徐穎倩 曾 雪 唐 倩

(重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)院，重慶，401331)

紫甘藍(lán)提取液對(duì)人乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的抑制作用

徐穎倩 曾 雪 唐 倩

(重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，重慶，401331)

目的：探討紫甘藍(lán)提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7生長(zhǎng)和遷移的抑制作用。方法：應(yīng)用MTT法檢測(cè)不同濃度紫甘藍(lán)提取物對(duì)MCF7增殖的抑制作用，并用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，Annexin V-FITC/PI染色細(xì)胞后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度紫甘藍(lán)提取物對(duì)MCF7凋亡的影響，采用Transwell法檢測(cè)不同濃度紫甘藍(lán)提取物對(duì)MCF7遷移的影響。采用SPSS 16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果：紫甘藍(lán)提取物可抑制MCF7的增殖，并呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性(P<0.05)，也使MCF7形態(tài)發(fā)生了異常變化，紫甘藍(lán)提取物可誘導(dǎo)MCF7凋亡、抑制其遷移，且呈濃度-效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。結(jié)論：紫甘藍(lán)提取物可抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7生長(zhǎng)和遷移。

紫甘藍(lán)；乳腺癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞遷移

紫甘藍(lán)又稱紅甘藍(lán)、赤甘藍(lán)，俗稱紫包菜，十字花科、蕓苔屬甘藍(lán)種中的一個(gè)變種，是結(jié)球甘藍(lán)中的一個(gè)類型，由于它的外葉和葉球都呈紫紅色，故名[1]。紫甘藍(lán)營(yíng)養(yǎng)豐富，含有豐富的維生素和胡蘿卜素，無(wú)機(jī)鹽含量也很高，是膳食纖維的良好來(lái)源，其抗氧化活性多酚類和黃酮類物質(zhì)的含量也比其他蔬菜高[2-3]。國(guó)內(nèi)外大部分關(guān)于紫甘藍(lán)的研究都關(guān)注于其抗氧化作用[4-5]，但是對(duì)紫甘藍(lán)抗癌活性作用的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本研究旨在探討紫甘藍(lán)提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的抑制作用，為人們?cè)谏攀撤矫骖A(yù)防癌癥提供指導(dǎo)意見(jiàn)，對(duì)防癌保健食品的開(kāi)發(fā)提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人乳腺癌細(xì)胞MCF7購(gòu)于南京科佰生物科技有限公司。

1.1.2 藥物 新鮮紫甘藍(lán)購(gòu)于重慶市重百超市建議鑒定基原，無(wú)機(jī)械損傷，無(wú)蟲(chóng)害，無(wú)腐爛。

1.1.3 試劑與儀器 細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640、胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone公司)；青霉素、鏈霉素(Gibco公司)；MTT(Sigma公司)；Staurosporine(MCE公司)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(上海貝博生物有限公司)；Transwell小室(Millipore公司)；6、24、96孔板(ThermoFisher公司)：酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio-Rad公司)；倒置顯微鏡IX71(Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(碧迪醫(yī)療器械有限公司)；離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心儀器有限公司)；冷凍干燥機(jī)(Thermo公司)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 稱取500 g新鮮紫甘藍(lán)，洗凈，晾干，用榨汁機(jī)榨取，收集汁液，將該汁液以3 000 r/min離心15 min，取上清液，25 ℃恒溫箱內(nèi)靜置過(guò)夜后，將該上清液經(jīng)濾紙反復(fù)過(guò)濾，再用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，所濾過(guò)的澄清液體即為紫甘藍(lán)原液。將紫甘藍(lán)原液冷凍干燥24 h，凍干粉末溶解于蒸餾水中，制備成紫甘藍(lán)提取液(Purple Cabbage Extract，PCE)。實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組(MTT試驗(yàn))、正常對(duì)照組、陽(yáng)性藥物Staurosporine(STS)(濃度250 nmol/L)對(duì)照組(MTT試驗(yàn)、細(xì)胞凋亡試驗(yàn))、PCE處理組(PCE終濃度分別為50、100、150、200、250、300 μg/L)。

1.2.2 干預(yù)方法 PCE和陽(yáng)性藥物STS直接干預(yù)MCF7細(xì)胞。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 采用形態(tài)學(xué)觀察法和MTT法檢測(cè)PCE對(duì)MCF7的抑制作用，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PCE對(duì)MCF7凋亡的影響，Transwell法檢測(cè)PCE對(duì)MCF7遷移的影響。

用含10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)MCF7細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%致密單層時(shí)，消化細(xì)胞并制備細(xì)胞懸液，將1×105個(gè)/mL濃度的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的PCE，使最終每組含PCE濃度分別為50、100、150、200、250、300 μg/L，并設(shè)空白對(duì)照組、正常對(duì)照組和STS(濃度250 nmol/L)對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。分別于12、24、36 h 3個(gè)時(shí)相進(jìn)行MTT比色：棄舊培養(yǎng)液，洗滌細(xì)胞后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min使藍(lán)紫色的結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇490 nm波長(zhǎng)，以空白對(duì)照孔調(diào)零，測(cè)定各個(gè)孔的吸光度(A)值。按公式“(1-藥物組A值/正常對(duì)照組A值)×100%”計(jì)算細(xì)胞抑制率，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，求其平均值，以劑量和生長(zhǎng)抑制率做直線相關(guān)分析。

將MCF7細(xì)胞以1×105個(gè)/mL濃度接種于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入終濃度為150、200、250、300 μg/L的PCE，并設(shè)正常對(duì)照組和STS(濃度250 nmol/L)對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，消化細(xì)胞并制備細(xì)胞懸液，1000 r/min，25 ℃，離心5 min，棄上清液，收集MCF7細(xì)胞。向MCF7細(xì)胞加入Annexin V結(jié)合液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書操作，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

將預(yù)先饑餓處理了12 h的MCF7細(xì)胞以1×106個(gè)/mL濃度種植于Transwell(膜孔徑8 μm，膜直徑6.5 mm)上室，下室分別加入1 mL終濃度為150、200、250、300 μg/L的PCE，并設(shè)正常對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將遷移到Transwell小室膜外側(cè)的MCF7細(xì)胞用95%乙醇固定10 min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色15 min。在倒置顯微鏡(×200)下，隨機(jī)觀察12個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)，每2個(gè)視野取均數(shù)得6個(gè)取均后的細(xì)胞數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

不同質(zhì)量濃度的PCE作用于MCF7細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有不同程度的抑制作用。當(dāng)PCE作用細(xì)胞12 h時(shí)，隨著其濃度的提高，其對(duì)MCF7細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，隨后通過(guò)延長(zhǎng)PCE的作用時(shí)間發(fā)現(xiàn)，相同濃度的PCE隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，其抑制MCF7細(xì)胞的能力也隨著增強(qiáng)(圖1)。當(dāng)PCE濃度大于250 μg/L，并且作用24 h以上時(shí)，其對(duì)MCF7細(xì)胞的抑制率能達(dá)到50%以上。檢測(cè)到STS作用于MCF7細(xì)胞24 h和36 h后，其抑制率分別為(52.37±1.46)%和(65.14±1.58)%。

圖1 PCE對(duì)MCF7細(xì)胞的抑制作用

正常條件下培養(yǎng)的MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞呈扁平、多角形或梭形，邊界清楚，大小均勻；STS陽(yáng)性藥物處理過(guò)的細(xì)胞出現(xiàn)收縮、變圓、體積變小，細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞排列紊亂；50 μg/L的PCE作用于細(xì)胞后，與正常對(duì)照組比較，細(xì)胞的形態(tài)無(wú)明顯變化；100 μg/L的PCE作用于細(xì)胞后，細(xì)胞數(shù)量與正常對(duì)照組比較有所減少，但是細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)損傷跡象；當(dāng)PCE的濃度達(dá)到150 μg/L時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)與正常對(duì)照組比較出現(xiàn)了明顯的變化，細(xì)胞開(kāi)始收縮、變圓、變小，其形態(tài)和陽(yáng)性藥物STS組相似，并且隨著PCE濃度的增加，細(xì)胞的數(shù)量和密度逐漸變少(圖2)。

圖2 PCE對(duì)MCF7形態(tài)的影響(×100)

圖3 PCE對(duì)MCF7細(xì)胞凋亡的影響

組別凋亡率(%)正常對(duì)照組5.31±0.24STS對(duì)照組(250nmol/L)42.53±0.27PCE處理組(150μg/L)23.49±0.30PCE處理組(200μg/L)34.72±0.31PCE處理組(250μg/L)41.48±0.26PCE處理組(300μg/L)62.93±0.35

圖4 PCE對(duì)MCF7細(xì)胞遷移的影響

STS對(duì)照組細(xì)胞早期凋亡區(qū)域和晚期凋亡區(qū)域的細(xì)胞數(shù)量明顯多于正常對(duì)照組(圖3)，150 μg/L的PCE作用于MCF7細(xì)胞后，早期凋亡的細(xì)胞數(shù)量明顯多于正常對(duì)照組，并且隨著PCE的濃度增加，凋亡的細(xì)胞數(shù)逐漸增多。當(dāng)不同濃度的PCE作用于MCF7細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率明顯高于正常對(duì)照組，隨著劑量的增加，細(xì)胞凋亡率明顯增加。見(jiàn)表1。

與正常對(duì)照組比較，150、200、250、300 μg/L的PCE作用后顯著抑制了MCF7細(xì)胞的遷移能力，且呈濃度依賴性(圖4)，當(dāng)PCE的濃度到達(dá)200 μg/L時(shí)，MCF7細(xì)胞的遷移能力下降了50%左右。

3 討論

癌癥是以細(xì)胞異常增殖及轉(zhuǎn)移為特點(diǎn)的疾病，是導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一，乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害了婦女的生命健康，通過(guò)攝入有抗癌活性的食物防治乳腺癌是一種簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、效果明顯的方法[6-7]。天然食物是化學(xué)預(yù)防藥物的最好來(lái)源之一，這些來(lái)源于食物的天然成分生理作用比較緩和，幾乎無(wú)毒，可以較長(zhǎng)期服用[8-9]。紫甘藍(lán)富含多種營(yíng)養(yǎng)成分和植物色素，但對(duì)其抗癌作用的研究鮮有報(bào)道，本研究分別考察了紫甘藍(lán)濃縮汁液對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7的增殖、形態(tài)、凋亡和遷移的影響。紫甘藍(lán)對(duì)MCF7細(xì)胞的體外抑制試驗(yàn)采用的是MTT法，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，并且靈敏度較高[10]，MTT試驗(yàn)結(jié)果表明，PCE能夠有效抑制MCF7細(xì)胞增殖，細(xì)胞抑制率呈濃度、時(shí)間依賴性，對(duì)細(xì)胞形態(tài)的觀察也進(jìn)一步的表明PCE對(duì)MCF7細(xì)胞有損傷和抑制作用。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，其意義在于能消除在形成過(guò)程中發(fā)生異常的細(xì)胞，然而在抑癌基因p53出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，就不會(huì)誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞的不斷增長(zhǎng)，采用Annexin V-FITC/PI法可以區(qū)分凋亡早期、凋亡晚期和死亡細(xì)胞，靈敏度高[11]。細(xì)胞凋亡試驗(yàn)結(jié)果表明，PCE能誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞凋亡，這很有可能是導(dǎo)致MCF7細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變以及抑制MCF7細(xì)胞增殖的原因。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤致死的主要原因，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是多因素、多步驟的過(guò)程，其中腫瘤細(xì)胞的遷移能力被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的限速環(huán)節(jié)，腫瘤細(xì)胞的遷移能力與其轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)性[12]。在本研究中，用Transwell法觀察了PCE對(duì)MCF7細(xì)胞遷移的影響，Transwell小室置于培養(yǎng)板中，Transwell小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室盛裝細(xì)胞培養(yǎng)液，下室盛裝細(xì)胞誘導(dǎo)液，上下層液體以PET膜相隔，將MCF7細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于PET膜的通透性，下層遷移液的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)MCF7細(xì)胞遷移的影響[13]。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PCE對(duì)MCF7細(xì)胞遷移有明顯的抑制作用，并且呈濃度依賴性。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示紫甘藍(lán)具有潛在的抗癌價(jià)值。

紫甘藍(lán)屬于十字花科甘藍(lán)類植物，在200多項(xiàng)流行病學(xué)研究資料中，有80%的結(jié)果表明食用植物性食物特別是十字花科蔬菜能夠降低多種癌癥的患病風(fēng)險(xiǎn)，其中甘藍(lán)類植物對(duì)癌癥的預(yù)防作用更是強(qiáng)于其他蔬菜和水果[14-15]。十字花科植物所含有的硫代葡萄糖苷(硫苷)的水解產(chǎn)物是其抗癌特性的主要成分，硫苷自身性質(zhì)比較穩(wěn)定，不具備生物活性，但是它可以被內(nèi)源性黑芥子酶或人腸道內(nèi)微生物產(chǎn)生的水解酶水解，生成硫氰酸鹽、異硫氰酸鹽、腈類等一系列活性物質(zhì)，異硫氰酸鹽對(duì)哺乳動(dòng)物的肝癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌有明顯的抑制作用[16-18]。研究表明，紫甘藍(lán)含有脂肪族硫苷、吲哚族硫苷、芳香族硫苷等，除了含有硫苷外，還富含花青素，花青素是一種天然色素，可以清楚自由基，有很強(qiáng)的抗氧化功能，其降解產(chǎn)物在減輕疼痛和預(yù)防癌癥方面也有一定的功效[19-20]。因此，我們推測(cè)紫甘藍(lán)的抗癌活性與其富含的硫苷和花青素有關(guān)，但是具體是哪些物質(zhì)發(fā)揮了抗癌活性，以及紫甘藍(lán)的抗癌機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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PurpleCabbageExtractinInhibitionofBreastCancerCellGrowthandMigration

Xu Yingqian,Zeng Xue,Tang Qian

(CollegeofPharmacy,ChongqingMedicalandPharmaceuticalCollege,Chongqing401331,China)

Objective:To investigate the effect of purple cabbage extract (PCE) on breast cancer cell MCF7 growth and migration.MethodsThe inhibition rate of MCF7 cells was assessed by MTT method,and the inverted phase contrast microscope was used to observe the cellular shape.Flow cytometry was utilized for measuring cell apoptosis after Annexin V-FITC/PI stained the cell.The transwell chamber was used to investigate cell migration.ResultsPCE inhibited MCF7 cell proliferation in a concentration-and time-dependent manner (P<0.05).After incubated with PCE,the cells became shrinkage and turned round,arranged loosely and adhered not favorable gradually.PCE induced MCF7 cell apoptosis and inhibited cell migration in a concentration-dependent manner (P<0.05).ConclusionPCE inhibits breast cancer cell MCF7 growth and migration.

Purple cabbage；Breast cancer；Cell proliferation；Cell apoptosis；Cell migration

重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)?？蒲杏?jì)劃項(xiàng)目(ygz2015107)

徐穎倩(1989.04—)，女，碩士，講師，研究方向：藥物化學(xué)，E-mail：alicexu0410@126.com

唐倩(1979.02—)，女，碩士，副教授，副院長(zhǎng)，研究方向：藥物分析，E-mail：15981934@qq.com

R151.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.054

(2016-12-29收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄)