處理組(HDC組)40只。NC組生理鹽水灌胃，HDC組200 mg/kg姜黃素灌胃，連續(xù)7 d，每天1次。將各組大鼠置于模擬沙漠干熱環(huán)境的實(shí)驗(yàn)艙中，溫度：(41±0.5)℃，相對濕度：(10±2)%。在0、50、100、150 min時間點(diǎn)，分別隨機(jī)取出NC組、HDC組大鼠(每組10只)，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，留取回腸樣本進(jìn)行病理學(xué)觀察評分及氧化應(yīng)激指標(biāo)CAT、SOD、MDA的檢測。結(jié)果在0、50 min時間點(diǎn)，HDC組較NC組病理損傷評分無顯著性差異(P> 0.05)；在100、150 min時間點(diǎn)，HDC組病理損傷評分較NC組顯著降低(P< 0.01)。在50、100、150 min時間點(diǎn)，HDC組CAT、SOD活力較NC組顯著升高(P< 0.05或P< 0.01)，HDC組MDA含量較NC組顯著降低(P< 0.05或P< 0.01)。暴露于干熱環(huán)境中，NC組腸黏膜病理損傷評分與CAT、SOD活力呈負(fù)相關(guān)(r=-0.9128，r=-0.9125，均P< 0.01)，與MDA含量呈正相關(guān)(r=0.9258，P< 0.01)。結(jié)論姜黃素預(yù)處理對沙漠干熱環(huán)境下大鼠腸黏膜具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與姜黃素抑制腸黏膜氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

姜黃素；腸黏膜；氧化應(yīng)激；沙漠干熱環(huán)境

中暑是由內(nèi)源性的新陳代謝產(chǎn)熱及外源性的高溫環(huán)境，或兩者共同作用下引起的一種繼發(fā)于熱損傷之后的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，并有可能引發(fā)多器官功能障礙(MODS)甚至死亡[1]。腸道作為人和脊椎動物最大的儲菌庫和屏障系統(tǒng)是熱打擊的首發(fā)器官，其損傷后造成的內(nèi)毒素泄露，是誘導(dǎo)熱應(yīng)激向中暑發(fā)生發(fā)展的始動因素[2]。沙漠干熱環(huán)境具有氣候干燥炎熱、體表水分蒸發(fā)量大、日照時間長、降雨量少、植被稀疏和紫外線強(qiáng)度高等特點(diǎn)，長時間處于這樣的環(huán)境中激增了中暑的發(fā)病風(fēng)險[3]。本課題組前期研究表明姜黃素預(yù)處理能顯著提高大鼠在沙漠干熱環(huán)境中的生存時間[4]，因此我們推測姜黃素可能對大鼠腸黏膜具有保護(hù)作用，本研究進(jìn)一步探討姜黃素對沙漠干熱環(huán)境下大鼠腸黏膜損傷及氧化應(yīng)激的影響，為預(yù)防沙漠干熱環(huán)境下中暑和改善預(yù)后提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD雄性大鼠80只，體重210～230 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(新)2016-0003]。實(shí)驗(yàn)及相關(guān)操作在新疆軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物科SPF級動物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行[SYXK(新)2016-0003]。動物實(shí)驗(yàn)均獲新疆軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并遵照國家科學(xué)委員會要求予以關(guān)懷照顧。

1.2 主要試劑與儀器

姜黃素(日本化成株式會社)；BCA蛋白檢測試劑盒(美國Themo Scientific)；MDA、SOD、CAT檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙(新疆軍區(qū)總醫(yī)院研制)；光學(xué)顯微鏡CH20(Olympus)；酶標(biāo)儀M550(日本Bio-Rad)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組

所購大鼠在SPF級動物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，溫度：(21±2)℃，相對濕度：(45±5)%。將80只大鼠隨機(jī)分為2組(每組40只)：生理鹽水對照組(NC組)，生理鹽水灌胃；姜黃素預(yù)處理組(HDC組)，200 mg/kg姜黃素(溶解于0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液中)灌胃，每天1次，持續(xù)7 d，灌胃期間滅菌飼料和水自由攝取。灌胃結(jié)束后第1天提前12 h禁食，將各組大鼠置于西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙中，實(shí)驗(yàn)艙模擬沙漠干熱環(huán)境，溫度：(41±0.5)℃，相對濕度：(10±2)%，并禁食禁水。

1.3.2 樣本采集

在0、50、100、150 min時間點(diǎn)，分批次隨機(jī)取出NC組、HDC組大鼠(每組10只)。3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔深度麻醉后，距離回-盲腸交界約1 cm處迅速截取回腸組織學(xué)樣本2份，一份回腸樣本用液氮冰凍后儲存于-80°C冰箱，用于氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測，另一份回腸樣本置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于蘇木素-伊紅染色及光學(xué)顯微鏡下病理學(xué)觀察及評分。

1.3.3 病理學(xué)觀察及評分

回腸樣本固定24 h后，進(jìn)行石蠟包埋、切片、H&E染色、中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡觀察大鼠回腸組織病理學(xué)變化。每張切片隨機(jī)選取10個視野，采用Chiu’ s[5]評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行量化，平均10個視野的評分之和，記為每張切片的病理學(xué)損傷評分。

1.3.4 腸黏膜CAT、SOD、MDA的測定

從-80℃冰箱取出回腸樣本，稱量100 mg樣本置于玻璃勻漿器中，并加入200 μL預(yù)冷的PBS，充分勻漿后加入700 μL預(yù)冷的PBS。4℃離心機(jī)3500 r/min離心10 min，取上清液即為10%的回腸組織勻漿液。分裝后，嚴(yán)格按試劑盒產(chǎn)品說明書提供方法測定回腸組織勻漿液中CAT活力、SOD活力、MDA含量。

注：(A)0 min NC組；(B)50 min NC組；(C)100 min NC組；(D)150 min NC組；(E)0 min HDC組；(F)50 min HDC組；(G)100 min HDC組；(H)150 min HDC組。圖1 回腸病理學(xué)損傷變化(Bar=100 μm) (A)NC group, 0 min.(B)NC group, 50 min.C)NC group, 100 min. D)NC group, 150 min.(E)HDC group, 0 min.(F)HDC group, 50 min.(G)HDC group, 100 min.(H)HDC group, 150 min.Fig.1 Pathological changes of the rat ilea

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腸黏膜病理學(xué)損傷變化

光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在0 min時間點(diǎn)，NC組、HDC組腸黏膜上皮細(xì)胞完整，無病理學(xué)損傷(見圖1 A、E)。在50 min時間點(diǎn)，NC組、HDC組病理學(xué)變化以固有層頂部毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，偶見上皮細(xì)胞與固有層之間水腫、間隙增大為主(見圖1B、F)。在100 min時間點(diǎn)，NC組腸黏膜部分上皮細(xì)胞脫落，固有層裸露(見圖1C)；HDC組腸黏膜固有層邊緣輕度水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，頂部上皮細(xì)胞排列紊亂(見圖1G)。在150 min時間點(diǎn)，NC組腸黏膜上皮細(xì)胞片狀壞死脫落，固有層裸露、邊緣毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，固有層中大量嗜中性粒細(xì)胞侵潤(見圖1D)；HDC組腸黏膜頂部固有層邊緣毛細(xì)血管充血，上皮細(xì)胞嗜酸變，偶見頂部上皮細(xì)胞脫落(見圖1H)。

2.2 腸黏膜病理學(xué)損傷評分

如圖2所示，NC組、HDC組腸黏膜病理學(xué)損傷評分隨干熱暴露時間的延長呈上升趨勢。在0、50 min時間點(diǎn)，NC組較HDC組病理損傷評分差異無顯著性(P> 0.05)，在100、150 min時間點(diǎn)，HDC組病理損傷評分較NC組均降低(P< 0.01)。

注：與NC組比較，** P< 0.01。圖2 回腸病理學(xué)損傷評分Note.Compared with the NC group，** P< 0.01.Fig.2 Pathological injury scores of the rat ilea

2.3 腸黏膜CAT、SOD、MDA的變化

如圖3-A所示，NC組、HDC組回腸CAT活力隨干熱暴露時間的延長呈下降趨勢。在0 min時間點(diǎn)，組間CAT活力差異無顯著性(P> 0.05)；在50 min時間點(diǎn)，HDC組CAT活力較NC組升高(P< 0.05)；在100 min時間點(diǎn)，HDC組CAT活力較NC組升高(P< 0.01)；在150 min時間點(diǎn)，HDC組CAT活力較NC組升高(P< 0.01)。

注：與NC組比較，* P< 0.05，** P< 0.01。圖3 回腸氧化應(yīng)激指標(biāo)變化 Note.Compared with the the NC group，* P< 0.05，** P< 0.01.Fig.3 Changes of oxidative stress indexes in the rat ilea

如圖3-B所示，NC組、HDC組回腸SOD活力隨干熱暴露時間的延長呈下降趨勢。在0 min時間點(diǎn)，組間SOD活力差異無顯著性(P> 0.05)；在50、100、150 min時間點(diǎn)，HDC組SOD活力較NC組升高(P< 0.01)。

如圖3-C所示，NC組、HDC組回腸MDA含量隨干熱暴露時間的延長呈上升趨勢。在0 min時間點(diǎn)，組間MDA含量差異無顯著性(P> 0.05)；在50 min時間點(diǎn)，HDC組MDA含量較NC組降低(P< 0.05)；在100 min時間點(diǎn)，HDC組MDA含量較NC組降低(P< 0.01)；在150 min時間點(diǎn)，HDC組MDA含量較NC組降低(P< 0.01)。

2.4 病理學(xué)損傷評分與CAT、SOD、MDA的相關(guān)性分析

在沙漠干熱環(huán)境下NC組大鼠回腸病理損傷評分與氧化應(yīng)激指標(biāo)CAT、SOD、MDA的相關(guān)性分析中，病理學(xué)損傷評分與CAT活力呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.9128，P< 0.01)；病理學(xué)損傷評分與SOD活力呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.9125，P< 0.01)，病理學(xué)損傷評分與MDA含量呈顯著正相關(guān)(r=0.9258，P< 0.01)。

3 討論

中暑時心排血量增加，并通過分流胃腸道血液到皮膚和肌肉來最大限度的散發(fā)熱量[6]。腸黏膜血流量減少、灌注不足及熱應(yīng)激時細(xì)胞的高代謝需求產(chǎn)生大量活性氧，將造成腸上皮細(xì)胞和基質(zhì)的氧化應(yīng)激損傷[7]。ROS產(chǎn)生于細(xì)胞的基本生理過程(例如：呼吸)，在正常的生理狀態(tài)下具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生理機(jī)能和活性的功能[8]，并由超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、硫氧化還蛋白(TRX)、過氧化氫酶(CAT)、谷氧還蛋白(GRX)等抗氧化物酶作為自由基清除劑調(diào)節(jié)ROS的濃度水平[9]。線粒體處于ATP合成的中心是ROS產(chǎn)生的重要來源，也是對細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境應(yīng)激最為敏感的細(xì)胞器之一[10]。有證據(jù)表明持續(xù)的高溫，可導(dǎo)致ATP合成減少，細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，線粒體通透性改變，線粒體中產(chǎn)生過量的ROS，損害蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA，進(jìn)一步降低線粒體能量合成效率并通過興奮性級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生更多的氧自由基，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死[11]。因此維持ROS產(chǎn)物與抗氧化防御系統(tǒng)之間的動態(tài)平衡是保證細(xì)胞正常功能必不可少的條件。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著沙漠干熱環(huán)境下暴露時間的延長，大鼠腸黏膜病理損傷程度不斷加重，腸黏膜抗氧化物酶CAT、SOD活力呈下降趨勢，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量呈上升趨勢，腸黏膜病理損傷評分與CAT、SOD、MDA的活力或含量呈顯著相關(guān)性，提示暴露于沙漠干熱環(huán)境導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)是造成大鼠腸黏膜損傷的重要原因之一。

姜黃多年生姜科屬植物，在中國和印度的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有幾百年的應(yīng)用歷史，被廣泛的使用在多種疾病的治療[12]。姜黃素是從干燥姜黃的根莖中提取的一種天然的疏水性多酚類化合物，是其中主要的活性成分。有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素的烯醇形式具有清除自由基的能力，使姜黃素具有抗氧化性[13]。另有研究認(rèn)為姜黃素通過化學(xué)分子式中的酚羥基及β-二酮以提供質(zhì)子的方式，調(diào)節(jié)細(xì)胞中多條信號傳導(dǎo)通路，發(fā)揮其抗氧化的作用[14]。Cucolas等[15]發(fā)現(xiàn)姜黃素可以上調(diào)小腸中TRAIL的含量，抑制COX-2、NF-κB的表達(dá)，減輕腸黏膜缺血再灌注造成的病理損傷和氧化應(yīng)激。Kim等[16]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)信號通路上調(diào)尿液中的SOD濃度，下調(diào)MDA濃度抑制腎臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用。Yang等[17]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素通過抑制Notch信號通路，改善H2O2刺激內(nèi)皮細(xì)胞造成的氧化應(yīng)激損傷，降低ROS含量和細(xì)胞凋亡指數(shù)。Salh等[18]發(fā)現(xiàn)二硝基苯磺酸(DNB)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型，可通過飼喂添加含有0.25%姜黃素的飼料，抑制NF-κB通路和p38絲裂原活化蛋白激酶活化，降低結(jié)腸iNOS表達(dá)和嗜中性粒細(xì)胞侵潤。但關(guān)于姜黃素對沙漠干熱環(huán)境下中暑大鼠腸黏膜氧化應(yīng)激損傷的研究尚未見報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)在50 min時間點(diǎn)，NC組、HDC組腸黏膜病理學(xué)損傷以固有層頂部毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，偶見上皮細(xì)胞與固有層之間水腫、間隙增大為主，NC組較HDC組病理損傷評分無顯著性差異，這可能與熱應(yīng)激早期機(jī)體處于代償期，導(dǎo)致ROS誘發(fā)抗氧化能力增強(qiáng)有關(guān)。在100、150 min時間點(diǎn)，姜黃素預(yù)處理各組腸黏膜病理損傷程度降低，CAT、SOD活力增加，MDA含量降低，提示姜黃素預(yù)處理可能通過提高腸黏膜抗氧化物酶活力，抑制ROS過量產(chǎn)生導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對腸黏膜具有一定的保護(hù)作用。

總之，暴露于沙漠干熱環(huán)境中大鼠腸黏膜損傷程度隨暴露時間的延長而不斷加重，而姜黃素預(yù)處理對沙漠干熱環(huán)境下大鼠腸黏膜具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與姜黃素抑制腸黏膜氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

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Protectiveeffectofcurcuminontheintestinalinjuryandoxidativestressinratsindryandhotdesertenvironment

DONG Xiang1,2, LIU Jiang-wei2*, WANG Jin-quan1*, XU Yong-hua2, LI Jia-jia2, MA Na2

(1.College of Veterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China； 2.The Key Laboratory of Special Environmental Medicine of Xinjiang, General Hospital of Xinjiang Military Region, Urumqi 83000)

ObjectiveTo investigate the protective effect of curcumin pretreatment on the intestinal mucosa in rats in dry and hot desert environment.MethodsEighty male SPF grade rats were randomly divided into saline control group (NC group) and curcumin pretreatment group (HDC group) (40 in each group). Rats in the NC group were gavaged with saline, and rats in the HDC group were gavaged with curcumin (200 mg/kg), once a day for 7days. The rats were placed in a cabin simulating the dry and hot desert environment (41±0.5)℃ and relative humidity of (10±2)%. Rats were randomly taken from each groups (n=10) and sacrificed with 3% sodium pentobarbital intraperitoneally at 0 min, 50 min, 100 min and 150 min time points. The ileal tissue was stained for histological examination and oxidative stress index was detected.ResultsAt time points 0 min and 50 min, the pathological injury scores of the HDC group were not significantly different compared with the NC group (P> 0.05). At time points 100 min and 150 min, the pathological injury scores of the HDC group were significantly decreased compared with the NC group (P< 0.01). At time points 50 min, 100 min and 150 min, the CAT and SOD activity of HDC group were significantly increased compared with the NC group (P< 0.05 orP< 0.01). The MDA content of HDC group were significantly decreased compared with the NC group (P< 0.05 orP< 0.01). Exposed to dry and hot environment, the pathological injury scores of the NC group were negatively correlated with CAT and SOD activity (r=-0.9128,r=-0.9125,P< 0.01), and positively correlated with MDA content (r=0.9258,P< 0.01).ConclusionsCurcumin pretreatment can protect the intestinal mucosa of rats in dry-heat environment of desert, and curcumin can alleviate the pathological damages of intestinal mucosa by inhibiting the oxidative stress in intestinal mucosa.

Curcumin; Intestinal mucosa; Oxidative stress; Dry and hot environment; desert

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015211C231)。

董翔(1982-)，男，碩士研究生。研究方向：實(shí)驗(yàn)動物學(xué)。E-mail： 49834420@qq.com

劉江偉(1970-)，男，教授，博士后。研究方向：特殊環(huán)境醫(yī)學(xué)研究。E-mail： ljw273@sohu.com。

王金泉(1975-)，男，教授，博士。研究方向：動物生長發(fā)育調(diào)控。E-mail： wangjinquan163@163.com。*共同通訊

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0028-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.005