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        血必凈注射液治療火器致兔ALI的康復(fù)價(jià)值及對(duì)肺組織NF—κB表達(dá)的影響

        2017-12-19 18:49:24徐曉峰許秀娟郝建吳升錢(qián)鈞李樹(shù)雯李霄茜
        關(guān)鍵詞:核因子急性肺損傷細(xì)胞因子

        徐曉峰++許秀娟+++郝建++吳升++錢(qián)鈞++李樹(shù)雯++李霄茜

        [摘要] 目的 探討血必凈(XBJ)注射液治療火器致兔急性肺損傷(ALI)的康復(fù)價(jià)值及對(duì)肺組織核因子-κB(NF-κB)表達(dá)的影響。 方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將SPF級(jí)健康雄性兔60只分為正常對(duì)照組、ALI模型組、生理鹽水組、低劑量XBJ治療組、中劑量XBJ治療組、高劑量XBJ治療組,每組各10只。ALI模型組、生理鹽水組、低劑量XBJ治療組、中劑量XBJ治療組、高劑量XBJ治療組吸入高溫氣體,制作完成兔ALI動(dòng)物模型;建模半小時(shí)后,低、中、高劑量XBJ治療組分別腹腔內(nèi)注射10、20、30 mg/kg XBJ,生理鹽水組注射生理鹽水,正常對(duì)照組和ALI模型組不做處理。觀察12 h后,處死兔并取左肺上葉肺組織,檢測(cè)肺組織NF-κB的表達(dá);在光鏡下對(duì)肺組織進(jìn)行病理學(xué)檢查,并及時(shí)記錄其病理變化。 結(jié)果 病理學(xué)檢查結(jié)果:正常對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁薄,肺泡內(nèi)未見(jiàn)水腫液;ALI模型組、生理鹽水組肺泡結(jié)構(gòu)模糊,肺泡壁斷裂,肺內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺組織間質(zhì)及肺泡腔出現(xiàn)明顯水腫,可見(jiàn)較多的紅細(xì)胞,肺泡壁間質(zhì)增厚,透明膜形成;經(jīng)XBJ治療的各組肺泡結(jié)構(gòu)仍存在,肺內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕,肺組織間質(zhì)及肺泡腔中度水腫,可見(jiàn)少量滲液、出血。肺組織Western blot分析顯示,ALI模型組NF-κB活性明顯高于正常對(duì)照組(P < 0.01);與ALI模型組、生理鹽水組比較,低、中、高劑量XBJ治療組兔肺組織中NF-κB活性明顯降低,差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01),其中,中劑量XBJ治療組降低最明顯,與低、高劑量XBJ治療組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05、P < 0.01)。 結(jié)論 XBJ注射液對(duì)火器傷誘導(dǎo)兔的ALI具有保護(hù)作用,且XBJ中劑量保護(hù)作用最明顯。

        [關(guān)鍵詞] 急性肺損傷;血必凈注射液;核因子-κB;細(xì)胞因子

        [中圖分類(lèi)號(hào)] R563 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210(2017)11(a)-0019-05

        The value of Xuebijing Injection on the rehabilitation of rabbits with acute lung injury induced by firearm injury and the effect on the expression of NF-κB in lung tissue

        XU Xiaofeng XU Xiujuan HAO Jian WU Sheng QIAN Jun LI Shuwen LI Xiaoqian

        Cardiopulmonary Rehabilitation Medicine Center, Hangzhou Sanatorium of People's Liberation Army, Zhejiang Province, Hangzhou 310007, China

        [Abstract] Objective To investigate the value of Xuebijing Injection (XBJ) on the rehabilitation of rabbits with acute lung injury (ALI) induced by firearm injury and the effect on the expression of nuclear factor kappa B (NF-κB) in lung tissue. Methods Sixty healthy male rabbits were randomly divided into normal control group, ALI model group, normal saline group, low dose of XBJ treatment group, medium dose of XBJ treatment group, high dose of XBJ treatment group by random number table mehtod, with 10 rats in each group. The rabbits of ALI model group, normal saline group, low dose of XBJ treatment group, medium dose of XBJ treatment group, high dose of XBJ treatment group were inhaled with high-temperature gas, so as to complete the model of rabbits with ALI. After modeling for half an hour, low, medium, high dose of XBJ treatment groups were respectively received intraperitoneal injection of 10, 20, 30 mg/kg XBJ, normal saline group was injected with normal saline, while normal control group and ALI model group were not dealt with any treatment. After 12 h, the rabbits were killed and the lung tissue of left upper lobe was taken to detect the expression of NF-κB in lung tissue; under the light microscope, the lung tissue was taken to make pathological examination, and the pathological changes were recorded in time. Results The results of pathological examination: in the normal control group, the alveolar structure was clear, the alveolar wall was thin, and no edematous fluid was found in the lung tissue; in the ALI model group and normal saline group, the alveolar structure was fuzzy, the alveolar wall was broken, there were a lot of inflammatory cells infiltration in the lung, obvious edema was found in the pulmonary mesenchyme and alveolar space, many red blood cells could be seen, and the mesenchyme of alveolar wall was thickened, the hyaline membrane was formed; after treatment by XBJ, the alveolar structures in all groups were still existed, the inflammatory cells infiltration in the lung was reduced, pulmonary mesenchyme and alveolar space showed moderate edema, less cataclysm and bleeding could be seen. Western blot of lung tissue showed that, the activity of NF-κB in ALI model group was significantly higher than that of normal control group (P < 0.01); compared with ALI model group and normal saline group, the activity of NF-κB in lung tissue of low, medium, high dose of XBJ treatment groups were all decreased, the differences were all highly statistically significant (P < 0.01), among which, medium dose of XBJ treatment group was decreased most significantly, which had statistically significant differences compared with those of low, high dose of XBJ treatment groups (P < 0.05, P < 0.01). Conclusion XBJ injection has protective effects on rabbits with ALI induced by firearm injury, and the protective effect of medium dose of XBJ is the most obvious.endprint

        [Key words] Acute lung injury; Xuebijing Injection; Nuclear factor kappa B; Cytokines

        急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是機(jī)體受到感染、誤吸、創(chuàng)傷和膿毒癥等致病因素?fù)p傷以后,肺組織產(chǎn)生的廣泛而過(guò)度的炎性反應(yīng),病理學(xué)特點(diǎn)是肺組織出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肺血管通透性增加,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,病死率高,是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)使用血必凈(XBJ)注射液對(duì)大鼠ALI具有保護(hù)作用[1],因此,本研究選用火器傷制作兔ALI模型,采用XBJ干預(yù)治療,測(cè)量兔肺組織中核因子-κB(NF-κB)的活性,旨在探討XBJ注射液治療火器致兔ALI康復(fù)價(jià)值及對(duì)肺組織NF-κB表達(dá)的影響,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下:

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        由安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供SPF級(jí)健康兔60只,雄性,體重1.80~2.20 kg,月齡1~4個(gè)月,合格證號(hào)為101193,倫理審批批號(hào)為20140319。

        1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

        XBJ注射液由上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號(hào)20150911,每支10 mg(2 mL)。NF-κB免疫印跡檢測(cè)試劑盒由上海博苑生物科技有限公司生產(chǎn)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 動(dòng)物分組 將SPF級(jí)健康雄性兔60只采取隨機(jī)數(shù)字表法分為六組:正常對(duì)照組、ALI模型組、生理鹽水組、低劑量XBJ治療組、中劑量XBJ治療組、高劑量XBJ治療組,每組各10只。

        1.3.2 動(dòng)物模型制作及處理 使用中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)火災(zāi)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制的高溫氣體實(shí)驗(yàn)裝置完成模擬火器傷致兔ALI實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[2]。具體方法:將各組兔稱(chēng)重并記錄體重?cái)?shù)據(jù),除正常對(duì)照組兔外,其余各組均用400 mg/kg的10%水合氯醛注射液注入至實(shí)驗(yàn)兔的腹腔中進(jìn)行麻醉,將麻醉好的兔放置在高溫氣體實(shí)驗(yàn)裝置內(nèi),啟動(dòng)點(diǎn)火,調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)?zāi)P脱b置內(nèi)可變溫度至150℃高溫氣體供給兔吸入,整個(gè)ALI的實(shí)驗(yàn)時(shí)間控制在3 min,完成兔ALI的動(dòng)物模型。造模成功與否參考X線(xiàn)以及CT等影像學(xué)檢查判斷,在行組織學(xué)評(píng)估時(shí)可見(jiàn)動(dòng)物模型中出現(xiàn)了ALI時(shí)上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞病理變化特征,同時(shí)伴隨出現(xiàn)了不同程度的炎癥表現(xiàn)。建模30 min后向生理鹽水組兔腹腔內(nèi)注射N(xiāo)aCl 10 mL/kg,分別向低劑量XBJ治療組、中劑量XBJ治療組、高劑量XBJ治療組兔腹腔內(nèi)注射XBJ 10、20、30 mg/kg,正常對(duì)照組和ALI模型組不做處理。

        1.3.3 標(biāo)本采集和處理 建模后12 h,用10%水合氯醛對(duì)六組兔進(jìn)行腹腔麻醉,劑量為400 mg/kg。將麻醉后的兔仰臥,四肢及頭部固定于操作臺(tái)上,用手術(shù)刀切開(kāi)胸腔,放血致兔死亡。用剪刀沿兩側(cè)腋中線(xiàn)向上至下頜部剖開(kāi),掀開(kāi)胸前壁,暴露出兔的氣管和肺臟,分離左肺上葉,用剪刀剪下,浸入10%福爾馬林溶液中,存儲(chǔ)在0℃低溫中保存,并做好標(biāo)記。

        1.3.4 測(cè)定兔肺組織中NF-κB的含量 采用免疫印跡(Western blot)測(cè)定兔肺組織中NF-κB的含量。實(shí)驗(yàn)過(guò)程采用的Western blot每組重復(fù)3次,條帶使用Quantity one灰度分析軟件實(shí)施精密分析。

        1.3.5 病理學(xué)檢查 采用10%甲醛溶液對(duì)兔的左上肺組織進(jìn)行固定、石蠟包埋、切片,再行HE染色,在光鏡下對(duì)肺組織進(jìn)行病理學(xué)檢查,并及時(shí)記錄其病理變化情況。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK法,以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組兔肺組織光學(xué)顯微鏡下病理學(xué)變化情況

        正常對(duì)照組(圖1A)肺組織中肺泡結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁薄,肺泡內(nèi)未見(jiàn)水腫液,肺間隙、肺毛細(xì)血管均顯示正常的形態(tài)學(xué)解剖。ALI模型組(圖1B)、生理鹽水組(圖1C)肺泡結(jié)構(gòu)模糊,肺泡壁斷裂,肺內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺組織間質(zhì)及肺泡腔出現(xiàn)明顯水腫,可見(jiàn)較多的紅細(xì)胞,肺泡壁間質(zhì)增厚,透明膜形成;低劑量XBJ治療組(圖1D)、中劑量XBJ治療組(圖1E)、高劑量XBJ治療組(圖1F)兔肺組織與正常對(duì)照組比較,肺內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕,肺組織間質(zhì)及肺泡腔輕中度水腫,可見(jiàn)少量滲液、出血,其中中劑量XBJ治療組損傷程度最輕,肺組織病理改變接近正常對(duì)照組,僅見(jiàn)少部分肺間質(zhì)及肺泡壁輕度水腫及少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

        2.2 Western blot驗(yàn)證結(jié)果

        各實(shí)驗(yàn)組肺組織β-actin與NF-κB灰度比較,見(jiàn)圖2~3。由圖2可見(jiàn),正常對(duì)照組β-actin灰度最高,但與ALI模型組及生理鹽水組相比并未呈現(xiàn)出明顯的差別,從低劑量XBJ組開(kāi)始,至中劑量XBJ治療組及高劑量XBJ治療組,β-actin灰度減少。圖3可見(jiàn),正常對(duì)照組NF-κB灰度最低,ALI模型組及生理鹽水組的NF-κB灰度呈現(xiàn)出較高的水平,但在使用了XBJ后,隨著劑量的增加,NF-κB灰度逐漸減少。

        2.3 各組兔肺組織NF-κB變化比較

        ALI模型組、生理鹽水組、低劑量XBJ治療組、中劑量XBJ治療組、高劑量XBJ治療組與正常對(duì)照組比較,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01);低劑量XBJ治療組、中劑量XBJ治療組、高劑量XBJ治療組與ALI模型組、生理鹽水組比較,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01);中劑量XBJ治療組、與低劑量XBJ治療組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05);中劑量XBJ治療組與高劑量XBJ治療組比較,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)。見(jiàn)表1。

        注:與正常對(duì)照組比較,aP < 0.01;與ALI模型組、生理鹽水組比較,bP < 0.01;與低劑量XBJ治療組比較,cP < 0.05;與中劑量XBJ治療組比較,dP < 0.01;ALI:急性肺損傷;XBJ:血必凈;NF-κB:核因子-κBendprint

        3 討論

        ALI是各種肺內(nèi)和/或肺外致病因素導(dǎo)致的急性彌漫性炎癥性肺損傷,ARDS是ALI進(jìn)一步惡化的結(jié)果,表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征和急性呼吸衰竭。ALI/ARDS病因多樣,如嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷及燒傷等導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫,引起急性呼吸窘迫和呼吸衰竭,其發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜。有研究表明,在ALI/ARDS病情的發(fā)生發(fā)展中,細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的調(diào)控失衡起著十分關(guān)鍵的作用[3-4]。體內(nèi)各臟器和肺內(nèi)的肺上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等釋放的白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、細(xì)胞間黏附因子1、粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子等細(xì)胞因子參與了ALI的發(fā)生、發(fā)展,這些細(xì)胞因子構(gòu)成了肺內(nèi)炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)[5-6]。NF-κB是參與炎性反應(yīng)的一個(gè)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,能調(diào)節(jié)與免疫及炎癥相關(guān)促炎介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。當(dāng)機(jī)體遭受致病因素?fù)p傷后,細(xì)胞受到脂多糖、TNF-α等信號(hào)刺激后,NF-κB被激活,活化的NF-κB迅速移位到細(xì)胞核與靶基因的特異序列相結(jié)合,啟動(dòng)信號(hào)通路和基因轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)[7-10]。由此可見(jiàn),ALI的發(fā)病機(jī)制涉及大部分細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控,包括NF-κB的活化。本研究對(duì)兔的肺組織經(jīng)Western blot分析,ALI模型組NF-κB活性明顯高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05),提示NF-κB參與了兔ALI的發(fā)病過(guò)程,且NF-κB的活化可能是構(gòu)成肺內(nèi)炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)一個(gè)中心環(huán)節(jié)。

        現(xiàn)代戰(zhàn)爭(zhēng)常使用火器或者各種燃燒物質(zhì)作為武器,導(dǎo)致人體ALI非常常見(jiàn),且火器導(dǎo)致ALI有其自身的特征[11-13]。本研究中,由病理圖片可見(jiàn),正常對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,顯示正常健康兔的肺解剖組織,其肺泡壁、肺泡腔、肺間隙、肺毛細(xì)血管均顯示正常的形態(tài)學(xué)解剖,ALI模型組實(shí)驗(yàn)兔其肺泡壁斷裂,肺泡腔融合變大,肺間質(zhì)增寬,肺毛細(xì)胞血管明顯充血、水腫,大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),透明膜形成,提示肺組織結(jié)構(gòu)已嚴(yán)重受損。故本課題成功制作了野戰(zhàn)狀態(tài)火器傷致ALI的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,并提示火器傷引起的ALI是直接對(duì)肺組織的損傷,可瞬間引起肺泡廣泛斷裂、肺間質(zhì)明顯水腫,肺組織結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重,導(dǎo)致急性氣體交換功能障礙,表現(xiàn)出嚴(yán)重的呼吸困難和呼吸窘迫等臨床癥狀。

        XBJ注射液是紅花、赤芍、川芎、丹參、當(dāng)歸等中藥材的提取物,主要成分為紅花黃色素A等,其中紅花、赤芍、丹參等具有活血化瘀功效,赤芍還能有效抑制急性炎癥引起的滲出,促進(jìn)炎癥吸收等[14-16];丹參能明顯改善微循環(huán),促進(jìn)組織修復(fù)與再生,對(duì)過(guò)度增生的纖維母細(xì)胞有抑制作用[17-19];當(dāng)歸具有活血、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抑菌、抗動(dòng)脈硬化和抗缺氧等功效[20]。XBJ注射液具有拮抗內(nèi)毒素、調(diào)節(jié)免疫功能、拮抗炎性因子、改善微環(huán)循、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等作用[21-22],臨床上可應(yīng)用于急性化膿性扁桃體炎、化膿性支氣管炎、細(xì)支氣管炎、腎盂腎炎、膀胱炎、尿道炎、腹腔內(nèi)感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征及因感染、創(chuàng)傷、燒傷等引起的多器官功能障礙綜合征等。一項(xiàng)XBJ治療膿毒癥及多器官功能障礙綜合征的前瞻性多中心的臨床研究表明XBJ具有控制炎性損傷的作用,其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)促炎因子與抗炎因子的平衡、抑制中性粒細(xì)胞在肺組織中的滲出和炎癥介質(zhì)的過(guò)度表達(dá)有關(guān)[23]。本研究對(duì)火器致兔ALI模型進(jìn)行XBJ干預(yù)治療,發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量XBJ治療組兔肺組織中NF-κB活性明顯降低,分別與ALI模型組、生理鹽水組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0.05),提示XBJ對(duì)ALI具有保護(hù)作用,生理鹽水沒(méi)有這種保護(hù)作用。低、中、高劑量XBJ治療組兔肺組織中NF-κβ活性以中劑量XBJ治療組降低最明顯,低劑量XBJ治療組與中劑量XBJ治療組、中劑量XBJ治療組與高劑量XBJ治療組比較均有顯著差異(P < 0.05),但低劑量XBJ治療組與高劑量XBJ治療組結(jié)果比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P > 0.05)。從病理上觀察,ALI模型組、生理鹽水組、低劑量XBJ治療組、高劑量XBJ治療組兔肺組織與正常對(duì)照組比較,其肺泡壁、肺泡腔、肺間隙、肺毛細(xì)血管均發(fā)生明顯的病理變化,中劑量XBJ治療組肺泡壁毛細(xì)血管輕度充血,肺間質(zhì)及肺泡壁輕度水腫,可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

        綜上所述,XBJ對(duì)ALI具有保護(hù)作用,在一定范圍內(nèi),XBJ對(duì)ALI的保護(hù)效果是隨著劑量增加而增強(qiáng),且中等劑量XBJ對(duì)肺組織的保護(hù)作用效果最好,但超過(guò)中等劑量的XBJ對(duì)肺組織的保護(hù)作用則減弱。

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        (收稿日期:2017-08-04 本文編輯:張瑜杰)endprint

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