郭定章，廖天利，龔維，冉莉，張力力

（重慶市黔江區(qū)畜牧獸醫(yī)局，重慶 黔江 409000）

發(fā)酵床養(yǎng)豬的安全性評(píng)定

郭定章，廖天利，龔維，冉莉，張力力

（重慶市黔江區(qū)畜牧獸醫(yī)局，重慶 黔江 409000）

為評(píng)估微生態(tài)發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)在生產(chǎn)中的安全性，本試驗(yàn)在某養(yǎng)豬場(chǎng)分別采集發(fā)酵床的表層、中層、深層墊料樣品，對(duì)其中的大腸桿菌進(jìn)行分離、鑒定，并進(jìn)行小白鼠致病性試驗(yàn)。結(jié)果顯示：從發(fā)酵床墊料中分離到的6株大腸桿菌都具有致病性，可見(jiàn)微生態(tài)發(fā)酵床養(yǎng)豬模式存在一定的安全隱患。

發(fā)酵床；養(yǎng)豬；安全性評(píng)定

發(fā)酵床養(yǎng)豬是控制畜禽糞便排放與污染的一種養(yǎng)殖模式[1]，其原理是采集篩選出自然環(huán)境中的多種有益微生物，再以大接種量與豬糞中正常菌群構(gòu)成發(fā)酵床的優(yōu)勢(shì)菌群，以鋸末、稻殼等材料為發(fā)酵墊料，在發(fā)酵床原位降解、消納糞尿。有人認(rèn)為該技術(shù)具有成本低、耗料少、效益高、操作簡(jiǎn)單、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，主張推廣應(yīng)用該技術(shù)[2]，但實(shí)際生產(chǎn)中，發(fā)酵床養(yǎng)豬患病的可能性較高，是否與發(fā)酵墊料中的微生物有關(guān)有待進(jìn)一步論證。為了評(píng)估發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)的安全性和科學(xué)性，本試驗(yàn)對(duì)養(yǎng)豬發(fā)酵床中的主要病原菌——大腸桿菌進(jìn)行了分離鑒定。

1 材料

1.1 樣品 發(fā)酵床墊料采集自重慶市黔江區(qū)某豬場(chǎng)。

1.2 主要試劑 麥康凱培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)液、革蘭氏染液。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠，4～6周齡，18～22g，由西南大學(xué)榮昌校區(qū)提供。

1.4 主要儀器 生化鑒定管、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)振蕩器、高壓滅菌鍋、高倍顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱。

2 方法

2.1 樣品采集 采用五點(diǎn)采樣法，分別在發(fā)酵床1和發(fā)酵床2內(nèi)各自不同位置的5個(gè)點(diǎn)，采集墊料表層、中層、深層的墊料樣品各10g，然后將相同層級(jí)的樣品混合在一起裝入滅菌瓶?jī)?nèi)。

2.2 樣品處理 分別在6 mL LB培養(yǎng)液中加入1 g墊料樣品，37℃溫箱中培養(yǎng)12h。

2.3 鑒別培養(yǎng) 將LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)的菌液分別劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃溫箱中培養(yǎng)24h。

2.4 純化培養(yǎng) 從麥康凱瓊脂平板上挑取單個(gè)磚紅色疑似菌落，然后移植于普通瓊脂培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng) 18～24h，重復(fù)2～3次，達(dá)到純化的目的。

2.5 細(xì)菌鑒定 將分離純化的不同菌株分別進(jìn)行革蘭氏染色和生化反應(yīng)試驗(yàn)，革蘭氏染色和生化特性檢測(cè)按參考文獻(xiàn)[3]進(jìn)行，根據(jù)鏡檢的細(xì)菌形態(tài)和大小，以及生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果，并結(jié)合該菌株在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特征進(jìn)行鑒定。

2.6 細(xì)菌致病力檢測(cè) 將分離純化的細(xì)菌于LB培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)12h，然后分別用滅菌的磷酸鹽緩沖生理鹽水洗滌為混懸菌液，濃度為 1×108～2×108CFU/mL。將每種混懸菌液腹腔注射5只小白鼠（0.2mL/只），對(duì)照組小白鼠注射等量的滅菌生理鹽水，觀察記錄小白鼠的發(fā)病死亡情況。死亡的小白鼠立即剖檢，無(wú)菌采集其肝臟和心血，劃線于普通平板進(jìn)行接種菌回收試驗(yàn)，從培養(yǎng)特性、形態(tài)、染色特征幾方面進(jìn)行判定。

3 結(jié)果

3.1 菌落特征 麥康凱培養(yǎng)基上長(zhǎng)有紅色、圓形、光滑、濕潤(rùn)、中央隆起、中等大小的菌落，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出灰白色、圓形、稍隆起、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊的中等大小菌落（直徑約1～2mm）。染色鏡檢后發(fā)現(xiàn)呈革蘭氏陰性、兩端鈍圓、中等大小的桿菌。將培養(yǎng)特征和鏡檢特征比對(duì)分析，認(rèn)為分離到6株疑似大腸桿菌菌株[4]。根據(jù)墊料采集位置及發(fā)酵床號(hào)數(shù)分別編號(hào)為表 1、中 1、深 1 和表 2、中 2、深 2（下同）。

3.2 生化鑒定結(jié)果 6株疑似大腸桿菌菌株的生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。將6株疑似菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果與大腸桿菌生理生化特性進(jìn)行比對(duì)[4]，確定分離到的6株細(xì)菌均為大腸桿菌。

表1 細(xì)菌生理生化鑒定結(jié)果

3.3 致病性試驗(yàn)結(jié)果 將分離到的6株細(xì)菌對(duì)30只小白鼠進(jìn)行毒力試驗(yàn)，24 h后試驗(yàn)組小白鼠共有20只死亡，對(duì)照組小白鼠無(wú)死亡。

剖檢死亡小白鼠，可見(jiàn)其胃腸膨脹，腸腔內(nèi)充滿黃色的水樣稀糞，腸道彌漫性出血，因此判斷這6株細(xì)菌具有致病性。采集死亡小白鼠病料進(jìn)行菌株回收試驗(yàn)，用麥康凱培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h，結(jié)果在平板上形成粉紅色或磚紅色、表面光滑、圓形、隆起、濕潤(rùn)和中等大小的菌落，經(jīng)鏡檢和生理生化鑒定為大腸桿菌[5]。

在以上發(fā)酵床墊料中，從表層分離的大腸桿菌致死率高達(dá)100%，從中層和底層分離的大腸桿菌致死率都為50%。

4 小結(jié)與討論

發(fā)酵床源于日本，在韓國(guó)、新西蘭、荷蘭得到研究和應(yīng)用，并取得了成功。本試驗(yàn)涉及的黔江某豬場(chǎng)于2008年開(kāi)始以發(fā)酵床模式養(yǎng)殖生豬，在近幾年養(yǎng)殖過(guò)程中不斷發(fā)生一些腹瀉、呼吸困難等疾病，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)對(duì)該豬場(chǎng)幾個(gè)發(fā)酵床的墊料進(jìn)行了細(xì)菌的分離鑒定，最終獲得了6株致病性大腸桿菌。新建發(fā)酵床中本身及蓄積的病原體較少，對(duì)豬的影響不顯著，這可能是現(xiàn)有部分報(bào)道稱發(fā)酵床養(yǎng)豬發(fā)病率較低的主要原因[6]。但是當(dāng)發(fā)酵床使用了1～2年甚至更長(zhǎng)時(shí)間后，發(fā)酵床的糞便處理效果降低，多批豬群排出的病原菌就會(huì)大量蓄積在發(fā)酵床中，從而威脅生豬健康。

有學(xué)者認(rèn)為，微生物發(fā)酵床通過(guò)微生物發(fā)酵使墊料里層溫度高達(dá)60～70℃，可以殺滅或抑制細(xì)菌、病毒繁殖，從而有利于生豬健康生長(zhǎng)。但生產(chǎn)上并非所有發(fā)酵床都能達(dá)到或長(zhǎng)期保持60～70℃高溫，表層的溫度肯定會(huì)低于中層和底層，這就導(dǎo)致表層的大腸桿菌數(shù)量和毒性高于中層和底層。本試驗(yàn)分離到的6株大腸桿菌，對(duì)小白鼠的平均致死率為66.7%，其中表層菌株的致死率高達(dá)100%，中層和底層的致死率均為50%。本試驗(yàn)表明發(fā)酵床養(yǎng)豬存在一定的安全隱患?！?/p>

[1] 劉小麗，張偉.生態(tài)養(yǎng)豬法中發(fā)酵床的制作方法[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn)，2011（2）：18.

[2] Gadd J.Unnel housing of pigs in livestock environment IV[A]∥Fourth international symposium michigan[C].Michigan：American Society of Agricultural Engineers，1993：1040-1048.

[3] 姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006：36-42.

[4] 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007：99-107.

[5] 李學(xué)伍，張改平，鄧瑞廣，等.仔豬大腸桿菌病流行菌株的分離與鑒定[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000（8）：28-30.

[6] 朱洪，常志州，葉小梅，等.基于畜禽廢棄物管理的發(fā)酵床技術(shù)研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（1）：354-358.

Safety Evaluation of Fermentation Bed for Pigs Breeding

Guo Dingzhang，Liao Tianli，Gong Wei，et al.

（Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Qianjiang District ，Chongqing Qianjiang 409000，China）

In order to evaluate the safety of microecological fermentation bed for pigs breeding，this experiment chose the padding samples from the surface，middle and deep parts of the fermentation bed in a pig farm，isolated and identificated the samples,Escherichia coli.Then，the pathogenic experiment was carried out on the mice.The results showed that 6 strains of pathogenic E.coli were successfully isolated from the padding samples，so we thought that microecological fermentation bed for pigs breeding had some hidden dangers.

Fermentation bed；Pigs breeding；Safety evaluation

S815.2

B

1001-8964（2017）12-0035-02

2017-08-20

郭定章（1976-），男（土家族），重慶黔江人，大學(xué)本科，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，現(xiàn)從事動(dòng)物疫病防控和畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣工作。