閆 妍 高 慧 呂珍蘇 陸如平 盛嘉玲

中國.上海市民政第一精神衛(wèi)生中心 201105 E-mail:yanyan19820407@163.com

非特異性精神發(fā)育遲滯患者外周血miRNA的差異表達及臨床診斷價值

閆 妍 高 慧 呂珍蘇 陸如平 盛嘉玲

中國.上海市民政第一精神衛(wèi)生中心 201105 E-mail:yanyan19820407@163.com

目的:研究非特異性精神發(fā)育遲滯患者外周血miRNA的差異表達及其診斷價值。方法:檢索國內(nèi)外文獻篩選與非特異性精神發(fā)育遲滯相關(guān)的10種miRNA,按照病歷號隨機選取30例非特異性精神發(fā)育遲滯患者作為病例組,同時按照體檢號入組30例身心健康者作為對照組,入組后抽取靜脈血5ml,運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測病例組和對照成員10種miRNAs的表達水平。結(jié)果:①病例組與對照組比較年齡、性別、城鄉(xiāng)、獨生子女無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);②病例組與對照組比較miRNA-125b、miRNA-132、miRNA-222、miRNA-223和miRNA-363表達水平有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);③ROC分析發(fā)現(xiàn),miRNA-222(AUC=0.786,P=0.043)、miRNA-223(AUC=0.833,P=0.008)對特異性精神發(fā)育遲滯有一定的診斷價值。結(jié)論:miRNA-222和miRNA-223的異常表達對非特異性精神發(fā)育遲滯有一定的診斷作用,可能與非特異性精神發(fā)育遲滯的發(fā)病機制有明顯關(guān)聯(lián)。

非特異性精神發(fā)育遲滯;微小RNA;實時熒光定量PCR;外周血

精神發(fā)育遲滯按照臨床特征可分為非特異性精神發(fā)育遲滯(non—specific MR,NSMR)和智力低下伴有畸形(Specific MR,SMR)這兩大類。SMR患者智力低下與畸形有明顯關(guān)聯(lián),NSMR只是智力低下,不伴有畸形,目前確切的病因不明。目前認為,NSMR病因復雜,與環(huán)境和遺傳基因有明顯關(guān)聯(lián),其中遺傳是最主要的因素[1-2]。MiRNA屬于內(nèi)源性非編碼RNA家族。約21～25個核苷酸長度,其基因轉(zhuǎn)錄初級產(chǎn)物(pri-miRNA)在核內(nèi)被RNaseⅢ內(nèi)切酶家族的Drosha酶切割成約70nt的發(fā)夾狀前體(pre-miRNA),轉(zhuǎn)運出核后。又被Droer酶切割成約22nt的miRNA,形成成熟miRNA。MiRNA具有較強的發(fā)育時序特異性[3]和組織特異性[4],在精神疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[5]。本研究選取30例非特異性精神發(fā)育遲滯患者和30例健康對照者進行研究,分析miRNA在非特異性精神發(fā)育遲滯患者外周血中的差異表達,并進一步分析差異表達的miRNA對非特異性精神發(fā)育遲滯的診斷價值,以期為非特異性精神發(fā)育遲滯的研究提供參考。

1 對象與方法

1.1 對象

1.1.1 病例組 為2011年9月-2012年10月確診為非特異性精神發(fā)育遲滯的患者,符合以下入組標準和排除標準。入組標準:由兩名精神學專家及心理學專家等組成的小組進行病例討論,精神發(fā)育遲滯的診斷要求符合ICD-10診斷標準,同時IQ小于60分。排除標準:①存在明確圍生期腦損傷史;②存在明確腦缺氧、缺血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染及頭顱外傷等病史;③染色體核型存在異常;④經(jīng)體檢、生化代謝及頭顱影像學檢查等發(fā)現(xiàn)已知遺傳代謝性疾病及遺傳眭神經(jīng)變性疾病線索;⑤男性患兒存在脆性x綜合征的典型臨床表現(xiàn);⑥母孕期間存在明確酗酒、吸毒等不良嗜好病史;⑦合并其他精神疾病;⑧合并其他重大軀體疾病。按照上述入組標準和排除標準入組非特異性精神發(fā)育遲滯30例。

1.1.2 對照組 為當?shù)蒯t(yī)院體檢證實為身心健康的人員。入組30例,均為漢族。

本研究獲得本院醫(yī)學倫理委員會批準,所有受試者或受試家屬(監(jiān)護人)均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 收集2 ml病人全血,放入抗凝管中。按照1:1比例,將血液緩慢加入Ficoll分離液中,2000rpm離心20min,收集單核細胞層。用PBS清洗單核細胞兩遍,加入1ml Trizol,用移液器吸打幾次。Trizol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定,不取決于細胞數(shù)。Trizol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。將勻漿樣品在室溫(15～30℃)放置5分鐘,使核酸蛋白復合物完全分離。每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿,劇烈振蕩15秒,室溫放置5分鐘。2～8℃13000×g離心15分鐘。樣品分為3層:底層為黃色有機相,上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用Trizol試劑的60%。把水相轉(zhuǎn)移到新管中,如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相,進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1m L Trizol加入0.5ml異丙醇,室溫放置10分鐘。2～8℃13000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。用100%乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml 100%乙醇。2～8℃不超過7500×g離心5分鐘,棄上清。室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大約晾5～10分鐘即可,不要真空離心干燥,過于干燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入25～200μl無RNase的水或0.5%SDS,用槍頭吸打幾次,55～60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應,勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去離子甲酰胺溶解, -70℃保存。取1μl RNA加入99μl dd H2O中,測定A260和A280處的吸光光度值,A260/A280必須介于1.9～2.0之間才可以進行逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 實時定量PCR驗證篩選的miRNA 使用TaqmanmiRNAPCRAssays進行miRNA反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測,具體操作按照試劑盒說明書進行,檢測儀器為ABI 7900 HT熒光定量PCR儀,熒光定量PCR反應條件為:95℃10 min,然后95℃15 S、60℃1 min,40個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計處理

全部數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0、MedCalc12.70統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析和作圖。以miRNA與內(nèi)參U6之間閾值環(huán)(threshold cycle,Ct)之差計算ΔCT值,作為統(tǒng)計分析的指標。對照和病例組一般情況除年齡采用獨立樣本t檢驗外,其它變量采用卡方檢驗;病例組和對照組miRNA表達水平的比較采用獨立樣本秩和檢驗,對差異表達的miRNA進一步構(gòu)建ROC曲線,分析其對特異性精神發(fā)育遲滯的診斷價值。所有統(tǒng)計分析均為雙側(cè)顯著性檢驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 病例組與對照組一般情況的描述和比較

采用獨立樣本t檢驗比較病例組和對照組年齡,結(jié)果表明,病例組和對照組的年齡無統(tǒng)計學差異(t=0.279,P=0.782);運用卡方分析比較病例組和對照組性別、城鄉(xiāng)、獨生子女的分布,結(jié)果表明,病例組和對照組的性別、城鄉(xiāng)、獨生子女分布無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

表1 病例組和對照組一般情況比較(±s,n)

表1 病例組和對照組一般情況比較(±s,n)

項 目 病例組(n=30)對照組(n=30)t/χ2P年齡(歲) 31.49±10.86 30.61±11.32 0.279 0.782性別(女/男) 18/12 14/16 0.603 0.438城鄉(xiāng)(城市/農(nóng)村) 13/17 18/12 1.068 0.301獨生子女(是/非) 16/14 13/17 0.267 0.605

2.2 特異性精神發(fā)育遲滯患者與正常人的miRNA表達水平比較

對篩選出的10種miRNA,采用兩獨立樣本的秩和檢驗分析其在病例組和對照組間的差異,表2表明,miRNA-125b、miRNA-132、miRNA-222、miRNA-223和miRNA-363的表達有統(tǒng)計學差異(P＜0.05),miRNA-1、miRNA-1207-5p、miRNA-1228-5p、miRNA-3141、miRNA-4507的表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

2.3 差異表達的miRNA對非特異性精神發(fā)育遲滯的預測價值

分別以非特異性精神發(fā)育遲滯患者外周血中差異表達的miRNA-125b、miRNA-132、miRNA-222、miRNA-223和miRNA-363為檢測變量,試驗分組為狀態(tài)變量(對照組為0,病例組為1),構(gòu)建ROC曲線,見表3和圖1。miRNA-222和miRNA-223對非特異性精神發(fā)育遲滯有一定的診斷價值(P＜0.05),miRNA-125b、miRNA-132和miRNA-363對非特異性精神發(fā)育遲滯的診斷價值不明顯(P＞0.05)。

表2 病例組與對照組miRNA表達水平比較(±s)

表2 病例組與對照組miRNA表達水平比較(±s)

miRNA 病例組(n=30)對照組(n=30)Z P miRNA-1 4.023±1.587 5.573±3.786-0.767 0.443 miRNA-125b 5.410±1.380 7.962±3.747-2.043 0.041 miRNA-132 3.485±1.382 7.084±3.590-2.155 0.031 miRNA-222 2.344±1.400 6.038±3.060-3.915＜0.001 miRNA-223 -2.686±1.406 5.147±2.653-4.086＜0.001 miRNA-363 4.124±1.273 6.655±3.161-2.383 0.017 miRNA-1207-5p-0.218±0.116 1.240±0.247-1.873 0.061 miRNA-1228-5p-1.336±0.211-1.397±0.838 0.000 1.000 miRNA-3141 0.113±0.350 0.223±0.900 0.000 1.000 miRNA-4507 1.295±0.795 2.625±1.413-0.511 0.610

表3 差異表達的miRNA對非特異性精神發(fā)育遲滯的預測價值

圖1 非特異性精神發(fā)育遲滯患者外周血差異表達miRNA的ROC曲線

3 討 論

精神發(fā)育遲滯(mental retardation,MR)是一組在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟(18歲)以前起病,依據(jù)目前研究發(fā)現(xiàn)生物、社會和心理因素是造成患者智力發(fā)育低于一般常人的主要因素,其中生物因素占79.2%[6]。MR是造成我國耳洞殘疾的首要影響因素,該疾病不僅對我國人口素質(zhì)提高不利,還給家庭、社會、國家?guī)沓林氐呢摀?。非特異性精神發(fā)育遲滯(NSMR)又稱非特異性弱質(zhì),是指不伴隨其它臨床體征的單純性智力低下。對NSM的患病程度進行過分析發(fā)現(xiàn),NSMR存在著明顯的遺傳異質(zhì)性,遺傳占主要因素[7]。

miRNA在生物的各種生命過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能,如調(diào)節(jié)細胞發(fā)育的時序調(diào)控過程,參與細胞增殖、分化和凋亡,同時在造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的模式形成等過程中也扮演著重要的角色。miRNA在腦皮層發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用,大腦皮層發(fā)育過程中細胞增殖、傳導通路的建立以及區(qū)域性分化均有miRNA參與并調(diào)控[8-9]。由此可見,miRNA在大腦發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。miRNA與神經(jīng)細胞的分化也有著密切相關(guān),miRNA可以從細胞分化的起始就調(diào)控祖細胞分化為特定的神經(jīng)細胞,還能維持該神經(jīng)細胞的特征。有研究表明,miRNA不僅參與多種神經(jīng)功能調(diào)節(jié)[10],還與突觸可塑性有關(guān)[11]。由于MiRNA在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分化以及神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)和突觸可塑性方面起著重要作用,因此MiRNA表達和調(diào)控的異?？赡芘c精神發(fā)育遲滯的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關(guān)系。脆性x綜合征與脆性X智力低下蛋白(FMXP, Fragile X MentalRetardation Protein)的缺失有明顯關(guān)聯(lián),外周血淋巴細胞FMRP免疫細胞化學檢測是兒童脆性X綜合征的一種可靠診斷和篩查方法[12]。研究發(fā)現(xiàn),FMRP可以通過某些特殊的m RNAS來調(diào)節(jié)miRNA[13],如miRNA-1和miRNA -281。唐氏綜合征即21三體綜合征,對唐氏綜合征的研究發(fā)現(xiàn),與21號染色體來源有明顯關(guān)聯(lián)的miRNAs可能引起患者腦部神經(jīng)生化的異常,21號染色體來源的miRNA失活可能是導致唐氏綜合癥的主要原因[14]。

本研究發(fā)現(xiàn),非特異性精神發(fā)育遲滯患者外周血中的表達有統(tǒng)計學差異,在非特異性精神發(fā)育遲滯患者外周血中miRNA-125b、miRNA-132、miRNA-222、miRNA-223和miRNA-363顯著上調(diào)。這5種miRNA與非特異性精神發(fā)育遲滯的發(fā)生和發(fā)展可能有明顯關(guān)聯(lián)。有研究發(fā)現(xiàn),脆性X智力低下蛋白(FMRP)可以通過miRNA-125b、miRNA-132調(diào)節(jié)突觸的結(jié)構(gòu)與精神發(fā)育遲滯的發(fā)生有明顯關(guān)聯(lián)[15]。Chen等人選取464名非特異性X連鎖精神發(fā)育遲滯患者進行研究發(fā)現(xiàn),與正常對照者比較x染色體相關(guān)聯(lián)miRNAs(miRNA-222、miRNA-223和miRNA-363)的核苷酸序列有明顯改變,這些改變可能與患者智力低下有關(guān)[16]。趙林[17]等人,通過miRNA芯片掃描和選取部分差異表達的miRNA進行PCR驗證發(fā)現(xiàn),非特異性精神發(fā)育遲滯患者外周血中miRNA-664a-5p,miRNA-1207-5p,miRNA-3141,miRNA-1228-5p,miRNA-4505顯著上調(diào)。本研究與正常對照者比較,非特異性精神發(fā)育遲滯患者外周血中miRNA-1207-5p,miRNA-3141和miRNA -1228-5p沒有明顯改變,可能與本研究選取的樣本是成人,而上述研究選取的是兒童有關(guān),具體機制有待進一步研究。

為了探究差異表達的miRNA對非特異性精神發(fā)育遲滯的診斷價值,本研究進一步構(gòu)建ROC曲線,結(jié)果發(fā)現(xiàn):miRNA-222和miRNA-223對非特異性精神發(fā)育遲滯有一定的診斷價值,當miRNA-222≤2.788CT時,約登指數(shù)的最大值0.583,此時的敏感度為58.3%,特異度為100.0%;當miRNA-223≤-2.275CT時,約登指數(shù)的最大值0.667,此時的為敏感度66.7%,特異度為100.0%。該研究結(jié)果進一步證實了,miRNA-222和miRNA-223在非特異性精神發(fā)育遲滯中可能扮演著重要的角色,具體作用機制有待進一步研究。

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http://www.cjhp.com.cn/

The Differential Expression of MiRNA in Peripheral Blood of Patients with Non-specific Mental Retardation and Its Clinical Diagnostic Value

YAN Yan,GAO Hui,LV Zhensu,et al
First Mental Health Center of Shanghai Civil Ddministration,Shanghai 201105,China

Objective:To research the differential expression of miRNA in the peripheral blood of the non-specific mental retardation patients and analyze its diagnostic value for non-specific mental retardation.Methods:30 nonspecific mental retardation patients and 30 healthy controls were selected to measure the 10 miRNAs chosen from the domestic and international literature by real-time fluorescence quantitative PCR.Results:①There were no significant differences in age,gender,urban and rural between the control group and the case group(P＞0.05).②Compared with contrals,the expression levels of miRNA-125b,miRNA-132,miRNA-222,miRNA-223 and miRNA -363 were significant different in patients with non-specific mental retardation(P＜0.05);③ROC analysis showed that miRNA-222(AUC=0.786,P=0.043),miRNA-223(AUC=0.833,P=0.008)could be used to distinguish non-specific mental retardation patients from healthy controls.Conclusion:The abnormal expression of miRNA-222 and miRNA-223 may have some diagnostic value to non-specific mental retardation,which may be related to the pathogenesis of non-specific mental retardation.

Non-specific mental retardation;MiRNA;Real-time fluorescence quantitative PCR;Peripheral blood

R749.05

A

1005-1252(2017)01-0004-04

10.13342/j.cnki.cjhp.2017.01.002

2016-08-06)