高繼海 王 偉 謝曉芳 曹小玉 彭 成

(成都中醫(yī)藥大學藥學院,中藥材標準化教育部重點實驗室,中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地,成都,611137)

附子品種的抗病性及根表真菌多樣性研究

高繼海 王 偉 謝曉芳 曹小玉 彭 成

(成都中醫(yī)藥大學藥學院,中藥材標準化教育部重點實驗室,中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地,成都,611137)

目的:在系統(tǒng)中藥思想指導下,研究附子品種的抗病能力及與外界真菌系統(tǒng)多樣性的關系。方法:使用高通量技術構建附子品種的根表真菌文庫,分析其多樣性指數(shù)與附子抗病品質形成的關系。結果:小花葉與瓜葉子型附子之間,以及健康與病害附子之間,其根表土壤的優(yōu)勢真菌種類、群落多樣性均存在差異,附子根系影響了土壤真菌的結構組成,阿太菌、總狀毛霉等是附子根腐病的致病菌群,而被孢霉屬、青霉菌屬等又組成病害菌的拮抗菌群。結論:本結果為附子農業(yè)的良好品質管理提供理論指導,也豐富了附子品種品質形成的系統(tǒng)學理論與分析方法。

系統(tǒng)中藥學;附子;根腐病;土壤真菌;高通量測序

附子是毛茛科植物烏頭(AconitumCarmichaelii)的子根加工品,一種典型的道地性中藥材,具有回陽救逆,助陽補火,散寒止痛之功效[1]。附子又是烏頭植物、生藥材等的統(tǒng)稱,其野生資源生長于川藏高原東緣起,向東遍歷長江中、下游以及珠江流域上游各省區(qū)的丘陵、高山地區(qū),還分布于江蘇向北經過山東達到遼寧南部的廣闊區(qū)域[2];而作為中藥農業(yè)作物,其栽培歷史逾1 300多年,主產于四川、陜西、云南、貴州、重慶等地區(qū),近年于四川地區(qū)的人工種植規(guī)模在2～3萬畝,產量占全國70%以上,“江油附子”“布拖附子”均獲得國家地理標志產品保護[3-4]。

系統(tǒng)中藥理論認為,品種是中藥品質形成的物質基礎和內部系統(tǒng)要素,而生境又與中藥品種相互影響,環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)與生物內部系統(tǒng)的相互作用是決定中藥品質的主要結構因素[5]。附子的品種按葉形區(qū)分為南瓜葉、大花葉、小花葉、鵝掌葉、莓葉子、油葉子和冒氏苗等。目前,附子栽培品種又以瓜葉子為主,混雜少量小花葉型。瓜葉附子以單產量高的優(yōu)勢,受到附農偏愛,所謂“江油附子個大質優(yōu)”即指瓜葉子品種[3],但瓜葉附子對植物系統(tǒng)外界的真菌更為敏感,極易受到根腐病等的侵染,以四川江油為例,2014—2016年有農田根腐病感染面積比例達50%之多,附農減收嚴重,經濟損失巨大。相較于瓜葉子品種,小花葉附子雖然產量小,其對外界系統(tǒng)根腐菌類的抗性能力較高,農田感染比例也較小。我國目前針對附子品種與根腐病抗性關系的科學研究與學術報道不多,甚至附子根腐病的致病原因尚未清楚,這種現(xiàn)狀使得根腐病的預防以及附子農業(yè)管理無所適從,影響了附農增產增收,也制約了附子產業(yè)的現(xiàn)代化、標準化、規(guī)范化發(fā)展。

本研究從品種內在系統(tǒng)與外部生境系統(tǒng)2個角度,在整理附子主要栽培品種抗病能力的基礎上,使用HiSeq 2500高通量測序技術檢測其根表真菌群落的生物多樣性,以期從外部系統(tǒng)闡釋附子品種的抗病性差異以及致病原因,為附子良好農業(yè)品質的管理提供理論指導,同時也豐富了附子品種品質形成的系統(tǒng)學理論與分析方法。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1.1.1 附子植株樣品采集 本研究所涉附子主要栽培品種有南瓜葉、大花葉、小花葉,于2016年06月中旬采集于四川省江油市河西鄉(xiāng)普照村GAP基地(N31°44′′,E104°42′)。按照葉形,對附子品種分別進行拍照,根系帶土采挖,并編號。

1.1.2 根表土樣品采集 附子植株樣品采挖后,小心刮取每株附子根系的根表土約100 g,多個實驗重復附子植株的土壤樣品混合后烘干,通過四號篩過濾掉木屑、石塊等雜質,取約10 g樣品用于總DNA提取和高通量測序。采集樣品包括正常附子根表土壤(編號T1、T2、T3、T4、T5,統(tǒng)稱G1)、大花葉型附子根表土壤(編號D1、D2、D3、D4,統(tǒng)稱G2)、患病大花葉型附子根表土壤(編號DV1、DV2、DV4,統(tǒng)稱G3)、小花葉型附子根表土壤(編號X1、X2、X3、X4、X5,統(tǒng)稱G4)。

1.2 土壤DNA提取與PCR擴增 采用SDS-CTAB法[7]提取土壤樣品總DNA,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。以稀釋后的基因組DNA為模板,使用帶Barcode的ITS特異引物進行PCR,其反應體系為30 μL:Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs,2×)15 μL,Primer(2 μM)3 μL(6 μM),gDNA(1 ng/μL)10 μL(5～10 ng),ddH2O 2 μL。ITS引物為:(ITS5-1737F)5′-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3′、(ITS2-2043R)5′-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3′。PCR反應程序為:98 ℃預變性1 min,30個循環(huán)(98 ℃,10 sec;50 ℃,30 sec;72 ℃,30 sec),72 ℃延伸5 min。

1.3 真菌cDNA文庫構建與物種注釋分析 根據(jù)PCR產物濃度進行等濃度混樣,充分混勻后使用1×TAE濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR產物,選擇主帶大小在400～450 bp之間的序列,割膠回收目標條帶。使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建,構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量,文庫合格后,使用HiSeq2500 PE250進行測序。高通量測序結果參照Qiime(Version 1.7.0)的Tags質量控制流程[8],進行Tags截取和長度過濾。Tags序列通過UCHIME Algorithm[9]與數(shù)據(jù)庫Unite database進行比對檢測嵌合體序列,去除嵌合體序列得到最終有效數(shù)據(jù)[10]。利用Uparse對所有樣品的有效數(shù)據(jù)在97%水平上進行聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units)[12],并對OTUs代表序列進行物種注釋,并分別在各個分類水平(界,門,綱,目,科,屬,種)統(tǒng)計各樣本的群落組成。使用MUSCLE進行快速多序列比對[12],得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關系。將OTU數(shù)值生成相對豐富度(%)進行物種分類樹統(tǒng)計,并使用SPSS(v 19)統(tǒng)計結果。

1.4 群落多樣性與結構分析 利用α多樣性分析土壤樣品內真菌的豐富度[13],用β多樣性指數(shù)分析土壤樣品組間差異。本文重點研究了病態(tài)土壤與健康土壤真菌多樣性的差異,用Qiime軟件以Weighted Unifrac距離矩陣做UPGMA聚類分析,并將聚類結果與各樣品在門、屬、種水平上的物種相對豐度整合展示。

2 結果與分析

2.1 附子主要栽培品種及根腐病抗性 在四川江油、布拖等主產地,附子栽培品種主要有南瓜葉、大花葉與小花葉3種。同等苗齡的這3種附子,南瓜葉型的附子葉形似南瓜葉般寬厚、油亮,葉齒平緩,莖桿粗壯;小花葉型附子莖桿細弱易,有較多分蘗出于葉腋中,葉面小、葉基狹長、葉尖尖銳,其形狀如菊科植物艾,故又稱艾葉型(圖1A);大花葉型附子的莖桿也較粗,葉片規(guī)格介于南瓜葉與小花葉之間,葉尖端也較尖銳,附農將之與南瓜葉型附子統(tǒng)稱瓜葉子或花葉子(圖1B)。

瓜葉附子容易感染根腐病,其發(fā)病從根外至根內、自地下而地上,根表皮初為水浸狀病斑,逐漸擴大至根組織內部,附子塊根最后完全腐爛(圖1F、H),而整個植株受害初期葉片萎蔫、下垂,似水燙狀,嚴重時患病植株葉片自下而上變黃褐色或紅紫色枯焦,甚至根莖結合處土面可見白色菌絲體與黑褐色似油菜籽大小的菌核(圖1D)。瓜葉附子生病后,其病菌蔓延速度迅速,極難控制。相對于瓜葉子型品種,小花葉附子對根腐病的抵抗能力強,大田栽培時其植株少有生病(圖1A、C、E、G)。瓜葉子與小花葉型附子對根腐病的明顯抗性差異,為其優(yōu)良品質的培育提供了篩選材料,而根腐病的致病真菌群落也是附子土壤生境系統(tǒng)的較佳研究對象。

圖1 小花葉附子(左)與瓜葉子附子(右)

注：A、B,正常植株葉形;C、D,小花葉附子莖基與染病瓜葉附子莖基;E、F,小花葉附子與染病瓜葉附子;G、H,小花葉附子與染病瓜葉附子橫切

2.2 土壤真菌數(shù)據(jù)庫的構建與測序注釋 本研究通過分析土壤真菌ITS高通量測序技術,成功構建了4組數(shù)據(jù)庫,分別為對照正常土壤G1、大花葉附子根表土壤G2、患病大花葉附子根表土壤G3和小花葉附子根表土壤G4,共17個土壤樣品。4組數(shù)據(jù)庫包含996 653條序列,去除條形碼引物后獲得975 213條序列。根據(jù)QC和Nochime分析,最終獲得總有效序列948 843條(95.25%),核苷酸195 583 495個,平均每個片段含核苷酸206個。Q30值達到99.36%,說明測序質量良好。

所有土壤樣品共獲得12266個OTUs,各樣品平均OTUs數(shù)722個,表明附子生境系統(tǒng)中存在復雜的共生真菌群落。經過注釋分析,99.03%的真菌序列可以注釋到界、門、綱、目、科、屬、種7個分類等級,如在門水平上(圖2A),土壤真菌主要分布在接合菌門(Zygomycota)、子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和壺菌門(Chytridiomycota)等,而在屬水平上(圖2B,表1),土壤真菌主要為被孢霉屬(Mortierella)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、青霉菌屬(Penicillium)、阿太菌屬(Athelia)和毛霉屬(Mucor)等。

2.3 土壤真菌的多樣性差異分析 對附子根表真菌做物種豐富度、多樣性分析,并構建聚類樹,圖2結果顯示,瓜葉子與小花葉型附子品種的根表土壤系統(tǒng)中,真菌群落結構存在較明顯的差異。由圖2A可見,在門的水平上,正常健康土壤(G1)中接合菌門、子囊菌門和擔子菌門等分布比較均衡,而附子根表的真菌群落結構發(fā)生了變化,如小花葉品種(G4)以接合菌門為顯著的根表優(yōu)勢菌群,瓜葉子品種(G2、G3)以擔子菌門為主,其次為接合菌門(或子囊菌門)。同樣為瓜葉子品種,健康附子與生病附子的根表真菌系統(tǒng)也發(fā)生較顯著的變化(P<0.05),表現(xiàn)為接合菌門和擔子菌門在染病土壤系統(tǒng)中含量增加,而子囊菌門的豐度減小。可見,附子各品種的根系均影響了周圍正常土壤的真菌群落結構組成。

由圖2B和表1可見,在屬的水平上,對照土壤組的真菌群落也最為均衡,物種豐富度也最高(shannon指數(shù)=5.32)。瓜葉子品種的根表真菌豐富度有所降低,shannon指數(shù)分別為4.91、4.76,在小花葉附子土壤中,被孢霉屬真菌含量顯著升高,達到36.4%,這導致其真菌系統(tǒng)的豐富度最低。同樣為瓜葉子品種,生病土壤(G3)中阿太菌屬真菌含量達到10.3%,約為健康組(G2)的2.6倍,而且G3組含有更多毛霉屬、被孢霉屬類真菌,所占比例分別約為G2組的1.6和5.4倍,表明生病附子的土壤生境中存在更大的真菌群落結構失衡情況。

在物種水平上,本研究依據(jù)附子根表真菌序列構建了UPGMA樹(圖2),并將物種相對豐度、各附子品種的該物種占比進行標注,圖3和表2顯示,除了分類級別屬水平上的群落結構差異,各附子品種、健康與染病附子根表系統(tǒng)之間,其真菌的物種水平也發(fā)生了較大的變化。如患病瓜葉子(G3)土壤中,阿太菌(A.rolfsii)、總狀毛霉(Mucorracemosus)、被孢霉屬的M.chlamydospora、青霉菌屬的P.simplicissimum等含量,相較于對照土壤與小花葉土壤均顯著增加,并且成為G3組的優(yōu)勢真菌。阿太菌又稱白絹病菌(Sclerotiumrolfsii),主要分布于溫暖潮濕地區(qū),是導致土豆、向日葵、大豆和一些觀賞花卉植物根部腐爛的主要病菌[14-15],江油地區(qū)夏季平均溫度為30～33 ℃,雨水充沛,恰好適宜該菌生長。有研究表明,總狀毛霉可以導致小番茄根部軟化,是根腐疾病的致病菌之一[16]。此外,某些豐度較小的真菌,其在染病土壤系統(tǒng)中也明顯改變。如莖點霉屬Phomaadonidicola的含量在G3組中升高到G2組的4倍,研究表明該屬許多真菌可以造成苜蓿、大豆感染嚴重根腐病[17]。

圖2 4組土壤真菌的UPGMA聚類樹及其在不同水平的相對豐富度

注：A,左側是UPGMA聚類樹結構,右側的是各樣品真菌在門水平上的相對豐度分布;B,各樣品中真菌在屬水平的相對豐富度

表1 附子根表土壤真菌在屬水平分布的相對豐富度

圖3 附子根表土壤真菌的系統(tǒng)分類樹及其在不同土壤的分布比例

注：分類樹繪制選擇使用附子根表真菌數(shù)據(jù)庫中含量豐度最高的20種真菌物種,以圓圈表示,其圓圈直徑與其在真菌群落中的相對豐度成正比,期在4組樣品的相對比例又以圓圈中不同顏色標示

表2 附子根表土壤部分真菌在種水平的相對豐富度

有意思的是,在染病附子根表真菌群落(G3)中,被孢霉屬的豐度也有較大的提高,該屬是一類廣泛存在于熱帶雨林和溫帶農業(yè)地區(qū)的真菌,主要分布于植物根表土壤,它們能夠適應不同溫度,可以拮抗(抑制)阿太菌這類利用土壤傳播的真菌[18]。同時,小花葉附子根表真菌群落(G4)中,被孢霉屬含量超過36%,可見其對小花葉附子的抗根腐菌能力起到重要作用。另外,P.simplicissimum于抗病品種小花葉附子土壤中含量相對較高,研究發(fā)現(xiàn)其是一種促進植物生長,提高植物抗性的真菌[19],因此它也應與該附子品種的抗病性狀有關聯(lián)。G4樣品中紅酵母屬的Rhodotorulaingeniosa,也高于其他品種,該屬真菌可以幫助甜菜抵御土壤立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)等的侵害[20-21],也是小花葉附子品種抵抗根腐病的因素之一。

3 討論

系統(tǒng)中藥理論是研究中藥材種質資源的理想理論,它認為品種是中藥品質形成的物質基礎和內部要素,土壤、微生物等生境條件是其外界系統(tǒng)要素,而多維評價、自組織分析方法又兼顧到內外要素的相互協(xié)同、突變與有序演化過程,而本文針對中藥材附子的實驗研究及數(shù)據(jù)分析,從實踐上闡釋了該理論。研究所涉的小花葉、瓜葉子等多品種抗病性狀,是其優(yōu)良品質形成的客觀內在要素,而附子自身及該農業(yè)性狀品質又與外在的土壤真菌系統(tǒng)存在相互作用,一方面附子植物改變了對照土壤中平衡的接合菌門、子囊菌門和擔子菌門比例組成,致使小花葉、瓜葉子根表土壤系統(tǒng)中出現(xiàn)了明顯的優(yōu)勢菌群(圖2,表1)。另一方面,這些外在的真菌系統(tǒng)又影響著附子品質變化,阿太菌等優(yōu)勢菌群導致G3組附子發(fā)生根腐病害,被孢霉屬菌類保護小花葉附子免受致病菌感染(圖3,表2)。此外,本研究結果還顯示附子外界生境的真菌系統(tǒng)中也存在著協(xié)同與拮抗作用,如阿太菌外的其他致病菌也參與植物根腐病的發(fā)生,而青霉菌屬“有益菌”物種隨著G3組附子根腐病的發(fā)生也有所增加,可能在附子抗病性方面發(fā)揮著重要的外部作用。

本文主要外部系統(tǒng)入手,使用HiSeq 2 500高通量測序技術檢測附子根表真菌群落的多樣性,以期闡釋附子品種的抗病性差異以及致病原因,為附子良好農業(yè)品質的管理提供理論指導,發(fā)現(xiàn)阿太菌等可能為附子根腐病的主要致病菌之一,課題組后期已從病害材料中純化獲得該菌株,侵染實驗也驗證了其致病性,這為附子根腐病的預防以及農業(yè)良好品質管理工作奠定了堅實基礎,同時也豐富了附子品種品質形成的系統(tǒng)學理論于分析方法。然而,附子內在品質的遺傳物質與藥效物質成分,在與外界系統(tǒng)的相互關系中發(fā)揮著怎樣的主導作用,以及附子生命系統(tǒng)內部存在哪些協(xié)同、拮抗與演化因素,還需要后續(xù)進一步研究。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:191-193.

[2]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京:科學出版社,1979:264.

[3]杜路,曾加.論道地藥材的地理標志保護[J].西北大學學報：哲學社會科學版,2012,42(5):137-141.

[4]薛榮娟.論道地藥材的地理標志保護[D].重慶:西南政法大學,2013.

[5]彭成.論系統(tǒng)中藥學的科學內涵[J].中藥與臨床,2016,7(3):1-4,8.

[6]黃勤挽,周子渝,王瑾,等.附子道地性形成模式的梳理與考證研究[J].中國中藥雜志,2011,36(18):2599-2601.

[7]蔡劉體,胡重怡,羅正友.SDS-CTAB法提取煙草病圃土壤微生物總DNA[J].江西農業(yè)學報,2011,23(2):119-121.

[8]Caporaso JG,Kuczynski J,Stombaugh J,et al.QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J].Nat Methods,2010,7(5):335-336.

[9]Edgar RC,Haas BJ,Clemente JC,et al.UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection[J].Bioinformatics,2011,27(16):2194-2200.

[10]Haas BJ,Gevers D,Earl AM,et al.Chimeric 16S rRNA sequence formation and detection in Sanger and 454-pyrosequenced PCR amplicons[J].Genome Res,2011,21(3):494-504.

[11]Edgar RC.UPARSE:highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads[J].Nat Methods,2013,10(10):996-998.

[12]Edgar RC.MUSCLE:multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput[J].Nucleic Acids Res,2004,32(5):1792-1797.

[13]Li B,Zhang X,Guo F,et al.Characterization of tetracycline resistant bacterial community in saline activated sludge using batch stress incubation with high-throughput sequencing analysis[J].Water Res,2013,47(13):4207-4216.

[14]Wunsch MJ,Bergstrom GC.Genetic and morphological evidence that Phoma sclerotioides,causal agent of brown root rot of alfalfa,is composed of a species complex[J].Phytopathology,2011,101(5):594-610.

[15]Pastor N,Carlier E,Andrés J,et al.Characterization of rhizosphere bacteria for control of phytopathogenic fungi of tomato[J].J Environ Manage,2012,95 Suppl:S332-337.

[16]Kwon JH,Hong SB.Soft Rot of Tomato Caused by Mucor racemosus in Korea[J].Mycobiology,2005,33(4):240-242.

[17]Wunsch MJ,Bergstrom GC.Genetic and morphological evidence that Phoma sclerotioides,causal agent of brown root rot of alfalfa,is composed of a species complex[J].Phytopathology,2011,101(5):594-610.

[18]Miao CP,Mi QL,Qiao XG,et al.Rhizospheric fungi of Panax notoginseng:diversity and antagonism to host phytopathogens[J].J Ginseng Res,2016,40(2):127-134.

[19]Hossain MM,Sultana F,Kubota M,et al.The plant growth-promoting fungus Penicillium simplicissimum GP17-2 induces resistance in Arabidopsis thaliana by activation of multiple defense signals[J].Plant Cell Physiol,2007,48(12):1724-1736.

[20]El-Tarabily KA.Suppression of Rhizoctonia solani diseases of sugar beet by antagonistic and plant growth-promoting yeasts[J].J Appl Microbiol,2004,96(1):69-75.

[21]Hilber-Bodmer M,Schmid M,Ahrens CH,et al.Competition assays and physiological experiments of soil and phyllosphere yeasts identify Candida subhashii as a novel antagonist of filamentous fungi[J].BMC Microbiol,2017,17(1):4.

StudyonDiseaseResistanceofRadixAconitiLateralisPraeparataVarietiesandtheirRhizoplaneFungalDiversities

Gao Jihai, Wang Wei, Xie Xiaofang, Cao Xiaoyu, Peng Cheng

(CollegeofPharmacy,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine;KeyLaboratoryofChineseHerbsStandardizationofMinistryofEducation;Co-constructKeyLaboratoryofSystematicResearch,DevelopmentandUtilizationofChineseMedicinalResources,Chengdu611137,China)

Objective:To study the relationship between the disease resistance of Radix Aconiti Lateralis Praeparata and the diversity of fungi system under the guidance of systematic theory of Chinese herbal medicine.MethodsHigh-throughput technology was used to build the rhizoplane fungus library of different types of Radix Aconiti Lateralis Praeparata, and then the relationship between the diversity index and the anti-disease capacity was analyzed.ResultsThere were differences in the dominant strains and the diversity of fungi community for the rhizoplane soils between the Xiao-Hua Radix Aconiti Lateralis Praeparata and the Gua-Ye Radix Aconiti Lateralis Praeparata, the healthy and pathogenic Radix Aconiti Lateralis Praeparata; The root system of Radix Aconiti Lateralis Praeparata affect the structure of soil fungi. Atheli arolfsii，Mucor racemosus were the pathogenic fungi, while the Mortierella, Penicillium are antagonistic fungi to root rot pathogens.ConclusionThe results provide theoretical guidance for good quality management of Radix Aconiti Lateralis Praeparata agriculture, and enrich the theory and analysis methods for the system science of Chinese herbal medicine.

System science of Chinese herbal medicine; Radix Aconiti Lateralis Praeparata; Root rot; Soil fungus; High-throughput sequencing

國家自然科學基金重點項目(81630101);國家發(fā)改委標準化項目(ZYBZH-C-SC-51);國家自然科學基金國家基礎科學人才培養(yǎng)基金(J1310034);四川省中醫(yī)藥管理局“川產道地藥材綜合開發(fā)與區(qū)域發(fā)展”項目(2016ZY008);四川省科技廳應用基礎計劃(2016JY0089)

高繼海(1983.11—),男,博士,講師,研究方向：分子生藥學研究,E-mail:gaojihaiwuwei@163.com

彭成(1964.03—),男,博士,教授,博士研究生導師,研究方向：中藥毒效的系統(tǒng)評價與整合研究,E-mail:pengchengchengdu@126.com

R282.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.004

(2017-10-09收稿 責任編輯：王明)