黃 娟 張 靖 宮 璐 李西文 張 鵬 徐 文 丘小惠 黃志海

(1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣東分院，廣州,510006; 2 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700)

枳殼精準(zhǔn)煮散飲片質(zhì)量的均一性

黃 娟1張 靖1宮 璐1李西文2張 鵬2徐 文1丘小惠1黃志海1

(1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣東分院，廣州,510006; 2 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700)

目的：探討精準(zhǔn)煮散飲片與市售原飲片成分溶出及質(zhì)量均一性差異。方法：應(yīng)用ITS2序列作為DNA條形碼對(duì)枳殼飲片進(jìn)行鑒定；比較枳殼市售原飲片及精準(zhǔn)煮散飲片的干膏收率；采用HPLC-DAD法進(jìn)行3批次飲片混合粉碎前后質(zhì)量均一性、指紋圖譜及相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：枳殼煮散飲片出膏率略高于市售飲片出膏率；精準(zhǔn)煮散飲片提取液中柚皮苷溶出較市售飲片高，市售飲片柚皮苷、新橙皮苷批間溶出量有明顯的差異性RSD分別為9.71%及24.71%，混合制成煮散飲片后差異縮小RSD分別為4.73%、4.94%。指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，制成煮散飲片后相似度提高，且共有峰峰面積均有提高。結(jié)論：枳殼市售飲片制成精準(zhǔn)煮散飲片基本屬性沒(méi)有變化，但精準(zhǔn)煮散飲片能提飲片的煎煮效率及均一性，發(fā)展精準(zhǔn)煮散飲片具有良好的應(yīng)用前景。

枳殼；精準(zhǔn)煮散飲片；DNA條形碼；指紋圖譜

枳殼為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)，具有理氣寬中，行滯消脹等功效，可用于胸脅氣滯，脹滿疼痛，食積不化，痰飲內(nèi)停，臟器下垂[1]。既往醫(yī)學(xué)研究表明，枳殼有促胃腸動(dòng)力、抗消化不良、抗氧化、抗菌、消炎、抗抑郁和抗腫瘤作用[2-5]。黃酮、生物堿、揮發(fā)油是其主要藥理活性成分，目前研究普遍以柚皮苷、新橙皮苷的含量來(lái)評(píng)價(jià)枳殼的質(zhì)量[6-7]。

宋代以前所用枳殼的原植物為蕓香科枸橘PoncirustrifoliataRaf.，直至明代原植物主要來(lái)源衍變?yōu)樗岢燃捌渥兎N，目前尚有福建、廣東等地區(qū)至今仍以柑橘屬CitrusL.多種植物作為枳殼藥用來(lái)源。我國(guó)各地區(qū)的枳殼類藥材的基原、分布各不相同,江西清江產(chǎn)的“江枳殼”為枳殼的道地藥材，其原植物為酸橙的變種臭橙C.aurantium‘Xiucheng’，少部分為香橙C.aurantium‘Xiangcheng’。主流品種“川枳殼”其原植物為酸橙，產(chǎn)量較大的“湘枳殼”原植物是以枸橘為砧木，酸橙為接穗的嫁接品種，稱為枳橙C.aurantium×P.trifoliata[8]。

由于酸橙的栽培變種品種繁多，且有枸橘屬來(lái)源的品種，造成枳殼商品來(lái)源復(fù)雜混亂，特別是切制成薄片片后大多有混雜。產(chǎn)地與生長(zhǎng)的差異化、貨源的不穩(wěn)定性、中藥飲片的形態(tài)差異等因素，導(dǎo)致枳殼飲片批間、批內(nèi)質(zhì)量不均一，直接影響臨床用藥療效的穩(wěn)定。因此需要一種易于鑒定和檢測(cè)，可經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備、規(guī)?；a(chǎn)、質(zhì)量均一，以提高臨床用藥精準(zhǔn)性的新型飲片。因此，根據(jù)我們前期提出的“精準(zhǔn)煮散飲片”的概念與思路方法，將對(duì)枳殼煮散飲片進(jìn)行研究。鑒于中藥材化學(xué)成分體系的復(fù)雜性，我們采用化學(xué)指紋圖譜表征藥材化學(xué)組成結(jié)合DNA分子鑒定技術(shù)，以飲片規(guī)格、含量均勻度、指紋圖譜與相似度評(píng)價(jià)、DNA序列比對(duì)為考查重點(diǎn)，對(duì)煮散體系的合理性及優(yōu)越性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國(guó)Agilent 1260型高效液相色譜儀(四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器及DAD檢測(cè)器)，BT 125 D十萬(wàn)分之一分析天平、BS 224 S萬(wàn)分之一分析天平、HTP-312電子天平、DK-S26電熱水浴鍋、Centrifuge 5430R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、臺(tái)灣榮聰鐵工廠粉碎機(jī)。

1.2 試劑 乙腈、甲酸均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；煎煮用水為蒸餾水、液相用水為millipore制備純水。

1.3 分析樣品 柚皮苷(含量≥98%，批號(hào)B20182)，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；新橙皮苷(含量99.6%，批號(hào)111857-201102)，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。枳殼市售飲片分別購(gòu)自康美藥業(yè)有限公司(產(chǎn)地江西,S1、S2批號(hào)160301561，160901351)及嶺南中藥飲片有限公司(產(chǎn)地四川，S3批號(hào)1609001)，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室黃志海中藥師鑒定均為現(xiàn)行版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)收載品種。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 含量測(cè)定采用高效液相方法測(cè)定，色譜柱為Kinetex C18柱(2.6 μm，100 mm×4.6 mm)。檢測(cè)方法按照中華人民共和國(guó)藥典2015年版一部枳殼項(xiàng)下含量測(cè)定方法測(cè)定市售飲片及煮散飲片提取液中柚皮苷、新橙皮苷的含量。

指紋圖譜色譜條件為：色譜柱同上；流動(dòng)相為乙腈(B)—0.1%甲酸水(A)，梯度洗脫(5%→75%)；流速：1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；柱溫：25 ℃；洗脫時(shí)間：30 min；進(jìn)樣體積：5 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇配制成含柚皮苷0.51 mg/mL、新橙皮苷0.50 mg/mL的對(duì)照品溶液，置冰箱中4 ℃保存，備用。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 飲片制備 不同規(guī)格枳殼煮散飲片制備：取枳殼市售飲片(S1)，粉碎，混勻，過(guò)篩，分別得到5-10目(2～4 mm)、10-24目(0.8～2 mm)、24-65目(0.25～0.8 mm)等不同粒徑范圍的煮散飲片。

質(zhì)量均一性實(shí)驗(yàn)枳殼精準(zhǔn)煮散飲片制備：分別取3個(gè)批次市售飲片(S1～S3)各200 g，充分混合后，粉碎，混勻，過(guò)篩，得10～65目粒徑范圍的煮散飲片。原飲片及煮散飲片形態(tài)(圖1)。

圖1 枳殼藥材、原飲片及煮散飲片形態(tài)

2.3.2 供試品溶液的制備 取不同批次原飲片各取20 g(S1～S3)；另取枳殼精準(zhǔn)煮散飲片300 g，均勻攤平，畫格分為10份，隨機(jī)選取3份，從每份中分別稱取20 g(S4-S6)，按2.2項(xiàng)下相同方法煎煮。合并煎煮液，濃縮成100 mL溶液，即濃縮為0.2 g/mL的原藥材溶液。取該濃縮液2.5 mL至10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，即得供試品溶液，進(jìn)樣前用0.22 μm濾膜過(guò)濾。

2.4 DNA條形碼檢測(cè) 選取樣本各約40 mg，用組織研磨儀磨碎，采用植物DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.,China)提取基因組總DNA。ITS2序列擴(kuò)增采用正向引物ITS2F:5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物：ITS3R:5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′，進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2×Taq PCR Mix酶(北京艾德萊生物科技有限公司)12.5 μL，正向、反向引物各1 μL(2.5 μmol/L)，模板DNA 2.0 μL(30～100 ng)，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s(40個(gè)循環(huán))；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將電泳條帶清晰、明亮、單一的PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。序列拼接采用CodonCode Alinger 6.02軟件，利用軟件MEGA 6.06分析比對(duì)，分析ITS2序列特點(diǎn)。

2.5 出膏率的檢測(cè) 稱取原飲片及不同粒徑范圍煮散飲片各100 g，采用標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮法進(jìn)行提取。分別加8倍量水，先浸泡30 min，煮沸30 min，過(guò)濾分離出煎煮液，再加6倍量水煎煮30 min。合并煎煮液，濃縮成100 mL溶液，即濃縮為1 g/mL的藥材溶液。精密量取25 mL，蒸干，得干浸膏重量，計(jì)算出膏率。精密吸取混合均勻的不同規(guī)格的飲片供試品溶液25 mL于蒸發(fā)皿中，60 ℃真空干燥至恒重，稱量，根據(jù)出膏率公式[9]計(jì)算出膏率。

2.5 樣品測(cè)定結(jié)果

2.5.1 原飲片與不同規(guī)格煮散飲片出膏率比較 結(jié)果表明，與原飲片比較，粉碎后不同粒徑煮散飲片的出膏率均有增加；但不同粒徑之間樣品的出膏率差異不明顯。見(jiàn)表1。

表1 枳殼市售原飲片與精準(zhǔn)煮散飲片出膏率

2.5.2 含量均一性評(píng)價(jià) 取對(duì)照品溶液及樣品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，對(duì)照品及樣品中柚皮苷、新橙皮苷的色譜峰分離效果佳，雜峰較少，峰形良好，適合枳殼飲片中柚皮苷、新橙皮苷含量測(cè)定分析，對(duì)照品溶液及樣品溶液HPLC-DAD色譜圖分別見(jiàn)圖2、圖3。

圖 2對(duì)照品HPLC-DAD色譜圖

注：1：柚皮苷；2：新橙皮苷

圖3 枳殼飲片HPLC-DAD色譜圖

注：1：柚皮苷；2：新橙皮苷

含量測(cè)定結(jié)果表明(表2)，各批次枳殼原飲片藥材中柚皮苷、新橙皮苷2種成分的提取率差異均較大，波動(dòng)范圍分別在14.34～17.20 mg/g及5.89～9.46 mg/g，RSD值分別為9.71%及24.70%。3批原飲片經(jīng)混合均勻并制成煮散飲片后，其柚皮苷溶出量增加，且二者RSD值顯著下降，均低于5%。

3.5.3 指紋圖譜研究 按2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，枳殼市售原飲片及精準(zhǔn)煮散飲片色譜峰指紋圖譜見(jiàn)圖4，采用國(guó)家藥典委員會(huì)2014年版指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算市售原飲片混合前后指紋圖譜相似度。見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，在現(xiàn)有的檢測(cè)方法下，枳殼市售飲片與經(jīng)粉碎混勻的煮散飲片共6批樣品的主要色譜峰均可以良好的匹配，指紋圖譜相似度基本一致，在共有峰的種類上未有明顯改變，經(jīng)粉碎混勻后的精準(zhǔn)煮散飲片指紋圖譜顯示高度的相似性，粉碎后樣品(S4-S6)的相似度均在0.999以上。

圖4 枳殼市售原飲片及精準(zhǔn)煮散飲片HPLC指紋圖譜

以枳殼原飲片中新橙皮苷的平均峰面積為基準(zhǔn)，計(jì)算制得精準(zhǔn)煮散飲片前后各共有峰的相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，不同批次藥材經(jīng)混合制成精準(zhǔn)煮散飲片后，部分共有峰溶出率有不同程度的升高。其中峰6為柚皮苷，峰8為新橙皮苷。

3.5.4 ITS2序列分析 應(yīng)用MEGA6.06分析枳殼3條ITS2序列特征，序列比對(duì)后長(zhǎng)度為232 bp，種內(nèi)存在2個(gè)變異位點(diǎn)，為183處G/A變異，188處G/T

表2 原飲片與精準(zhǔn)煮散飲片提取液中柚皮苷、新橙皮苷含量

變異。A、C、G、T的堿基含量分別為15.25%、38.42%、32.37%、13.96%，GC含量達(dá)70.79%。3條psbA-trnH序列比對(duì)后長(zhǎng)度為422 bp，種內(nèi)無(wú)變異位點(diǎn)。2種序列經(jīng)BLAST搜索結(jié)果顯示相似性最高的為酸橙Citrusaurantium或甜橙Citrussinensis。主導(dǎo)單倍型序列特征見(jiàn)圖5、6。

表3 飲片指紋圖譜相似度

表4 共有峰相對(duì)峰面積比較

圖5 枳殼ITS2序列

圖6 枳殼psbA-trnH序列

3 討論

枳殼的ITS2和psbA-trnH條形碼在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)中進(jìn)行BLAST搜索時(shí)，能比對(duì)到甜橙Citrussinensis、酸橙Citrusaurantium及同屬物種。由于該屬植物易發(fā)生芽變、種屬間易雜交、體細(xì)胞突變率高、人工栽培品種繁多、研究者采用的分類標(biāo)準(zhǔn)的不同等特點(diǎn)，導(dǎo)致該屬在種的劃分上存在較大分歧[10]。羅焜等[11]對(duì)包括橘屬7個(gè)品種在內(nèi)的蕓香科72屬300個(gè)樣本進(jìn)行DNA條形碼篩選比較研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，ITS2和psbA-trnH序列在屬水平上的鑒定成功率為100%，但目前暫未發(fā)現(xiàn)可用于柑橘屬種間鑒定的DNA條形碼序列[12-14]。因此，對(duì)于枳殼的物種鑒定，在DNA條形碼鑒定到屬的基礎(chǔ)上，應(yīng)輔以其他手段如指紋圖譜技術(shù)進(jìn)一步明確種屬。

精準(zhǔn)煮散飲片經(jīng)過(guò)對(duì)飲片形制的改進(jìn)，使飲片體積變小，顆粒均勻，使飲片分裝、調(diào)劑的自動(dòng)化設(shè)備得以應(yīng)用，可改變以往粗放、低效的生產(chǎn)應(yīng)用模式，實(shí)現(xiàn)用藥各環(huán)節(jié)的規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)化，提高臨床用藥的準(zhǔn)確性。同時(shí)，發(fā)展精準(zhǔn)煮散飲片能提高中藥藥效物質(zhì)的溶出和保證湯劑煎煮質(zhì)量的穩(wěn)定，從而在保證療效的前提下，可降低藥物使用量，節(jié)約資源，提高中藥資源的合理利用，降低藥品費(fèi)用。

本研究探討了DNA條形碼鑒定技術(shù)、中藥指紋圖譜技術(shù)結(jié)合用于煮散飲片的質(zhì)量控制，結(jié)果表明現(xiàn)有技術(shù)可以滿足煮散飲片的定性定量檢測(cè)要求，有效實(shí)現(xiàn)煮散飲片的精準(zhǔn)化鑒定和檢測(cè)，為解決傳統(tǒng)煮散的“辨藥之難”提供了新的思路。

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ComparativeStudyonQualityUniformityofPrecisePowderDecoctionPiecesofAurantiiFructus

Huang Juan1,Zhang Jing1,Gong Lu1,Li Xiwen2,Zhang Peng2,Xu Wen1,Qiu Xiaohui1,Huang Zhihai1

(1SecondAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,GuangdongProvincialAcademyofChineseMedicalSciences,ChinaAcademyofChineseMedicalSciencesGuangdongBranch,Guangzhou510006,China; 2InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)

Objective:This study aimed to evaluate the composition dissolution and quality uniformity of precise powder decoction pieces (PPDP) of Aurantii Fructus (AF),compared with the traditional commercial slices.Chemical fingerprint methods and DNA molecular identification technology based on internal transcribed spacer 2 (ITS2) were applied.MethodsDifferent specifications of PPDP were prepared,their dry extract contents were compared with those of commercial slices.Three batches of commercial slices were collected,and the content uniformity,fingerprint and similarity evaluation before and after the mixing and pulverization were analyzed by HPLC-DAD and DNA sequence alignment.ResultsPaste rate of PPDP were slightly higher than that of the traditional commercial slices.The dissolution of naringin of PPDP was higher than that of traditional commercial slices.RSDof inter-assay dissolutions of naringin and neohesperidin of commercial slices were 9.71% and 24.71% respectively,which could be reduced to 4.73% and 4.94% after mixing and preparing into PPDP.Finger print image shows there were high similarity between decoction and slices.ConclusionPPDP and traditional commercial slices of AF shared consistent properties.PPDP apparently improved the extraction rate,the dissolution rate and quality uniformity,and it is recommended to be used in clinical practice.

Aurantii Fructus; Precise powder decoction pieces; DNA; Fingerprint

廣東省中醫(yī)院院內(nèi)專項(xiàng)(2015KT1817)；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥健康服務(wù)發(fā)展專項(xiàng)(ZZ0908067)；國(guó)家自然基金(81402887)

黃娟(1987.10—)，女，博士在讀研究生，助理研究員，研究方向：中藥質(zhì)量控制與中藥體內(nèi)代謝

丘小惠(1969.06—)，女，碩士研究生，研究員，團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人，研究方向：中藥質(zhì)量與中藥炮制研究，Tel：(020)39318571，E-mail：gxhqxh@medmail.com.cn，jxu@icmm.ac.cn；黃志海(1974.08—)，男，碩士研究生，主任藥師，團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人，研究方向：中藥資源與中藥炮制，Tel：(020)39318571，E-mail：1925196926@qq.com

R91；R289.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.057

(2017-01-03收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄)