魏怡冰，魏升華，王志威，嚴福林

(貴陽中醫(yī)學院，貴州 貴陽 550000)

黔產(chǎn)9種薯蕷屬植物分子鑒別及親緣關系研究

魏怡冰，魏升華*，王志威，嚴福林

(貴陽中醫(yī)學院，貴州 貴陽 550000)

為揭示黔產(chǎn)薯蕷屬植物9個種之間的親緣關系，根據(jù)葉綠體matK、rbcL、psbA-trnH序列片段對其進行種間分子鑒別研究。結果表明，黔產(chǎn)薯蕷屬植物9個種的matK、psbA-trnH、rbcL序列長度分別為1 076～1 144 bp、361～382 bp、1 160～1 209 bp，當空位始終做缺失處理時，其變異位點分別占序列總長度的14.3%、7.8%及8.7%。系統(tǒng)進化分析顯示，來自9個種31份樣本的薯蕷屬植物分為了4個大組。其中，黃獨單獨為一組，為基生翅組；黑珠芽薯蕷和高山薯蕷聚為一組，為復葉組；光亮薯蕷和毛膠薯蕷聚為一組，為頂生翅組；光葉薯蕷、薯莨、日本薯蕷以及薯蕷聚為一組，為周生翅組。表明matK、rbcL、psbA-trnH序列片段對薯蕷屬植物的系統(tǒng)分類具有明顯的指導價值。

薯蕷屬； DNA條形碼；matK；rbcL；psbA-trnH

薯蕷科植物中，我國僅有薯蕷屬(Dioscorea)1個屬，共52種，分為8個組[1-2]。貴州分布的薯蕷屬植物共有25種以及1變種、1引種[3]，大多可作為民族藥材入藥，主要用于脾虛泄瀉、消渴、帶下、風濕性關節(jié)炎、胃痛、跌打損傷、無名腫毒等癥。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，原有的薯蕷屬植物分類與分子鑒別試驗結果吻合度不高，對藥用的準確性造成了一定影響[4-5]。

分子鑒定方法是指用于動植物進化關系及系統(tǒng)學研究的DNA序列、分子標記和指紋圖譜等各種分析技術的總稱。該方法于20世紀90年代中期開始用于藥用植物的鑒定，例如Cheung等[6]、曹暉等[7]先后采用AP-PCR、RAPD等方法鑒定人參、苦地膽等中藥材。近年來，針對傳統(tǒng)分子遺傳標記技術遇到的瓶頸問題，有學者利用DNA條形碼的技術優(yōu)勢，將其成功應用于鹿茸、赤芍和威靈仙等中藥材及其混偽品的鑒別中[8-10]。Guo等[11]利用DNA條形碼psbA-trnH、rbcL、matK 3個片段對唇形科藥用植物黃芩及其3種混偽品進行了鑒別;Sui等[12]也利用DNA條形碼的這3個片段對6種清風藤屬植物和7種市場混淆品進行鑒定。而薯蕷屬植物藥用易混淆，以常規(guī)鑒別方法難以準確區(qū)分其種類，因此，為保證薯蕷屬植物的用藥準確性，選用rbcL、matK及psbA-trnH序列，對薯蕷屬9個種31份樣本進行分子鑒定，分析薯蕷屬植物9個種之間的親緣關系，為薯蕷屬植物的系統(tǒng)分類研究提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

野外采集薯蕷屬植株活體，引種至貴陽中醫(yī)學院種質圃，經(jīng)魏升華副教授鑒定，憑證標本保存于貴陽中醫(yī)學院生藥教研室標本室，其樣本具體信息如表1所示。共31份樣本，均為生長狀況良好的植株中部健康葉片，去掉主脈后用70%乙醇擦去葉面灰塵，用于總DNA的提取。

1.2 試劑

Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒、TaqPCR Master Mix、4S Green Plus染料、DNA Marker等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司，引物(表2)合成及序列測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 9個種31份薯蕷屬植物來源

表2 試驗所用引物

1.3 試驗方法

1.3.1 總DNA提取 總DNA的提取按照生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒操作說明書進行，提取所得基因組DNA在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴增 對9種薯蕷屬植物共計31份樣本的matK、rbcL及psbA-trnH片段分別進行PCR擴增，PCR擴增反應在ProFlex PCR System上進行。反應體系為50 μL，其中包括：2 μL DNA模板、正向和反向引物各2 μL、TaqPCR Master Mix 24 μL，以ddH2O補齊。PCR反應程序為：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，適度退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個熱循環(huán)；72 ℃后延伸2 min。取2 μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)4S Green Plus染色，用凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察并拍照。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，送樣至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序引物為PCR引物。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 得到測序結果后，將所有序列用Muscle 3.6軟件進行排序，然后利用Gblock 0.91b軟件進行序列保守區(qū)的選擇并將兩端切平。利用Mega 4.0對處理好的序列構建Maximum Parsimony(MP)樹，設置Close-neighbor-interchange(CNI)水平為3，Random Addition trees為10。獲取50%一致性系統(tǒng)進化樹(50% Majority rule consensus tree)，進行靴帶法(Bootstrap analysis)檢測，抽樣次數(shù)為1 000。根據(jù)靴帶支持率(BS)評估各分支可靠性。BS≤50為不支持；BS介于51～75為低支持，BS介于76～85為中度支持；BS≥86為高支持或強烈支持。

2 結果與分析

2.1 matK、rbcL及psbA-trnH片段擴增

測序后所得的各片段長度及堿基含量如表3所示，薯蕷屬植物9個種31份樣本的3條基因片段matK、psbA-trnH、rbcL長度分別為1 076～1 144 bp、361～382 bp、1 160～1 209 bp。序列經(jīng)比對，排序后兩端切平，31份材料中3條基因片段的序列總長度在2 628～2 710 bp，(G+C)含量在38.24%～39.38%。

表3 matK、rbcL及psbA-trnH 3條片段擴增結果

2.2 matK、psbA-trnH、rbcL片段的序列分析

31份材料的片段擴增中，matK序列排序后兩端切平，當空位始終做缺失處理時，序列長1 032 bp，含變異位點148個，占序列總長度的14.3%；psbA-trnH序列排序后兩端切平，當空位始終做缺失處理時，序列長361 bp，含變異位點28個，占序列總長度的7.8%；rbcL序列排序后兩端切平，當空位始終做缺失處理時，序列長1 103 bp，含變異位點96個，占序列總長度的8.7%。

2.3 基于matK、psbA-trnH、rbcL聯(lián)合片段的系統(tǒng)發(fā)育分析

從圖1可以看出，基于對matK、psbA-trnH、rbcL聯(lián)合片段的MP分析，來自9個種31份樣本的薯蕷屬植物分為了4組。其中，來自貴陽中醫(yī)學院A3苗圃(HD-1—HD-3)、貴陽中醫(yī)學院苗圃(HD-4)和紫云縣板當鎮(zhèn)(HD-5)的黃獨單獨為一組，為基生翅組；來自紫云縣板當鎮(zhèn)(HZY)的黑珠芽薯蕷和來自平壩縣高峰山(GS-1)、紫云縣板當鎮(zhèn)(GS-2)、貴陽市花溪區(qū)平橋(GS-3)及貴陽中醫(yī)學院苗圃(GS-4)的高山薯蕷聚為一組，為復葉組；來自平壩縣高峰山(GL-1—GL-3)的光亮薯蕷和來自貴陽市花溪區(qū)思雅(MJ-1)、紫云縣板當鎮(zhèn)(MJ-2)、施秉縣雙井鎮(zhèn)龍?zhí)链?MJ-3—MJ-5)的毛膠薯蕷聚為一組，為頂生翅組；來自大方縣天生橋(GY)的光葉薯蕷，來自貴陽中醫(yī)學院苗圃(SL)的薯莨，來自貴陽中醫(yī)學院苗圃(RB-1)、施秉縣雙井鎮(zhèn)龍?zhí)链?RB-2—RB-4)的日本薯蕷，來自苗圃(SY-1—SY-3)、貴陽市花溪區(qū)思雅(SY-4)、施秉縣雙井鎮(zhèn)龍?zhí)链?SY-5—SY-7)的薯蕷聚為一組，為周生翅組。

圖1 matK、psbA-trnH、rbcL聯(lián)合片段的MP進化樹分析

3 結論與討論

從葉綠體基因組中選擇植物DNA條形碼對植物進行分類鑒別是可行的[13]，但是，單一片段解決全球植物的分類鑒定問題不太可能，Kress等[14]提出的多片段組合方法得到了廣泛認可。生命條形碼聯(lián)盟建議將葉綠體基因matK、rbcL、psbA-trnH和核基因ITS作為陸地植物通用的DNA條形碼。matK基因全長約1 500 bp，是葉綠體基因組的蛋白質編碼基因中進化速率最快的基因之一，常用于分析被子植物中科級水平的系統(tǒng)關系[15-16]。其變異較為均一，在構建系統(tǒng)樹時不必對不同類型的變異進行加權，極大地增強了分子系統(tǒng)樹的可靠性[15]。rbcL基因全長約1 434 bp，進化速率較低，常用于分析遠緣屬間及科以上水平的系統(tǒng)發(fā)育問題[16]。psbA-trnH間隔序列較短，通用性好，且具有足夠變異，對近緣種有較好的識別能力。ITS片段在物種水平上變異較大，且已廣泛應用于物種分類及系統(tǒng)進化研究，但擴增成功率是ITS作為條形碼應用的一個限制因素[17-18]。

本研究采集了貴州省8個不同環(huán)境的9種薯蕷屬植物，共計31個樣本，分別對其進行了DNA條形碼3條序列的擴增。結果顯示，matK序列的變異位點占序列總長度的14.3%，psbA-trnH序列的變異位點占總長度的7.8%，rbcL序列變異位點占總長度的8.7%。相對而言，在黔產(chǎn)9種薯蕷屬植物中，matK片段顯示出較高的變異速率。由遺傳相似性分析可知，基于對matK、psbA-trnH、rbcL聯(lián)合片段的MP分析，來自9個種31份材料的薯蕷屬植物被分為周生翅組、基生翅組、頂生翅組和復葉組。其中，黃獨單獨為一組。黑珠芽薯蕷和高山薯蕷聚為一組，且該分支下黑珠芽薯蕷與高山薯蕷得到較為明顯的區(qū)分。而在周生翅組中，光葉薯蕷、薯莨和日本薯蕷及薯蕷聚為一組，且光葉薯蕷、薯莨與后兩者有較為明顯的區(qū)分，但是，日本薯蕷與薯蕷在系統(tǒng)進化樹中并未得到明顯的區(qū)分。光亮薯蕷和毛膠薯蕷聚為一組，且分支下有種間交錯現(xiàn)象。從本研究所得的系統(tǒng)進化結果來看，單純的DNA條形碼(matK、psbA-trnH、rbcL)研究可以滿足薯蕷屬下9個種絕大多數(shù)植物的鑒別，而對于毛膠薯蕷與光亮薯蕷、薯蕷與日本薯蕷等極為相近的種，需做進一步的條形碼引物篩選。

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Molecular Identification and Genetic Relationship of 9 Dioscorea Species in Guizhou Province

WEI Yibing，WEI Shenghua*，WANG Zhiwei，YAN Fulin

(Guiyang University of Chinese Medicine,Guiyang 550000,China)

In order to reveal the genetic relationship between 9 species ofDioscoreain Guizhou province,the molecular identification of the species was conducted using the sequence fragments of chloroplast genesmatK,rbcL andpsbA-trnH.The results showed that the lengths ofmatK,psbA-trnH andrbcL in 9 species ofDioscoreain Guizhou province were 1 076—1 144 bp,361—382 bp and 1 160—1 209 bp.When the vacancy was treated as deletion,the ratio of the mutation site in the total length was 14.3%,7.8% and 8.7%,respectively.Phylogenetic analysis showed that 9 species ofDioscoreaderived from the 31 provenances were divided into four groups.Among them,DioscoreabulbiferaL.belonged to the cluster of Sect.Opsophyton Uline.DioscoreamelanophymaPrain et Burkill andDioscoreahenryi(Prain et Burkill) C.T.Ting belonged to the cluster of Sect.Lasiophyton Uline.DioscoreasubcalvaPrain et Burkill andDioscoreanitensPrain et Burkill belonged to the cluster of Sect.Shannicorea Prainet Burkill.DioscoreaglabraRoxb.,DioscoreacirrhosaLour.,DioscoreajaponicaThunb.andDioscoreaoppositaThunb.belonged to the cluster of Sect.Enantiophyllum Uline.The results show thatmatK,rbcL andpsbA-trnH have obvious guidance for systematic classification ofDioscorea.

Dioscorea； DNA barcode；matK；rbcL；psbA-trnH

S567.23+9

A

1004-3268(2017)11-0108-05

2017-05-08

國家中醫(yī)藥管理局項目

魏怡冰(1994-)，女，河北趙縣人，在讀碩士研究生，研究方向：中藥與民族藥品質鑒定。

E-mail:1530112096@qq.com

*

魏升華(1965-)，男，貴州黔西人，教授，主要從事藥用植物資源、引種馴化、中藥材生產(chǎn)與民族醫(yī)藥開發(fā)等教學和研究。E-mail:weishenghua6512@126.com