林久茂 李瓊瑜 嚴(yán)兆坤 賴子君 靳祎祎 彭 軍

(1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州，350122； 2 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州，350122)

中藥研究

白花蛇舌草對大腸癌耐藥細(xì)胞microRNAs表達(dá)的影響

林久茂1,2李瓊瑜1嚴(yán)兆坤1賴子君1靳祎祎1彭 軍1,2

(1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州，350122； 2 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州，350122)

目的：探討白花蛇舌草(Hedyotic Diffusa Wilid，HDW)對大腸癌5-FU耐藥細(xì)胞miRNAs表達(dá)的調(diào)控作用，進(jìn)一步揭示其逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥(Multidrug Resistance，MDR)作用機(jī)制。方法：通過體外培養(yǎng)HCT-8/5-FU細(xì)胞，經(jīng)HDW處理，采用MTT檢測細(xì)胞活力、倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、microRNA(miRNA)表達(dá)譜芯片分析、QPCR驗(yàn)證差異miRNA表達(dá)、GO及Pathway分析預(yù)測差異miRNA調(diào)控的信號通路。結(jié)果：HDW可顯著抑制大腸癌HCT-8/5-FU耐藥細(xì)胞的活力，降低細(xì)胞密度；HDW調(diào)控57個miRNA差異表達(dá)，其中上調(diào)23個，下調(diào)34個；QPCR驗(yàn)證HDW上調(diào)miR-92b-5p、miR-1247-3p、miR-4800-5p的表達(dá)，下調(diào)miR-4454、miR-4443、miR-483-5p的表達(dá)；信號通路預(yù)測顯示HDW可調(diào)控PI3K/Akt、TGF-β/Smad、MAPK、P53、Wnt、JAK-STAT等多條與細(xì)胞耐藥、遷移、侵襲、增殖、凋亡有關(guān)的信號通路。結(jié)論：HDW對大腸癌5-FU耐藥細(xì)胞HCT-8/5-FU具有顯著的抑制作用，通過調(diào)控miRNAs表達(dá)是其逆轉(zhuǎn)大腸癌耐藥的作用機(jī)制之一。

白花蛇舌草；大腸癌；microRNA；耐藥

大腸癌(Colorectal Cancer，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，據(jù)美國癌癥協(xié)會調(diào)查研究報道，每年全球逾60萬人死于CRC，具有高發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重危害人類健康[1]?；熓侵委烠RC術(shù)后復(fù)發(fā)及失去手術(shù)機(jī)會或轉(zhuǎn)移性CRC的主要手段。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)是臨床上腸癌化療的基礎(chǔ)用藥，常導(dǎo)致CRC細(xì)胞產(chǎn)生5-FU耐藥性，進(jìn)而產(chǎn)生繼發(fā)性多藥耐藥，是導(dǎo)致5-FU治療失敗的主要因素。腫瘤細(xì)胞MDR產(chǎn)生的機(jī)制非常復(fù)雜，與細(xì)胞內(nèi)藥物的蓄積、藥物在細(xì)胞的分布及MDR基因過表達(dá)密切相關(guān)，越來越多的研究表明腫瘤耐藥與細(xì)胞相關(guān)蛋白及信號通路有關(guān)，并受到相關(guān)信號通路的調(diào)控。microRNA(miRNA)表觀遺傳學(xué)調(diào)控與腫瘤MDR密切相關(guān)[2]。miRNA是一類分布廣泛的由約19～24個核苷酸組成的一類內(nèi)源性非編碼(Non-protein-coding)單鏈RNA[3]。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平通過結(jié)合和降解耐藥相關(guān)靶基因的mRNA抑制其翻譯，從而在腫瘤的耐藥中也扮演了重要的角色[4]。

白花蛇舌草(HedyotisDiffusaWilld，HDW)性寒，味甘苦，歸心、肝、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、消癰散結(jié)的功效[5]。白花蛇舌草廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床抗CRC的治療，具有顯著療效。研究表明白花蛇舌草對多種惡性腫瘤療效確切[6-8]，前期證實(shí)白花蛇舌草可通過多條途徑誘導(dǎo)CRC細(xì)胞凋亡[9]、抑制CRC細(xì)胞增殖[10-12]、抑制CRC血管新生[13]、逆轉(zhuǎn)CRC MDR的作用[14]。但白花蛇舌草逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的作用機(jī)制仍為闡明。為進(jìn)一步揭示白花蛇舌草的作用機(jī)制，對其干預(yù)CRC 5-FU耐藥細(xì)胞后的miRNAs表達(dá)進(jìn)行芯片篩選，并結(jié)合生物信息學(xué)方法分析歸納，以期為其調(diào)控miRNA抑制CRC耐藥細(xì)胞生長提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 CRC耐藥細(xì)胞HCT-8/5-FU(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；HDW(福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院)。

1.1.2 試劑與儀器 無水乙醇(天津福晨化學(xué)工業(yè)有限公司生產(chǎn))；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰酶、磷酸鹽緩沖液(PBS，美國Hyclone公司)；RNAiso Plus、SYBR PrimeScipt miRNA RT-PCR試劑盒(中國寶生物工程有限公司生產(chǎn))；酶標(biāo)儀(ELX800，美國BioTek公司)；超微量核酸分析儀(ND-2000C，美國Thermo公司)；實(shí)時熒光定量PCR儀(7500 Fast，美國life公司)；倒置顯微鏡(DMI4000B，德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 HDW提取物的制備 HDW(0.1 kg)用85%乙醇1 L回流提取2次，合并后過濾，濃縮濾液，真空干燥成粉末。HDW提取物粉末用PBS配制成200 mg/mL溶液，-20 ℃貯存?zhèn)溆?。用前采用直?.22 μm微孔濾膜過濾。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HCT-8/5-FU細(xì)胞用含5FU(15 μg/mL)的10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長匯合度達(dá)90%后，去除培養(yǎng)液加入0.25%含EDTA胰酶進(jìn)行消化，細(xì)胞變圓脫落后加入5倍胰酶體積的完全培養(yǎng)液終止消化，收集單細(xì)胞懸液于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，HCT-8/5-FU細(xì)胞細(xì)胞用RPMI-1640完全培養(yǎng)液重懸后進(jìn)行傳代或接種。

1.2.3 細(xì)胞活力分析 取對數(shù)生長期HCT-8/5-FU消化計數(shù)，按1.0×105個/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，100 μL/孔。細(xì)胞生長至50%～60%時加入終濃度為0.5～2.0 mg/mL HDW，對照組加等體積的PBS。HDW干預(yù)24 h后，每孔加入0.5 mg/mL的MTT溶液100 μL，37 ℃孵育4 h，吸棄MTT，每孔加入DMSO 100 μL，室溫振蕩混勻后，ELX800酶標(biāo)儀(波長570 nm)測定各孔吸光度值(即A值)，細(xì)胞活力(%)=(HDW干預(yù)組A值/對照組A值)×100%；細(xì)胞抑制率(%)=對照組細(xì)胞活力-藥物組細(xì)胞活力。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取對數(shù)期生長的HCT-8/5Fu消化計數(shù)，按5×105個/mL接種于6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長至50%～60%時加入終濃度為0.5～2.0 mg/mL HDW。以不加藥細(xì)胞作為對照組(加等體積的PBS)，用DMI4000B倒置顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)的觀察并拍照。

1.2.5 miRNA芯片分析 取對數(shù)生長期HCT-8/5Fu細(xì)胞，按照1.0×106/孔的密度接種于6孔板中。分為對照組和HDW干預(yù)組(1.0 mg/mL)，細(xì)胞經(jīng)藥物干預(yù)24 h后，棄上清，用PBS清洗，每孔加RNAiso Plus 1 mL提取總小RNA，ND-2000 C超微量核酸分析儀測定RNA濃度和純度并芯片分析。本文選取上海欣景公司的miRNA表達(dá)譜芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。芯片探針版本為HmiOA 4.1，Human miRNA探針有1 087條，共涵蓋人源相關(guān)miRNA基因1090個。

1.2.6 定量PCR(Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction，QPCR)驗(yàn)證 取對數(shù)生長期的HCT-8/5-FU細(xì)胞，以5×105個/mL接種于6孔培養(yǎng)板，2 mL/孔，培養(yǎng)過夜后加入終濃度0.5 mg/mL HDW干預(yù)24 h。按上述方法進(jìn)行miRNA提取。取500 ng RNA進(jìn)行Poly(A)加尾反應(yīng)。混勻后，37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s。向反應(yīng)液中添加無RNA酶的去離子水至100 μL。QPCR反應(yīng)體系20 μL，即：cDNA溶液2 μL，SYBR Premix Ex Taq II(2×)10 μL，PCR Forward Primer(10 μM)0.8 μL，Uni-miR qPCR Primer(10 μM)0.8 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL，6 μL dH2O。引物:miR-92b-5p、miR-1247-3p、miR-4800-5p、miR-4454、miR-4443、miR-483-5p、U6由引物由中國寶生物工程(大連)有限公司提供?；靹蚝螅?500Fast QPCR儀進(jìn)行miRNA表達(dá)分析。

1.2.7 Gene Ontology(GO)及pathway分析 采用Cytoscape及其插件BINGO(http://www.Cytoscape.Org/)對miRNA靶基因進(jìn)行GO分析。GO分析包括了基因參與的生物過程(Biological Process)、發(fā)揮的分子功能(Molecular Function)、所處的細(xì)胞位置(Cellular Component)等3個方面的功能信息，并用BiNGO進(jìn)行GO顯著性分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。將靶基因向KEGG pathway數(shù)據(jù)庫映射，使用分析軟件DAVID進(jìn)行分析并根據(jù)統(tǒng)計檢驗(yàn)方法(P-value)選顯著富集的分類。通過Fisher Exact Test計算分析表達(dá)差異miRNAs調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2 結(jié)果

2.1 HDW對CRC耐藥細(xì)胞HCT-8/5FU生長的影響 HDW對人結(jié)腸癌5-FU耐藥細(xì)胞HCT-8/5-FU生長具有顯著的抑制作用。隨HDW濃度的增加，HCT-8/5-FU細(xì)胞的活力逐漸降低，細(xì)胞的生長受到抑制，呈劑量依賴效應(yīng)。與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 HDW對HCT-8/5-FU細(xì)胞生長的影響

注：與HDW-0 mg/mL組比較，*P<0.05

2.2 HDW對CRC耐藥細(xì)胞HCT-8/5-FU形態(tài)的影響 HCT-8/5-FU細(xì)胞經(jīng)不同濃度HDW干預(yù)后，與對照組比較，HCT-8/5-FU細(xì)胞密度具有不同程度減少。當(dāng)EEHDW濃度達(dá)到1 mg/mL時，HCT-8/5-FU細(xì)胞密度明顯減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)一些漂浮的脫落細(xì)胞；當(dāng)EEHDW濃度達(dá)到2 mg/mL時，細(xì)胞密度進(jìn)一步減少，細(xì)胞變圓、變小，大部分細(xì)胞脫落死亡。該結(jié)果進(jìn)一步表明了HDW可顯著抑制CRC耐藥細(xì)胞HCT-8/5-FU的生長，呈明顯的劑量效應(yīng)。見圖1。

2.3 HDW對CRC耐藥細(xì)胞HCT-8/5-FU miRNA表達(dá)的影響 miRNAs表達(dá)譜芯片分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HDW對CRC耐藥細(xì)胞HCT-8/5-FU的miRNA表達(dá)具有調(diào)控作用，共有57個miRNA發(fā)生了顯著的表達(dá)變化，HDW上調(diào)23個miRNA表達(dá)，下調(diào)34個miRNA表達(dá)。進(jìn)一步采用QPCR驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)HDW上調(diào)miR-92b-5p、miR-1247-3p、miR-4800-5p等表達(dá)，下調(diào)miR-4454、miR-4443、miR-483-5p等表達(dá)，與芯片結(jié)果相符。見圖2。

2.4 通路分析預(yù)測結(jié)果 采用miRNA靶標(biāo)基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行miRNA靶基因預(yù)測，結(jié)果顯示，預(yù)測的靶基因有1 775個(略)。針對以上1775個靶基因，將其分別投射至GO的3個功能上，結(jié)果顯示預(yù)測的靶基因分別富集于腫瘤細(xì)胞耐藥、遷移、侵襲、增殖、凋亡有關(guān)的信號通路。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對基因進(jìn)行細(xì)胞信號通路富集分析。HCT-8/5-FU細(xì)胞經(jīng)HDW處理前后結(jié)果顯示，在經(jīng)典通路數(shù)據(jù)庫KEGG中miRNA顯著富集于PI3K/Akt通路、TGF-β/Smad通路、MAPK通路、P53通路、Wnt通路、JAK-STAT通路等許多重要的生物途徑包括細(xì)胞耐藥、遷移、侵襲、增殖、凋亡等，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

圖1 HDW對HCT-8/5Fu細(xì)胞形態(tài)的影響

注：A.HDW-0 mg/mL組；B.HDW-0.5 mg/mL組；C.HDW-1.0 mg/mL組；D.HDW-2.0 mg/mL組

圖2 QPCR驗(yàn)證HDW對HCT-8/5FU細(xì)胞miRNA表達(dá)的影響

注：與HDW-0 mg/mL組比較，*P<0.05

表2 miRNA預(yù)測靶基因的通路富集分析

3 討論

腫瘤細(xì)胞MDR產(chǎn)生涉及到多條信號通路的異常激活，以及下游耐藥基因、藥物代謝酶以及凋亡調(diào)控因子的表達(dá)異常。近年來的研究表明miRNA等表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制在MDR相關(guān)信號通路活化及相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用[15-16]。前期實(shí)驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)HDW可以增加CRC HCT-8/5-FU細(xì)胞對5FU的敏感性，通過下調(diào)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員ABCG2，從而增加5-FU的蓄積[14]，然而具體的機(jī)制尚未完全闡明。為了進(jìn)一步揭示HDW抑制耐藥CRC細(xì)胞生長的機(jī)制，首先通過MTT實(shí)驗(yàn)觀察HDW對HCT-8/5-FU耐藥細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明HDW對HCT-8/5-FU細(xì)胞具有顯著抑制作用；并從miRNA表觀遺傳學(xué)調(diào)控進(jìn)一步探討HDW抑制CRC耐藥細(xì)胞的作用機(jī)制，采用miRNA表達(dá)譜芯片分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HDW對HCT-8/5-FU細(xì)胞的miRNA表達(dá)具有顯著的調(diào)控作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果的正確性和可靠性，對部分差異表達(dá)的miRNAs(miR-92b-5p、miR-1247-3p、miR-4800-5p、miR-4454、miR-4443、miR-483-5p)進(jìn)行Q-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明HDW對miRNAs表達(dá)的調(diào)控與芯片結(jié)果相一致。通過生物信息學(xué)的方法，利用靶基因預(yù)測軟件對miRNA靶基因進(jìn)行分析，并進(jìn)一步結(jié)合GO分析和Pathway分析，發(fā)現(xiàn)HDW對HCT-8/5FU細(xì)胞包括PI3K/Akt、TGF-β/Smad、MAPK、p53、Wnt和JAK-STAT等許多重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均有調(diào)控作用，涉及細(xì)胞的耐藥、遷移、侵襲、增殖、凋亡等多個方面，提示HDW可通過多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)發(fā)揮其抑制CRC作用及逆轉(zhuǎn)CRC耐藥作用。

總之，本文證實(shí)了HDW能通過抑制CRC耐藥細(xì)胞HCT-8/5-FU的活力發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用；HDW對CRC耐藥細(xì)胞HCT-8/5-FU的miRNAs表達(dá)具有顯著的調(diào)控作用，提示HDW通過調(diào)控miRNA表達(dá)對其相關(guān)信號通路發(fā)揮調(diào)控作用，進(jìn)一步為臨床應(yīng)用HDW治療CRC提供依據(jù)。但本研究涉及HDW調(diào)控耐藥細(xì)胞的miRNAs為首次報道，其與藥物敏感性的相關(guān)性還有待進(jìn)一步深入探討。

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EffectsofHerbaHedyotisDiffusaeonExpressionofmicroRNAsinColorectalCancerDrugResistantCells

Lin Jiumao1,2，Li Qiongyu1，Yan Zhaokun1，Lai Zijun1，Jin Yiyi1，Peng Jun1,2

(1AcademyofIntegrativeMedicine，F(xiàn)ujianUniversityofTraditionalChineseMedicine，F(xiàn)uzhou350122，China;2FujianKeyLaboratoryofIntegrativeMedicineonGeriatrics，F(xiàn)uzhou350122，China)

Objective:To study the regulatory effect of Herba Hedyotis Diffusae on multidrug-resistance (MDR)-related microRNAs (miRNAs) in colorectal cancer，and further explore the underlying mechanisms of its MDR reversion.MethodsThe signal pathway regulated by miRNA was forecasted by MTT assays，morphology observation，miRNA array analysis，QPCR validation，GO and Pathway analysis through treatment of HDW in HCT-8/5-FU cells.ResultsHDW significantly inhibited colorectal cell viability and decreased density of HCT-8/5-FU cells.There were 23 up-regulated and 34 down-regulated in 57 miRNA differential expression after HDW treatment; and QPCR verification confirmed that HDW increased expression of miR-92b-5p，miR-1247-3p and miR-4800-5p and decreased expression of miR-4454，miR-4443，miR-483-5p; and the signal pathway prediction showed that HDW could control PI3K/Akt，TGF-β/Smad，MAPK，P53，Wnt and JAK-STAT signaling pathways regulating MDR，migration，invasion，proliferation and apoptosis.ConclusionHDW can remarkably suppress proliferation in HCT-8/5-FU cells，and it is one of the mechanisms to reverse the drug resistance of colorectal cancer by regulating miRNAs expression.

Herba Hedyotis Diffusae; Colorectal cancer; microRNA; Drug resistance

教育部博士點(diǎn)基金博導(dǎo)類項(xiàng)目(20133519110003);陳可冀中西醫(yī)結(jié)合發(fā)展基金項(xiàng)目(CKJ2015007，CKJ2014013)

林久茂(1975.02—)，男，博士，副研究員，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合抗腫瘤的機(jī)制研究，E-mail：jiumaolin@hotmail.com

彭軍(1969.11—)，男，博士，研究員，研究方向：生化與分子生物學(xué)，E-mail：pjunlab@hotmail.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.052

(2016-08-10收稿 責(zé)任編輯：張文婷)