曹世娜，孫 強(qiáng)，黃紀(jì)念，高錦鴻

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，河南 鄭州 450002)

芝麻脂肪氧化酶活性測定

曹世娜，孫 強(qiáng)*，黃紀(jì)念，高錦鴻

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，河南 鄭州 450002)

為了明確芝麻脂肪氧化酶活性測定的適宜條件，采用紫外分光光度法測定芝麻脂肪氧化酶的活性并對測定的適宜條件進(jìn)行探討。結(jié)果表明，芝麻脂肪氧化酶活性測定的最佳反應(yīng)條件為：取2.95 mL 0.05 mol/L的磷酸緩沖液(pH值6.2)、20 μL 10 mmol/L的底物亞油酸鈉、50 μL酶液迅速混勻后，立即在紫外光234 nm處觀察OD值的變化，最適檢測反應(yīng)時(shí)間為0～1.5 min。將吸光度代入公式計(jì)算酶活性。此外，芝麻脂肪氧化酶活性隨酶液保存時(shí)間的延長而下降，應(yīng)將酶液保存在4 ℃條件下并于1 h內(nèi)進(jìn)行測定。酶液添加量為10～50 μL時(shí)，酶活力(y)與酶液添加量(x)成正比，y=0.084 6x+5.858，且線性關(guān)系良好(R2=0.999 8)。精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示RSD為0.027%，建立的方法方便快捷，穩(wěn)定性好，可廣泛使用。

芝麻； 脂肪氧化酶； 活性測定； 紫外分光光度法

脂肪氧化酶(LOX)在動(dòng)植物界廣泛存在[1]，現(xiàn)有研究表明，LOX與動(dòng)植物生長發(fā)育、衰老、抵抗有害生物和傷害的反應(yīng)有關(guān)[2-4]。目前，LOX活性的檢測方法主要有紫外分光光度法[5-6]、顯色法[7]、單克隆抗體檢測法[8]、氧電極法[9]和量壓法[10]，其中最為簡易和常用的方法是紫外分光光度法。其原理為：LOX能使催化底物亞油酸氧化形成具有共軛雙鍵的過氧化氫衍生物，反應(yīng)體系在234 nm波長處有吸收峰，通過吸光度可以推算出LOX活性[11]。研究表明，利用紫外分光光度法測定LOX活性的一個(gè)重要前提是底物溶液的透明度[12]，反應(yīng)溫度、反應(yīng)底物濃度和反應(yīng)緩沖體系的pH值等多種因素均會影響測定結(jié)果[13]。

芝麻是我國主要的油料作物之一，具有較高的應(yīng)用價(jià)值，其種子含油量高達(dá)55%。芝麻儲存不當(dāng)容易走油、生蟲。LOX是油料脂肪代謝途徑中的關(guān)鍵酶[14-15]，能催化油料中不飽和脂肪酸氧化，產(chǎn)生醛、酮等有害物質(zhì)，對油料的儲藏[16-18]、加工[19]和種子發(fā)芽率[17]都有重要影響。為了延長芝麻的保質(zhì)期，通常用熱處理的方式來鈍化芝麻中的LOX，但過高的加熱溫度與過長的加熱時(shí)間會導(dǎo)致芝麻中其他營養(yǎng)成分的損失，降低營養(yǎng)價(jià)值。因此，探索適當(dāng)?shù)募訜釡囟群图訜釙r(shí)間是高效鈍化芝麻LOX的關(guān)鍵，在此過程中，及時(shí)準(zhǔn)確地測定芝麻LOX的活性尤為重要。相對于大豆和花生，芝麻LOX活性的測定研究鮮有報(bào)道。鑒于此，采用紫外分光光度法對芝麻LOX活性的測定條件進(jìn)行了探討，并重點(diǎn)對pH值、磷酸緩沖液的濃度、酶液用量、酶的反應(yīng)速度及酶液的保存時(shí)間進(jìn)行了詳細(xì)地分析，旨在為準(zhǔn)確快速地測定芝麻LOX活性提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器有TGL 20M-Ⅱ臺式高速冷凍離心機(jī)、JP0540超聲波萃取器、UV-6300型紫外可見分光光度計(jì)、MTN-2800D氮吹濃縮裝置、XK96-B快速混勻器；主要試劑有氫氧化鈉(分析純)、鹽酸(分析純)、亞油酸、磷酸二氫鈉(分析純)、磷酸氫二鈉(分析純)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶液的制備 將1 g完整的芝麻粉碎，加入20 mL Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH值7.0)，超聲提取15 min，于4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，取上清液放入4 ℃冰箱備用。

1.2.2 底物(亞油酸鈉，10 mmol/L)的制備 準(zhǔn)確稱取140 mg亞油酸和140 mg吐溫20，加入8 mL脫氧蒸餾水，在試管中反復(fù)振蕩使其均勻，避免產(chǎn)生氣泡。加入0.5 mol/L的NaOH溶液1.1 mL后溶液變澄清，移入50 mL容量瓶中用脫氧水定容，分裝在2 mL左右的帶螺旋蓋的小瓶中，擰蓋前沖入氮?dú)猓?8 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 芝麻LOX活性的測定 采用UV-6300紫外可見分光光度計(jì)測定芝麻LOX活性，設(shè)定檢測波長234 nm，檢測時(shí)間為75 s，間隔15 s記錄一次數(shù)據(jù)，重復(fù)5次取平均值，吸光度代入公式計(jì)算LOX活性。參比液：磷酸緩沖液2.95 mL、10 mmol/L亞油酸鈉溶液20 μL、鈍化處理的酶液50 μL，迅速混合均勻后放入分光光度計(jì)中歸零；反應(yīng)液：磷酸緩沖液2.95 mL、10 mmol/L亞油酸鈉溶液20 μL、酶液50 μL，迅速混合均勻后放入分光光度計(jì)中讀數(shù)并記錄。

1.2.4 芝麻LOX活性計(jì)算 按照公式A=4×(OD75 s-OD0 s)/5/0.01計(jì)算芝麻LOX活性。式中，A為LOX的活性單位數(shù)(U)；OD75 s為反應(yīng)75 s的吸光值；OD0 s為反應(yīng)剛開始時(shí)的吸光值；0.01為常數(shù)，以每分鐘增加0.01吸光值所需要的活性作為芝麻LOX的一個(gè)活性單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對芝麻LOX活性的影響

測定芝麻LOX活性時(shí)，反應(yīng)體系的pH值直接影響測定的靈敏性和準(zhǔn)確性[20]。分別配制pH值為5.0、5.4、5.8、6.2、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，濃度為0.1、0.2 mol/L的磷酸緩沖液，然后分別取2.95 mL磷酸緩沖液、20 μL 10 mmol/L的底物(亞油酸鈉)溶液和50 μL芝麻酶液，混合均勻后測定吸光值，根據(jù)吸光值計(jì)算芝麻的LOX活性。

由圖1可見，磷酸緩沖液的濃度分別為0.1、0.2 mol/L時(shí)，反應(yīng)體系中LOX活性的變化基本相同：在pH值為5.0～5.8時(shí)，LOX活性先稍微下降，而后又快速上升，在pH值為6.2時(shí)達(dá)到最大值，之后快速下降。當(dāng)pH值為5時(shí)，0.1、0.2 mol/L的磷酸緩沖液中LOX活性分別為4.32、4.48 U；當(dāng)pH值為6.2時(shí)，0.1、0.2 mol/L的磷酸緩沖液中LOX活性分別為9.44、8.80 U。因此，選用pH值為6.2的磷酸緩沖液作為酶反應(yīng)體系。

圖1 pH值與芝麻LOX活性的關(guān)系

2.2 磷酸緩沖液濃度對芝麻LOX活性的影響

分別以pH值為5.0、6.2，濃度為0.05、0.10、0.20 mol/L的磷酸緩沖液作為反應(yīng)體系測定芝麻LOX活性。由表1可見，pH值為5.0條件下，磷酸緩沖液濃度為0.20 mol/L時(shí)LOX活性最大；pH值為6.2條件下，磷酸緩沖液濃度為0.05 mol/L時(shí)測得的LOX活性最大，比pH值為5.0時(shí)高5.88 U。因此，選用0.05 mol/L磷酸緩沖液作為酶反應(yīng)體系。

表1 不同濃度與不同pH值磷酸緩沖液中芝麻LOX活性 U

2.3 酶液用量對芝麻LOX活性的影響

用2.95 mL磷酸緩沖液(0.05 mol/L，pH值6.2)與20 μL底物混合均勻，然后分別取10～90 μL酶液，測定LOX活性，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)酶液添加量為10～50 μL時(shí)，LOX活性隨酶液添加量的增加而不斷增大，呈明顯的線性關(guān)系[酶活力(y)與酶液添加量(x)成正比:y=0.084 6x+5.858，且線性關(guān)系良好(R2=0.999 8)，圖3]。因此，在本試驗(yàn)方法中，測定芝麻LOX活性時(shí)，酶液用量選定為50 μL比較合適。

圖2 酶液添加量與LOX活性的關(guān)系

圖3 酶液添加量與LOX活性的線性關(guān)系

2.4 反應(yīng)時(shí)間對芝麻LOX活性的影響

選用濃度為0.05 mol/L、pH值為6.2的磷酸緩沖液，以50 μL酶液添加量為試驗(yàn)條件，監(jiān)測吸光度值的變化，結(jié)果如圖4所示。在0～1.5 min，酶反應(yīng)速度非常快；1.5 min以后，酶反應(yīng)速度隨反應(yīng)時(shí)間的增加而緩慢增長。根據(jù)圖4可知，測定時(shí)宜取0～1.5 min的平均反應(yīng)速度來反映芝麻的LOX活性。

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間的酶反應(yīng)速度

2.5 酶液保存時(shí)間對芝麻LOX活性的影響

酶液提取后置于4 ℃條件下，分別保存1、2、3、4、5、6 h后測定LOX活性，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，LOX活性隨酶液保存時(shí)間的延長明顯降低，保存3 h后，LOX活性已經(jīng)降低1/2，說明酶液提取后LOX活性較難保持，因此，測定LOX活性應(yīng)在酶液提取后(4 ℃條件下保存)1 h內(nèi)進(jìn)行。

圖5 酶液保存時(shí)間與LOX活性的關(guān)系

2.6 精密度試驗(yàn)結(jié)果

取2.95 mL pH值為6.2、濃度為0.05 mol/L的磷酸緩沖液與20 μL亞油酸鈉溶液混合后，快速加入50 μL酶液并混合均勻，在234 nm處觀察OD值，測定LOX活性。對樣品做了3次平行，平行1的LOX活性分別是9.72 U和9.68 U，均值為9.72 U；平行2的LOX活性分別是9.44 U和9.20 U，均值為9.32 U；平行3的LOX活性分別是9.52 U和10.08 U，均值為9.80 U。3次平行的平均值為9.61 U，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差較小(0.26)，方法可靠性較高，RSD為0.027%。

3 結(jié)論與討論

芝麻中粗脂肪含量在50%以上，LOX活性的大小與芝麻耐儲藏性、產(chǎn)品風(fēng)味及其產(chǎn)品保質(zhì)期有直接聯(lián)系。這是因?yàn)?，LOX是一類含非血紅素鐵的蛋白酶家族，主要通過催化多元不飽和脂肪酸發(fā)生雙加氧反應(yīng)生成脂肪酸氫過氧化物，再經(jīng)一系列不同酶的作用，最終生成具有一定生理功能的小分子醛、醇和酮等代謝產(chǎn)物，從而對芝麻耐儲藏性、產(chǎn)品風(fēng)味及其產(chǎn)品保質(zhì)期產(chǎn)生直接影響。因此急需建立一種高效、準(zhǔn)確的芝麻LOX活性測定方法，以有效監(jiān)測芝麻及其制品在儲藏過程中品質(zhì)的變化。本研究采用分光光度法，探討了芝麻LOX活性測定的適宜條件，結(jié)果顯示，芝麻LOX活性測定的優(yōu)化條件為：磷酸緩沖液濃度為0.05 mol/L，pH值6.2；酶液用量50 μL；最適檢測反應(yīng)時(shí)間為0～1.5 min。此外，芝麻LOX活性隨酶液保存時(shí)間的延長而下降，應(yīng)將酶液保存在4 ℃條件下，并于1 h內(nèi)測定。在優(yōu)化條件下，酶液添加量為10～50 μL時(shí)，酶活力(y)與酶液添加量(x)成正比:y=0.084 6x+5.858，且線性關(guān)系良好(R2=0.999 8)。精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示RSD為0.027%，該方法方便快捷，穩(wěn)定性好，可廣泛使用。

[1] Salzmann V.Pentane formation during the anaerobic reactions of reticulocyte lipoxygenase:Comparison with lipoxygenases from soybeans and green pea seeds[J].Biochimica et Biophysica Acta,1984,795(3):535-542.

[2] Hildebrand D F.Lipoxygenases[J].Physiologia Plantarum,1989,76(2):249-253.

[3] 王海濱.植物的脂肪氧化酶[J].植物生理學(xué)通訊,1990(2):63-67.

[4] Suzuki Y,Yasui T,Matsukura U.Oxidative stability of bran lipids from rice variety[Oryzasativa(L.)] lacking lipoxygenase-3 in seeds[J].J Agric Food Chem,1996,44(11):3479-3483.

[5] Siddiqi A M,Al-Obaidy H M.Properties of broad bean lipoxygenase[J].Journal of Food Science,1981,46(2):622-625.

[6] 侯美玲,苗華榮,陳靜,等.花生種子脂肪氧化酶的活性測定研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(32):14033-14035.

[7] Hammond E G,Duvick D N,Fehr W R,etal.Rapid screening techniques for lipoxygenases in soybean seeds[J].Crop Sci,1992,32(3):820-821.

[8] Suzuki Y,Higo K,Hagiwara K,etal.Production and use of monoclonal-antibodies against rice embryo lipoxygenase-3[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1992,56(4):678-679.

[9] Galliard T,Phillips D R.Lipoxygenase from potato tubers[J].Biochemical Journal,1971,124(2):431-438.

[10] 鐘芳,王璋,許時(shí)嬰.3種脂肪氧合酶酶活測定方法[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào),2001,20(1):77-78,91.

[11] Schewe T,Weisner R,Rapoport S.Methods in enzymology[M].New York:Academic Press,1981,71:430-441.

[12] Rao H P,Kumar G V. Studies on stabilization of wheat-germ[J].Lebensmittel-Wissen-schaft and Technologie,1980,13(6):302-307.

[13] G?kmen V,Bah?eci S,Acar J.Characterization of crude lipoxygenase extract from green pea using a modified spectrophotometric method[J].European Food Research and Technology,2002,215(1):42-45.

[14] 左進(jìn)華,董海洲.大豆脂肪氧化酶研究現(xiàn)狀[J].糧食與油脂,2007(9):1-3．

[15] 高山,張瑛,宋美,等.水稻脂肪氧化酶研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,33(1):126-127,141.

[16] 蔣家月,宋美,吳躍進(jìn),等.水稻種胚脂肪氧化酶Lox-1,Lox-2缺失對種子儲藏特性的影響[J].激光生物學(xué)報(bào),2008,17(3):395-399.

[17] 張瑛,吳躍進(jìn),盧義宣,等.脂肪氧化酶同功酶缺失對水稻耐儲藏特性的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,31(6):911-913.

[18] 高奇,吳洪義,張瑛,等.花生種子LOX3活力測定及其對儲藏特性的影響[J].中國油料作物學(xué)報(bào),2012(4):384-389.

[19] 麻浩,官春云.大豆種子脂肪氧化酶與豆制品產(chǎn)生豆腥味關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中國油料作物學(xué)報(bào),1999,21(2):73-76.

[20] Droillard M J,Rouet-Mayer M A,Bureau J M,etal.Membrane-associated and soluble lipoxygenase isoforms in tomato pericarp[J].Physiologia Plantarum,1993,103(4):1211-1219.

A Spectrophotometric Method for Determining the Activity of Lipoxygenase in Sesame

CAO Shina,SUN Qiang*,HUANG Jinian,GAO Jinhong

(Institute of Agricultural Products Processing,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

In order to ascertain the suitable conditions for the determination of lipoxygenase activity in sesame,the activity of lipoxygenase in sesame was determined by ultraviolet spectrophotometry and the measured conditions were discussed.The results showed that the optimal reaction conditions were as follows: 2.95 mL of phosphate buffer (0.05 mol/L,pH 6.2),20 μL of sodium linoleate (10 mmol/L) as the substrate,and 50 μL of enzyme solution.Blend them quickly and immediately observe the change of OD value at 234 nm UV light.The optimal reaction time was 0—1.5 min.The enzyme activity was calculated using the equation according to the absorbance value.In addition,the activity of lipoxygenase in sesame decreased with the elongation of the storage time of the enzyme solution,which should be kept at 4 ℃ and measured within 1 h.When the added volume of the enzyme solution was between 10—50 μL,the enzymatic activity(y) was in direct proportion to the enzyme volume(x),y=0.084 6x+5.858,and the linear relationship was good (R2= 0.999 8).The results of the precision test showed that theRSDwas 0.027%,and the established method was convenient,stable and suitable for wide application.

sesame; lipoxygenase; activity determination; UV spectrophotometry

S565.3

A

1004-3268(2017)11-0048-04

2017-07-17

公益性行業(yè)( 農(nóng)業(yè)) 科研專項(xiàng)(201303072)

曹世娜(1983-)，女，河南南樂人，中級工程師，碩士，主要從事油料加工研究。E-mail:407452454@qq.com

*通訊作者：孫 強(qiáng)(1973-)，男，河南信陽人，副研究員，碩士，主要從事油料加工與副產(chǎn)物綜合利用研究。

E-mail:qiangsunxy@126.com