李燕，宋佳成，嚴(yán)海浪，黃君文，陸鈺，馬占龍，施海彬

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

腱糖蛋白-C在載脂蛋白E基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不同時(shí)期表達(dá)的變化

李燕，宋佳成，嚴(yán)海浪，黃君文，陸鈺，馬占龍，施海彬

目的：探討腱糖蛋白-C（TN-C） 在載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過(guò)程中不同時(shí)期表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。 方法：取雄性SPF級(jí)ApoE-/-小鼠50只（模型組），高脂飼料喂養(yǎng)，建立小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，雄性SPF級(jí)野生型C57BL/6小鼠50只為對(duì)照組，同樣高脂飲食。分別于喂養(yǎng)4、8、16、24、32周時(shí)處死小鼠，檢測(cè)血脂，顯微鏡觀(guān)察斑塊病理改變并進(jìn)行定量分析，免疫組化方法檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)TN-C表達(dá)。 結(jié)果：模型組小鼠總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C） 水平均高于對(duì)照組小鼠（P均＜0.05）。隨著造模時(shí)間的進(jìn)展，模型組小鼠斑塊面積及斑塊面積／管腔面積比值不斷增加，各時(shí)期比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。模型組小鼠斑塊內(nèi)TN-C表達(dá)量隨著動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展而增多，32周小鼠斑塊內(nèi)部TN-C表達(dá)升高最顯著，高于 8、16、24 周小鼠（分別為 0.49±0.07 vs 0.04±0.02、0.12±0.03、0.21±0.04，P＜0.05）。 結(jié)論：TN-C的表達(dá)量隨著斑塊進(jìn)展不斷增加，可能與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展及斑塊不穩(wěn)定性有關(guān)。

動(dòng)脈粥樣硬化；載脂蛋白E類(lèi)；小鼠，基因敲除；腱糖蛋白

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:1217.)

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種以進(jìn)行性脂質(zhì)沉積、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生為特征的慢性炎癥過(guò)程，是引起急性心腦血管事件的主要原因。腱糖蛋白-C（TN-C）是一種細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，主要由巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞合成，參與了AS相關(guān)的諸多細(xì)胞生理病理過(guò)程，包括促進(jìn)各種細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡[1]。TN-C在動(dòng)脈血管壁損傷時(shí)的表達(dá)增高，對(duì)于AS斑塊的形成及破潰具有重要作用[2]。對(duì)AS不同時(shí)期斑塊內(nèi)TN-C的表達(dá)進(jìn)行動(dòng)態(tài)病理學(xué)觀(guān)察，有利于AS進(jìn)展程度的分析，并可早期發(fā)現(xiàn)易損斑塊，為AS的預(yù)防和治療提供新的參考指標(biāo)。

1 材料與方法

動(dòng)物模型建立：雄性SPF級(jí)載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠（8周齡，體重 20～22 g，n=50，模型組），購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；雄性SPF級(jí)野生型C57BL/6小鼠（8周齡，體重20～22 g，n=50，C57BL/6小鼠為同源對(duì)照鼠為對(duì)照組，購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心）。兩組小鼠均給予高脂飲食（經(jīng)典“西方膳食”[3]，膽固醇0.15%，脂肪21%，購(gòu)自北京科奧協(xié)力飼料有限公司）喂養(yǎng)，飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22℃～25℃，相對(duì)濕度60%，光-暗周期12 h，自由飲水和進(jìn)食。分別于飼養(yǎng)4、8、16、24、32周后進(jìn)行血脂水平測(cè)定和病理學(xué)觀(guān)察，檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化模型建立情況。

主要試劑及儀器：抗鼠Tenascin-C抗體（Invitrogen公司，美國(guó)），Envision試劑盒（Dako公司，美國(guó)），全自動(dòng)生化分析儀（Beckman Coulter AU5800， 美國(guó)），顯微鏡（Olympus BX43，日本）。

觀(guān)察指標(biāo)：（1）血脂測(cè)定：兩組小鼠分別于飼養(yǎng)4、8、16、24、32周時(shí)處死，處死前12 h禁食不禁水。采用10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉后，摘眼球取血，常規(guī)靜置血液30 min后，離心15 min，離心力1 307×g，離心后取上清，-80℃冰箱保存。采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C） 含量。（2）主動(dòng)脈組織病理檢查：小鼠眼球采血后，過(guò)量麻醉處死小鼠，取出主動(dòng)脈，用生理鹽水沖洗干凈，剪下鄰近主動(dòng)脈弓的降主動(dòng)脈1.0～1.5 cm放入10%甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋備用。蘇木素伊紅染色（HE染色）：各時(shí)期分別取5只(共25只)小鼠石蠟塊用切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度3 μm。每間隔5張切片取1張進(jìn)行HE染色，普通光鏡觀(guān)察血管及斑塊的形態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)描述；每個(gè)標(biāo)本共取3張切片用Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)量，取斑塊面積平均值代表每只小鼠的主動(dòng)脈斑塊面積。免疫組織化學(xué)分析：剩余的25只小鼠石蠟塊用于免疫組化分析，免疫組化染色采用Envision法，將切片常規(guī)脫蠟至水，微波抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液（PBS，主要成分：磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉，濃度：0.01 mol/L，pH：7.4）沖洗3 min×3次，切片置于濕盒中，滴入一抗（稀釋度為1:100），置于37℃孵育箱孵育1 h，PBS沖洗3 min×3次；滴入Envision，置于37℃孵育箱孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色，鏡下控制染色時(shí)間，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，脫水，烤干，中性樹(shù)膠封片備用。利用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察斑塊內(nèi)TN-C表達(dá)及分布情況，棕黃色為T(mén)N-C表達(dá)陽(yáng)性，并用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算陽(yáng)性面積比（陽(yáng)性反應(yīng)面積／總測(cè)量面積），具體方法為每張切片隨機(jī)選取2個(gè)視野測(cè)量，取平均值代表各標(biāo)本的陽(yáng)性面積比值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)各組血脂水平進(jìn)行比較。模型組組內(nèi)各時(shí)期TN-C表達(dá)量比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組小鼠不同時(shí)期血脂水平比較（表1）

表1 兩組小鼠不同時(shí)期血脂水平（mmol/L, n=50,

表1 兩組小鼠不同時(shí)期血脂水平（mmol/L, n=50,

注：TC：血清總膽固醇；TG：甘油三酯；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇。對(duì)照組：高脂喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠；模型組：高脂喂養(yǎng)的ApoE基因敲除小鼠。與同周齡對(duì)照組比較aP＜0.05

模型組ApoE-/-小 鼠 TC、LDL-C水平均較同周齡對(duì)照組小鼠升高（P＜0.05）；模型組小鼠除第4周及32周TG水平較對(duì)照組升高外（P＜0.05）， 其余時(shí)期兩組TG、HDL-C水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

兩組小鼠主動(dòng)脈HE染色形態(tài)學(xué)改變（圖1）

光鏡下，對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜完整，內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞排列整齊規(guī)則，無(wú)AS斑塊形成（圖 1A）。模型組小鼠AS 4周內(nèi)膜較對(duì)照組小鼠稍增厚，管腔內(nèi)徑未見(jiàn)明顯異常（圖1B）；模型組小鼠AS 8周可見(jiàn)內(nèi)膜增厚，脂質(zhì)沉積，脂紋形成及血管內(nèi)皮突起（圖 1C）；模型組小鼠AS 16周可見(jiàn)明顯粥樣斑塊形成，膠原沉積，覆蓋脂質(zhì)成份形成纖維帽（圖 1D）；模型組小鼠AS 24周斑塊深部有柳葉狀膽固醇結(jié)晶堆積，纖維帽明顯變薄，斑塊隆起明顯（圖 1E）； 模型組小鼠AS 32周斑塊面積進(jìn)一步增大，深部可見(jiàn)壞死物質(zhì)，管腔明顯狹窄（圖 1F）。

模型組小鼠AS斑塊面積比較（表2）: 從喂養(yǎng)4～32周動(dòng)態(tài)觀(guān)察結(jié)果來(lái)看，對(duì)照組小鼠均無(wú)斑塊形成，而模型組小鼠自喂養(yǎng)8周起均有斑塊形成，并且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，模型組小鼠斑塊面積大小和斑塊面積／管腔面積比值呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，并且各時(shí)期相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

兩組小鼠AS斑塊內(nèi)TN-C免疫組化結(jié)果比較:光鏡下觀(guān)察各組小鼠主動(dòng)脈TN-C免疫組化染色，對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈幾乎無(wú)TN-C的表達(dá)，模型組小鼠除第4周無(wú)表達(dá)外，其余各階段均有TN-C表達(dá)（圖2）。各時(shí)期陽(yáng)性面積比結(jié)果（圖3）：AS 32周小鼠斑塊內(nèi)部TN-C表達(dá)升高最顯著，高于8、16、24周小鼠 (分別為 0.49±0.07 vs 0.04±0.02、0.12±0.03、0.21±0.04)，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各時(shí)期主動(dòng)脈病理改變（蘇木素伊紅染色, ×100）

表2 模型組小鼠各時(shí)期主動(dòng)脈斑塊面積、管腔面積及斑塊面積/管腔面積

表2 模型組小鼠各時(shí)期主動(dòng)脈斑塊面積、管腔面積及斑塊面積/管腔面積

注：模型組：高脂喂養(yǎng)的載脂蛋白E基因敲除小鼠；*：同項(xiàng)各周小鼠比較P均＜0.05。采用帶拍照功能的光學(xué)顯微鏡觀(guān)察HE切片斑塊形成情況，并采集圖片，使用Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)量圖片中斑塊面積及管腔面積

4周 5 0 0.81±0.08 0

圖2 免疫組化分析模型組各時(shí)期斑塊內(nèi)TN-C表達(dá)

圖3 模型組高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠各時(shí)期TN-C表達(dá)量的半定量分析比較（各時(shí)期n=5）

3 討論

ApoE-/-小鼠是目前公認(rèn)的研究AS疾病的最經(jīng)典動(dòng)物模型之一，ApoE-/-小鼠可自發(fā)形成AS，與人類(lèi)AS形成過(guò)程相似[4]，高脂飲食則可加速AS進(jìn)程。本研究采用高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，成功建立了AS模型，與既往研究常用損傷頸總動(dòng)脈的方法建立AS模型不同[5]，本研究未予外界物理?yè)p傷干預(yù)，充分模擬了正常人的AS過(guò)程，對(duì)于研究AS疾病具有較高的參考價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，TC及LDL-C水平隨時(shí)間延長(zhǎng)而持續(xù)性增高。ApoE-/-小鼠8周時(shí)已有脂紋形成，16周時(shí)纖維斑塊形成，斑塊表面有較厚的纖維帽，斑塊內(nèi)含脂質(zhì)、巨噬細(xì)胞等，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，可見(jiàn)斑塊纖維帽變薄甚至斷裂，斑塊內(nèi)大量炎癥細(xì)胞和脂質(zhì)沉積，形成不穩(wěn)定斑塊。AS斑塊的整個(gè)發(fā)展過(guò)程與既往研究相一致[6,7]。

TN-C是一種細(xì)胞外血管基質(zhì)糖蛋白，是TN家族中發(fā)現(xiàn)最早也是最重要的一個(gè)成員。最新研究發(fā)現(xiàn)：TN-C參與了血管重塑的一系列生理、病理過(guò)程，其暫時(shí)性表達(dá)上調(diào)與內(nèi)膜增生、肺動(dòng)脈高壓、AS、腦血管痙攣及血管再生等密切相關(guān)[8-10]。通常情況下，TN-C在成人體內(nèi)極少表達(dá)或不表達(dá)，但在組織損傷時(shí)表達(dá)增高，組織修復(fù)完成時(shí)表達(dá)下調(diào)。既往研究表明，AS患者的冠狀動(dòng)脈斑塊中TN-C表達(dá)水平增高[11]，同時(shí)冠心病患者血清中TN-C水平也明顯升高[12,13]。此外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠AS斑塊中可檢測(cè)到TN-C的高表達(dá)[14,15]。本研究結(jié)果較既往相似，TN-C在AS斑塊的各時(shí)期均有不同水平的表達(dá)。

TN-C已成為研究心血管疾病的一個(gè)熱點(diǎn)，但其在AS斑塊發(fā)展過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)鮮有報(bào)道。本研究觀(guān)察ApoE-/-小鼠AS發(fā)展的各個(gè)階段，通過(guò)比較對(duì)照組與模型組小鼠脂紋期、纖維斑塊期、以及粥樣斑塊形成期等不同時(shí)期的小鼠主動(dòng)脈TN-C表達(dá)量的差異，分析TN-C與AS 疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，AS早期脂紋形成，主要由泡沫細(xì)胞組成，TN-C表達(dá)量很少，纖維斑塊時(shí)期，斑塊主要由纖維成分組成，TN-C表達(dá)仍較少，隨著AS的進(jìn)展，尤其在富含脂質(zhì)及纖維帽斷裂的不穩(wěn)定斑塊中，TN-C的表達(dá)明顯升高。由此證明TN-C主要表達(dá)于脂質(zhì)核的周?chē)捌屏训睦w維帽中，而在以厚的纖維成分為主的穩(wěn)定斑塊中很少表達(dá)。巨噬細(xì)胞是TN-C的主要來(lái)源之一，理論上，巨噬細(xì)胞可通過(guò)兩種機(jī)制增加炎性組織中TN-C的表達(dá)：通過(guò)多種生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子介導(dǎo)；或是TN-C基因直接合成[11]。AS是一種持續(xù)性的慢性炎癥過(guò)程，隨著進(jìn)程延長(zhǎng)，AS進(jìn)展，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加，斑塊的不穩(wěn)定性增加[16，17]，TN-C表達(dá)隨之升高。由此推測(cè)，在AS發(fā)展過(guò)程中，血管壁的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)，刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)TN-C，并且TN-C的表達(dá)與AS炎癥程度相關(guān)，AS程度越重，或是斑塊越不穩(wěn)定，TN-C表達(dá)量越高。

綜上所述，高脂飲食誘導(dǎo)了小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的升高，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，逐步導(dǎo)致內(nèi)皮損傷、纖維斑塊形成、粥樣斑塊形成。在此過(guò)程中，我們認(rèn)為T(mén)N-C是參與其中的重要因素之一，AS病變進(jìn)展時(shí)，TN-C表達(dá)水平明顯增高，可提示斑塊的不穩(wěn)定性增高，而不穩(wěn)定斑塊與心腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此，對(duì)于AS發(fā)展過(guò)程中TN-C動(dòng)態(tài)表達(dá)變化的研究可幫助尋找預(yù)防和治療AS疾病新的切入點(diǎn)。

[1] Jones PL, Jones FS. Tenascin-C in development and disease: gene regulation and cell function. Matrix Biol, 2000, 19: 581-596.

[2] Imanaka-Yoshida K. Tenascin-C in cardiovascular tissue remodeling:from development to inflammation and repair. Circ J, 2012, 76: 2513-2520.

[3] Plump AS, Smith JD, Hayek T, et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell, 1992, 71: 343-353.

[4] Bot I, de Vries H, Korporaal SJ, et a1. Adenosine A2B receptor agonism inhibits neointimal lesion development after arterial injury in apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2012,32: 2197-2205.

[5] 余飛, 黃東雅, 堵翠, 等. ApoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的建立. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2013, 30: 401-402.

[6] 盛沖霄, 黎紅華, 劉康, 等. 大鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變各階段內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能以及親環(huán)素A表達(dá)的變化. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2015,30: 576-579.

[7] 劉劍剛, 董國(guó)菊, 史大卓, 等. 載脂蛋白E基因敲除小鼠不同周齡動(dòng)脈粥樣硬化的病理變化. 中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志, 2005, 13: 689-692.

[8] Imanaka-Yoshida K, Yoshida T, Miyagawa-Tomita S. Tenascin-C in development and disease of blood vessels. Anat Rec (Hoboken), 2014,297: 1747-1757.

[9] Fujimoto M, Shiba M, Kawakita F, et al. Epidermal growth factorlike repeats of tenascin-C-induced constriction of cerebral arteries via activation of epidermal growth factor receptors in rats. Brain Res,2016, 1642: 436-444.

[10] Midwood KS, Hussenet T, Langlois B, et al. Advances in tenascin-C biology. Cell Mol Life Sci, 2011, 68: 3175-3199.

[11] Wallner K, Li C, Shah PK, et al. Tenascin-C is expressed in macrophage-rich human coronary atherosclerotic plaque. Circulation,1999, 99: 1284-1289.

[12] Yang JH, Ren F. Clinical implications of tenascin-C and OX40 ligand in patients with acute coronary syndrome. Biomed Rep, 2014, 2: 132-136.

[13] Ozmen Yildiz P, Yildiz I, Ozmen C, et al. Relation between coronary artery calcium score and serum tenascin-C level in patients without known coronary artery disease. Acta Cardiol, 2015, 70: 633-639.

[14] Golledge J, Clancy P, Maguire J, et al. The role of tenascin C in cardiovascular disease. Cardiovasc Res, 2011, 92: 19-28.

[15] von Lukowicz T, Silacci M, Wyss MT, et al. Human antibody against C domain of tenascin-C visualizes murine atherosclerotic plaques ex vivo. J Nucl Med, 2007, 48: 582-587.

[16] 白瑞娜, 郗瑞席, 馮志博. 巨噬細(xì)胞與動(dòng)脈粥樣硬化-亞型及功能.中國(guó)循環(huán)雜志, 2014, 29: 393-395.

[17] 張小娟, 任滿(mǎn)意, 曹曉青, 等. 趨化因子受體6基因敲除對(duì)載脂蛋白E基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響. 中國(guó)循環(huán)雜志,2014, 29: 300-303.

Dynamic Expressions of Tenascin-C at Different Phases of Atherosclerosis in ApoE-/-Mice

LI Yan, SONG Jia-cheng, YAN Hai-lang, HUANG Jun-wen, LU Yu, MA Zhan-long, SHI Hai-bin.
Department of Radiology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing (210029), Jiangsu, China

MA Zhan-long, Email: mazhanlong@126.com

Objective: To investigate the dynamic expressions of tenascin-C (TN-C) at different phases of atherosclerosis in ApoE-/-mice.

Methods: Our research included in 2 groups: ApoE-/-group, n=50 SPF male mice with ApoE-/-and Control group, n=50 wild male C57BL/6 mice. Atherosclerosis model was established by high fat diet in both groups. The mice were sacrificed at 4, 8, 16, 24 and 32 weeks, blood lipids were examined, pathologic changes of plaque were observed by microscope for quantitative analysis and TN-C expressions in atherosclerosis plaque were measured by immunohistochemistry.

Results: Compared with Control group, ApoE-/-group had elevated blood levels of total cholesterol (TC) and low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), both P＜0.05. In ApoE-/-group, plaque area and the ratio of plaque area/lumen area were increasing upon prolonged modeling time, all P＜0.05; TN-C expressions were increasing by progress of atherosclerosis,the highest TN-C expression was found at 32 weeks of modeling (0.49±0.07) which was higher than it was at 8 weeks(0.04±0.02), 16 weeks (0.12±0.03) and 24 weeks (0.21±0.04), all P＜0.05.

Conclusion: TN-C expression was increasing with plaque progress which might be related to the development of atherosclerosis and plaque instability.

Atherosclerosis; Apolipoprotein E; Mice, knockout; Tenascin

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81471723）；江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（BK20131446）

210029 江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 放射科（李燕、宋佳成、黃君文、陸鈺、馬占龍、施海彬）；南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇盛澤醫(yī)院 放射科（嚴(yán)海浪）

李燕 碩士研究生 主要從事分子影像研究 Email：liyan_stu@126.com 通訊作者：馬占龍 Email：mazhanlong@126.com

R541.4

A

1000-3614（2017）12-1217-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.12.018

2016-12-27）

（編輯：梅平）