韓娟英 何曦 蔣宙蕾 梅沙 張寧* 吳殿星

（1 余姚市種子管理站，浙江余姚315400；2 浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)院，杭州310058；第一作者：1293288389@qq.com；* 通訊作者：11216028@zju.edu.cn）

富含葉酸水稻研究進展

韓娟英1何曦2蔣宙蕾2梅沙2張寧2*吳殿星2

（1余姚市種子管理站，浙江余姚315400；2浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)院，杭州310058；第一作者：1293288389@qq.com；*通訊作者：11216028@zju.edu.cn）

葉酸缺乏是世界性的公共健康問題，嚴(yán)重影響人類健康。水稻是世界第一大主糧，也是我國大部分人日常能量攝入的主要來源。但是水稻籽粒中葉酸含量極低，因此，通過提高水稻的葉酸含量將有助于解決我國以及全球許多以水稻為主糧的國家和地區(qū)的葉酸缺乏問題。本文介紹了葉酸的結(jié)構(gòu)、在生物中的生理功能及葉酸缺乏帶來的影響，闡述了葉酸在植物體內(nèi)生物合成的途徑，以及目前水稻葉酸強化的研究進展。

水稻；葉酸；葉酸代謝；生物強化

葉酸（Folates）系一種水溶性B族維生素，又稱VB11或VB9，化學(xué)名蝶酰谷氨酸（Pteroylglutamic acid,PGA），是四氫葉酸（Tetrahydrofolate,THF）及其系列衍生物的總稱。葉酸是生物體內(nèi)轉(zhuǎn)移甲基、甲?；⒓紫┗?、次甲基以及羥甲基等“一碳基團”過程中的重要輔酶，在嘌呤、胸苷酸、DNA、氨基酸和蛋白質(zhì)的生物合成與甲基循環(huán)等諸多反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。

葉酸是人體不可或缺的微營養(yǎng)，人體自身不能合成，只能通過膳食補充，缺乏可導(dǎo)致巨幼紅細胞貧血、胎兒畸形、胎兒神經(jīng)管發(fā)育缺陷、妊娠高血壓綜合癥等生理代謝疾病。無論是發(fā)達國家還是發(fā)展中國家均存在葉酸攝入不足的情況，我國北方是葉酸重缺乏區(qū)[1]。

水稻是我國及世界重要的主糧，但其籽粒中的葉酸含量極低，無法滿足人體的葉酸需求而易引起葉酸缺乏。目前，水稻葉酸的生物強化主要采取兩種策略：通過加強葉酸合成通路中關(guān)鍵酶的表達量提高葉酸的絕對含量或通過葉酸結(jié)合蛋白（Folate binding protein,FBP）來提高葉酸的穩(wěn)定性。

1 葉酸的生理功能

作為一碳單位轉(zhuǎn)移酶系的輔酶，葉酸參與體內(nèi)嘌呤和胸腺嘧啶的合成，參與氨基酸代謝、血紅蛋白及腎上腺素、膽堿、肌酸等甲基化合物的合成，對細胞的分裂生長和核酸、氨基酸與蛋白質(zhì)的合成起重要的作用。葉酸的缺乏使S-腺苷甲硫氨酸的合成受阻，導(dǎo)致胞嘧啶不能甲基化，從而造成全基因組甲基化程度低，最終導(dǎo)致原癌基因的激活和染色體的不穩(wěn)定。同時，葉酸的缺乏還導(dǎo)致腺苷和嘌呤合成不足進而影響到DNA的修復(fù)。人體缺乏葉酸可導(dǎo)致血紅球的異常、未成熟細胞的增加、貧血及白血球減少。據(jù)統(tǒng)計，全球由葉酸缺乏而引起的貧血高達30%，僅次于缺鐵而導(dǎo)致的貧血[2]。

葉酸是胎兒發(fā)育不可缺少的營養(yǎng)素，對孕婦尤其重要。孕婦缺乏葉酸可能會導(dǎo)致胎兒出生時出現(xiàn)低體重、唇腭裂、心臟缺陷等，且孕早期缺乏葉酸可以引起胎兒畸形、胎兒神經(jīng)管缺陷而導(dǎo)致畸形。已有研究表明，葉酸攝入水平不足可以導(dǎo)致巨幼紅細胞貧血、胎兒神經(jīng)管缺陷、增加患心血管疾病和直腸癌等消化道癌癥的風(fēng)險，且低水平的葉酸攝入與老年癡呆癥的發(fā)生密切相關(guān)[3-6]。神經(jīng)管缺陷是一種常見的先天性畸形之一，由于在胚胎發(fā)育的第26～28 d神經(jīng)管未閉合而造成的頭部至脊柱部位從無腦到輕度脊柱裂等不同程度的畸形。全球每年約有25萬新生兒患病，發(fā)病率達0.5‰～2.0‰。我國是神經(jīng)管畸形的高發(fā)區(qū)，發(fā)病率約為2.74‰。Daly等[3]研究表明，在懷孕前每天服用 400 μg葉酸，可以降低70%的神經(jīng)管缺陷的發(fā)生機率。Daly等[7]深入研究表明，如果堅持食用強化食物每天補充200 μg或100 μg葉酸，能預(yù)防幾乎所有可用葉酸預(yù)防的神經(jīng)管缺陷，而Scott等[8]認(rèn)為最佳的情況是每天補充400 μg 葉酸。

葉酸缺乏能引起高同型半胱氨酸血癥，從而增加患心血管病的風(fēng)險[9-10]。越來越多的流行病學(xué)、實驗和臨床證據(jù)表明，人體內(nèi)適宜的葉酸水平可以降低心血管疾病的發(fā)生，其作用機制包括3個方面：（1）充足的葉酸攝取能夠增加血管內(nèi)皮細胞NO的濃度，達到保護血管的作用；（2）葉酸具有預(yù)防高脂負(fù)荷誘導(dǎo)的高脂血癥發(fā)生的作用；（3）葉酸缺乏會引起同型半胱氨酸水平的增加，體內(nèi)葉酸的缺乏和高同型半胱氨酸血癥會改變DNA合成和甲基化修飾，從而抑制血管內(nèi)皮細胞的生長。

葉酸的缺乏還會導(dǎo)致阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病，提高冠狀動脈和心血管疾病的風(fēng)險，同時也與一系列癌癥如白血病、結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌、胰腺和支氣管癌等有關(guān)[11]。

圖1 植物體內(nèi)葉酸的生物合成途徑及轉(zhuǎn)運步驟（引自Bekaert等[17]；Hanson and Gregory III[18]）

2 葉酸缺乏現(xiàn)狀與強化措施

我國約20%的人葉酸攝入量不足，尤其是我國北方和西北部地區(qū)葉酸攝入量嚴(yán)重不足，每年約有1.8萬幼兒患有神經(jīng)管缺陷。Li等[12]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，山西省的新生兒神經(jīng)管缺陷發(fā)病率世界最高，部分年份高達14.9‰，其中60%是由葉酸缺乏引起。De Steur等[13]實行強化面粉項目的研究表明，山西省的神經(jīng)管缺陷兒高發(fā)地區(qū)能夠通過面粉強化達到降低和預(yù)防的效果。

隨著人們認(rèn)識的不斷深化，在膳食中補充葉酸逐漸被重視。盡管許多食物中含有葉酸，但因葉酸對光和熱具有不穩(wěn)定性，容易失活，所以人體能從食物中真正獲得的葉酸并不多。營養(yǎng)不良或一些吸收不良綜合癥，如胃切除術(shù)造成不充分吸收、因妊娠需求量的增加或因使用了一些干擾葉酸吸收的藥物等，均可導(dǎo)致葉酸的缺乏。

采取在食品中添加人工合成葉酸和口服補充葉酸含片的措施，已成為改善人們?nèi)~酸攝入狀況的有效方法。有研究表明，實行面粉強化葉酸規(guī)定后，神經(jīng)管缺陷新生兒的發(fā)病率分別減少了26%、42%和40%[14-16]。但對居住在貧窮和偏遠地區(qū)的發(fā)展中國家人群來說，該方法尚難以推廣。

3 葉酸的生物合成及水稻中相關(guān)基因

3.1 葉酸的生物合成

葉酸分子結(jié)構(gòu)由喋啶（Pteridine）、苯基甲酸（PABA）和谷氨酰胺（Glutamate）三部分組成，其生物合成途徑較為保守，分別由葉酸的三部分合成并組裝，見圖1。各種生物的不同之處在于，細菌的葉酸合成過程發(fā)生在細胞質(zhì)中，而植物中葉酸三個部分的合成分別發(fā)生于質(zhì)體、線粒體和細胞質(zhì)中。喋啶部分由質(zhì)體中的三磷酸鳥苷（GTP）合成而來，PABA部分則由質(zhì)體中分支酸鹽轉(zhuǎn)化而來。喋啶和PABA之后被轉(zhuǎn)運至線粒體，被還原成單谷氨酸的四氫葉酸。在多聚谷氨酸酶的催化下四氫葉酸的谷氨酸γ位連上多個谷氨酸殘基，成為具有多聚谷氨酸尾的葉酸。葉酸也分布于植物液泡中，培養(yǎng)基中的葉酸可直接被植物細胞吸收。葉酸的細胞膜間分布需要大量的轉(zhuǎn)運過程，絕大多數(shù)的轉(zhuǎn)運過程需要載體介導(dǎo)，而疏水性弱酸PABA可以通過擴散直接跨細胞膜進行轉(zhuǎn)運。目前，唯一已知的植物葉酸轉(zhuǎn)運載體位于質(zhì)體上，因此至少還有3個葉酸轉(zhuǎn)運載體（線粒體、液泡和質(zhì)膜）和線粒體喋啶轉(zhuǎn)運載體有待發(fā)現(xiàn)。轉(zhuǎn)運載體的發(fā)現(xiàn)，有利于通過基因編輯技術(shù)從代謝途徑層面提高葉酸的含量。

3.2 水稻中葉酸的生物合成途徑相關(guān)基因

水稻的全基因組測序已在2002年完成，通過與已被鑒定的擬南芥等植物葉酸合成途徑的各種酶的同源比對分析，水稻的整個葉酸合成過程中參與酶及其基因都已經(jīng)清楚，匯總見表1。這些基因編碼了GTPCHI、DHNA、ADCS、ADCL 等蛋白，分布在胞質(zhì)、葉綠體、線粒體和液泡等不同細胞器中。水稻中的大多數(shù)葉酸合成酶的預(yù)測定位與擬南芥中的同源蛋白相同。首先在蝶啶合成途徑中，水稻中有一個編碼GTPCH1蛋白的基因位于第4染色體上，與擬南芥GTPCH1基因（AT3G07270）具66.2%的同源性，且都定位于細胞質(zhì)中。與擬南芥一樣，共有3個編碼DHNA蛋白的基因在水稻中被發(fā)現(xiàn)，它們可能在不同的器官或組織、不同的發(fā)育階段或是不同的環(huán)境條件下起作用。其次，在苯基甲酸合成途徑中，編碼ADCS和ADCL的基因在擬南芥和水稻中高度保守，定位于質(zhì)體上，但是水稻中有2個編碼ADCL的基因分別位于第2號和第5號染色體上，而擬南芥中只有1個。再次，在THF合成途徑中，水稻中的HHPK/DHPS和DHFS分別由單個基因編碼，且都含有線粒體信號肽，但擬南芥中分別有2個基因編碼HHPK/DHPS和DHFS，且定位于胞質(zhì)和線粒體中。擬南芥中分別有3個基因編碼DHFP和FPGS，且定位于質(zhì)體、線粒體和胞質(zhì)中，而水稻分別有2個基因編碼這2個酶，因為不含信號肽，都被預(yù)測定位于胞質(zhì)中。最后，在葉酸的組裝途徑中，擬南芥中有3個編碼GGH的基因，而水稻中僅有1個，但都定位于液泡中。葉酸的合成機制在植物中高度保守，對其中相關(guān)基因的深入研究將會為提高水稻中的葉酸含量提供更多理論基礎(chǔ)。

表1 水稻中葉酸生物合成途徑的相關(guān)基因

4 水稻中葉酸的生物強化

4.1 水稻中的葉酸含量

水稻中的葉酸含量極低且在儲存過程中極易損耗[20]，蒸煮過程中也會損失26%[21]。即便是我國糙米中葉酸含量高達26.3 μg/100 g的水稻品種朝陽早18、特青、大白谷13和青豐矮，精加工中也會喪失95%，經(jīng)蒸煮后又會進一步損失近50%，遠遠無法達到國際推薦成人每日葉酸攝入量（400 μg/日）。因此，十分必要通過水稻育種強化葉酸含量以緩解我國葉酸缺乏的現(xiàn)狀。

Dieter等[22]分析檢測了12個不同來源水稻品種的總?cè)~酸含量，發(fā)現(xiàn)來自塞拉利昂的水稻品種Rok葉酸含量最低，為32 μg/100 g鮮質(zhì)量；來自圭亞那的水稻品種Blue Belle葉酸含量最高，為68 μg/100 g鮮質(zhì)量，其差異主要源于5-甲基四氫葉酸含量的差異。Dong等[23]分析檢測了我國78份水稻種質(zhì)資源的葉酸含量，發(fā)現(xiàn)糙米的葉酸含量存在8.4倍的變異，變異范圍為13.3～111.4 μg/100 g，糙米平均葉酸含量為 48.8 μg/100 g；精米中平均葉酸含量為24.6 μg/100 g，其葉酸含量存在 7.6 倍的變異，變異范圍為 10.3～77.7 μg/100 g；不同類型種質(zhì)劃分上，糙米中的葉酸含量秈稻比粳稻高32%，精米中秈稻比粳稻高24%。另外，稻米的蒸煮加工和儲藏都會引起葉酸含量的降低，其中參試品種儲藏2年引起的葉酸損失達19.9%～56.5%，平均每年的葉酸損失量為23.0%；蒸煮引起的葉酸損失為37.7%～68.9%，平均為48.3%。鑒于水稻品種間葉酸含量差異顯著且變幅大，為此采用傳統(tǒng)育種提高葉酸含量的空間較大。

表2 擬南芥和各種作物葉酸代謝基因工程匯總

4.2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高水稻中葉酸的含量

迄今為止，唯一提高葉酸含量的方法是轉(zhuǎn)基因過表達葉酸合成過程中的酶。提高植物中葉酸的含量可通過過表達GTP環(huán)化水解酶I（GTPCHI）和氨基脫氧分支酸合成酶（ADCS）來實現(xiàn)。單獨GTPCHI的過表達會引起蝶呤的大幅積累，單獨ADCS的過表達會引起p-ABA的大幅提高，均不會引起葉酸含量的大幅變化，只有當(dāng)兩者共同過表達才表現(xiàn)出葉酸含量的大幅提高。葉酸代謝基因工程研究匯總結(jié)果見表2。

Storozhenk等[19]將擬南芥ADCS和GCHⅠ基因分別連接到水稻胚乳特異性啟動子gluB1和glb-1下，使葉酸合成途徑中的pABA和喋呤支路均得到加強，轉(zhuǎn)基因水稻中葉酸的最高含量為1 723 μg/100 g，是野生型對照的100倍，也是迄今為止糧食作物中報道的葉酸最高含量，超過正常人群每日推薦攝取量400 μg的4倍多。提高的葉酸含量中，89%為5-甲基四氫葉酸，僅2.6%～14.0%為多谷氨酸化葉酸，而野生型中50%的葉酸為多谷氨酸化葉酸；喋啶和PABA含量分別提高4倍和25倍。在僅過表達GTPCHI的水稻株系中，未發(fā)現(xiàn)葉酸含量的提高，僅提高了25倍的喋啶含量；在僅過表達ADCS的水稻株系中，PABA含量提高了49倍同時提高了6倍的葉酸含量。在同時過表達GTPCHI和ADCS基因的水稻株系中，葉酸∶PBAB∶喋啶含量為1∶0.5∶0.013，說明在葉酸合成過程中，高 PABA 含量也是提高葉酸含量的制約因素。

Gillies等[27]將小麥HPPK/DHPS導(dǎo)入水稻，檢測表明葉片中葉酸表達增加75%，籽粒中增加40%。董薇[31]研究發(fā)現(xiàn)，分別過表達 AtGTPCHI、AtADCS、AtDHFS 和AtFPGS基因可提高水稻籽粒中的葉酸含量。在過表達AtGTPCHI的轉(zhuǎn)基因株系中，前后兩代水稻的籽粒葉酸含量分別是野生型的3.7～6.1倍和3.3～3.7倍；在過表達AtADCS的轉(zhuǎn)基因株系中，葉酸含量與野生型相比提高1.5～1.8倍。該研究結(jié)果與以往結(jié)果不同，可能是由于所用啟動子序列不同。在過表達AtDHFS的轉(zhuǎn)基因株系T1代中，葉酸含量提高14.5%～27.2%；在過表達AtFPGS的轉(zhuǎn)基因株系T1代和T2代，分別比野生型葉酸含量增加7.5%～19.9%和4.3%～45.5%。然而，轉(zhuǎn)AtDHNA和AtADCL的轉(zhuǎn)基因株系的葉酸含量下降。Blancquaert等[33]分析了水稻籽粒發(fā)育過程中葉酸、PA－BA和蝶呤的積累情況，結(jié)果表明葉酸強化水稻籽粒中GTPCHI和ADCS基因的表達不會影響其他內(nèi)源性葉酸的生物合成基因。

4.3 轉(zhuǎn)基因提高水稻中葉酸的穩(wěn)定性

葉酸結(jié)合蛋白對提高葉酸穩(wěn)定性具有顯著作用。在哺乳動物細胞中，已發(fā)現(xiàn)葉酸結(jié)合蛋白家族[34]。Jones和Nixon[35]在牛奶中發(fā)現(xiàn)了FBP。牛奶中所有的葉酸均與FBP結(jié)合。根據(jù)緩沖液體系和溫度的不同，葉酸與FBP形成的化合物將極不穩(wěn)定的四氫葉酸穩(wěn)定性提高了2～1 000倍。在4℃、pH值為6.7時四氫葉酸與可溶性FBP結(jié)合后可穩(wěn)定存在超過100 d，而對照組壽命小于1 h。目前的困境是尚未發(fā)現(xiàn)植物源的FBP。Goto等[36]通過過表達大豆儲鐵蛋白，大豆中鐵含量提高2倍。因此，在水稻中轉(zhuǎn)入FBP相關(guān)基因并過表達可能是提高水稻中葉酸穩(wěn)定性的一種較為可行的方法。

5 結(jié)語和展望

水稻是我國約60%人口的主食。普通大米尤其是經(jīng)蒸煮加工的大米葉酸含量很低，僅為3 μg/100 g，盡管通過添加人工合成的葉酸，采取食品強化葉酸增加葉酸攝入已證明是補充葉酸的有效措施，但是在偏遠地區(qū)該措施很難付諸實踐。培育高葉酸含量的水稻新品種，在葉酸缺乏地區(qū)推廣不僅是源頭膳食策略，也是更為經(jīng)濟可行的技術(shù)方案。

不同水稻種質(zhì)資源的葉酸含量檢測表明，水稻品種間葉酸含量差異顯著且變幅大，這無疑為采用傳統(tǒng)育種方法選育高葉酸水稻品種提供了巨大的空間和可能性。與此同時，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，已證明可以使稻米的葉酸含量提高20～100倍。在高葉酸水稻推廣應(yīng)用之前，有必要了解基因型、環(huán)境因素及其互作對水稻籽粒中葉酸積累的影響，并協(xié)同解決好高葉酸含量與稻米品質(zhì)、產(chǎn)量和抗性的關(guān)系。

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Progress on High Folate Content Rice

HAN Juanying1,HE Xi2,JIANG Zhoulei2,MEI Sha2,ZHANG Ning2*,WU Dianxing2
（1Yuyao Seed Administration Station,Yuyao,Zhejiang 315400,China;2College of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou,310029,China;1st author:1293288389@qq.com;*Corresponding author:11216028@zju.edu.cn）

Folates deficiency is a global public health problem,has profound effects on human health.Rice is the most important staple crops in the world,and provides most population energy intake in China.Since rice seeds contain very little folates,enhancing folates content in rice would be a cost-effective way to solve folates deficiency in China and some countries and regions where the staple crop is rice.This review introduced the structure and physiological functions of folates,and the influences of folates deficiency.The biosynthetic pathway in plant and progress in folates-biofortification rice were also reported.

rice;folates;folate metabolism;biofortification

S511

A

1006-8082（2017）06-0007-06

2017－08－07

浙江省水稻育種（2016C2050-6）