李晶琴 孔慶利 安云慶*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)系，北京 101300；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，北京 100069)

·基礎(chǔ)研究·

人殺菌/滲透增強蛋白N端功能片段基因突變文庫的構(gòu)建和鑒定

李晶琴1孔慶利2安云慶2*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)系，北京 101300；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，北京 100069)

目的為提高殺菌/滲透性增強蛋白N端功能片段BPI23對內(nèi)毒素(lipopolysaccharides,LPS)的親和性，通過易錯聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)和DNA改組技術(shù)，對其編碼序列BPI600進行突變，在大腸桿菌XL10-Gold中構(gòu)建BPI600基因突變體庫。方法通過控制Mg2+和Mn2+的濃度進行易錯PCR，獲得BPI600隨機突變基因片段，經(jīng)測序和基因比對，確定BPI600的隨機突變率。再對易錯PCR產(chǎn)物進行DNA改組，將改組產(chǎn)物克隆至pYD1載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL10-Gold，從Amp抗性(Luria-Bertani,LB)固體培養(yǎng)平板上任選10個單菌落，增菌后提取質(zhì)粒，得到pYD1-shuffledBPI600重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒進行HindⅢ/XhoⅠ酶切鑒定，取5個陽性質(zhì)粒進行DNA測序，通過基因和氨基酸比對鑒定突變情況。結(jié)果測序和基因比對顯示，BPI600經(jīng)易錯PCR所獲突變文庫的隨機突變率達2.3%；改組后重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果表明，在隨機選擇的10個菌落所提質(zhì)粒中，有6個含BPI600，表明構(gòu)建了重組質(zhì)粒pYD1-shuffledBPI600；在5個陽性質(zhì)粒中，有4個重組質(zhì)粒的BPI23編碼序列分別發(fā)生了6、9、11和14個堿基突變；1個不僅有10個堿基突變，還存在1個堿基的缺失。氨基酸比對表明，有2個質(zhì)粒(分別有6和14個堿基突變)具有正確的讀碼框，能夠翻譯完整的蛋白質(zhì)，各有4或14個氨基酸突變。3個質(zhì)粒因含終止密碼子而不能表達完整目的蛋白。結(jié)論成功構(gòu)建pYD1-shuffledBPI600重組質(zhì)粒，獲得庫容量為2×105的突變文庫，為高內(nèi)毒素親和力突變體的篩選奠定了基礎(chǔ)。

人殺菌/滲透增強蛋白；定向進化；易錯PCR；DNA改組

殺菌/滲透增強蛋白(bactericidal/permeability increasing protein，BPI)是生物體內(nèi)存在的一種陽離子抗菌蛋白，BPI及其功能性N端片段BPI23具有廣譜殺傷包括耐藥菌株在內(nèi)的革蘭陰性菌以及中和內(nèi)毒素的作用[1]，在臨床上具有較大的應(yīng)用前景。

為進一步提高BPI23與內(nèi)毒素的親和性和抗感染效果，本實驗在前期構(gòu)建的pYD1-BPI600重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，對BPI N端功能片段BPI23的編碼序列BPI600進行定向進化。蛋白質(zhì)定向進化可以模擬自然進化的過程(隨機突變或重組)，通過人為地改變反應(yīng)條件，在體外進行基因的突變或重組，以構(gòu)建突變體庫并從中篩選出理想突變體。易錯PCR(error-prone polymerase chain reaction,EP-PCR)和DNA改組(DNA shuffling)是目前常用的定向進化技術(shù)[2]。易錯PCR基于Taq DNA聚合酶不具備3′→5′外切酶活性，缺乏校對功能，故在DNA擴增過程中會發(fā)生錯誤摻入而引起突變[3]。DNA改組是將親本基因進行盡可能多的組合，最終獲得大容量基因突變體庫的技術(shù)[4]。本實驗通過易錯PCR和DNA改組技術(shù)，構(gòu)建了大容量的BPI600突變體庫，為優(yōu)勢突變體的篩選打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

大腸桿菌DH5α由本室保存，大腸桿菌XL10-Gold超級感受態(tài)細胞購自美國Stratagene公司，pMD18-T載體購自日本TaKaRa公司，質(zhì)粒pYD1-BPI600由本室構(gòu)建，包含BPI600基因(約600 bp)。載體pYD1全長5 009 bp，購自美國Invitrogen公司。

1.1.2 主要試劑

dCTP、dTTP、dATP、dGTP、Taq DNA 聚合酶、MnCl2、MgCl2購自上海生工生物工程公司。NZ胺購自美國Amresco公司、β-巰基乙醇(β-ME)購自美國Stratagene公司。限制性內(nèi)切酶BamHI、HindⅢ購自日本TaKaRa公司。100 bp Ladder Marker、DL2000 Marker購自中國BioDev公司。DL15000購自日本TaKaRa公司。DNA小片段膠回收試劑盒購自中國BioDev公司。質(zhì)粒大量提取試劑盒購自威格拉斯生物技術(shù)有限責(zé)任公司。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物設(shè)計與合成

參照GenBank中BPI基因的序列，設(shè)計擴增BPI600的引物，P1：5′-CCC AAG CTT GTC AAC CCT GGC GTC GTG-3′，添加HindⅢ酶切位點(下劃線標(biāo)示)，P2：5′-CCG CTC GAG TCA TAT TTT GGT CAT TAC TGG-3′，添加XhoⅠ酶切位點(下劃線標(biāo)示)；P3:5′-AGTAACGTTTGTCAGTAATTGC-3′，P4:5′-GTCGA TTTTGTTACATCT ACAC-3′，為載體pYD1測序引物；P5：5′-GTC AAC CCT GGC GTC GTG-3′，P6:5′-TAT TTT GGT CAT TAC TGG-3′為易錯PCR設(shè)計引物。P1/P2、P5/P6由上海生工生物工程公司合成；P3/P4購自美國Invitrogen公司。

1.2 易錯PCR

1.2.1 隨機突變片段的獲得

在高Mg2+離子濃度(5.0 mmol/L)和Mn2+存在的條件下，通過選擇不同的Mg2+濃度來控制隨機突變的頻率。以質(zhì)粒pYD1-BPI600為模板進行易錯PCR。反應(yīng)體系為(50 μL)：10×EP-PCR 緩沖液5 μL，dNTP混合物(各10 mmol/L)1 μL，P5、P6引物(均為10 μmol/L)各2 μL，質(zhì)粒模板1 μL，MnCl2(5 mmol/L)5 μL，Taq DNA 聚合酶(5 u/μL)0.25 μL，去離子水加至50 μL。擴增條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃ 1 min、55℃ 1 min、72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)。用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物，并在紫外燈下分離出含大小約600 bp基因片段的凝膠，利用DNA小片段膠回收試劑盒純化回收BPI600隨機突變片段；以回收物為模板，再行第二輪易錯PCR，按上述方法回收純化大小約為600 bp突變基因片段。

1.2.2 突變基因的克隆和鑒定

將純化的易錯PCR產(chǎn)物連接至克隆載體pMD18-T中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。利用Amp抗性(Luria-Bertani,LB)固體培養(yǎng)基進行篩選，菌落PCR鑒定是否含插入片段，并從含插入片段的陽性菌落中隨機挑取5個菌落進行測序和基因比對，并計算隨機突變率。

1.3 DNA改組

1.3.1 隨機突變基因片段化處理

將易錯PCR獲得的隨機突變基因片段利用超聲波進行碎片化處理，條件為：功率設(shè)為4 W，冰浴下超聲6 s，間隔12 s，循環(huán)處理400次。產(chǎn)物經(jīng)2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳，切下大小為50～100 bp左右的條帶，用DNA小片段回收試劑盒進行回收純化。

1.3.2 無引物PCR

反應(yīng)體系(20 μL)為：10×PCR buffer 2 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.2 μL，DNA小片段10 μL，Taq DNA 聚合酶(5 u/μL)0.25 μL，加超純水至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s、45 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共50個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳鑒定反應(yīng)產(chǎn)物片段大小。

1.3.3 有引物PCR

將上述無引物PCR產(chǎn)物1∶20稀釋后，作為模板進行有引物PCR擴增。反應(yīng)體系(20 μL)為：無引物PCR產(chǎn)物稀釋液5 μL，10×PCR buffer 2 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，P1和P2各1 μL，Taq DNA 聚合酶(5 μ/μL)0.25 μL，加超純水至50 μL。擴增條件為：95℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 60 s、57 ℃ 60 s、72 ℃ 75 s，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳分離后，在紫外燈下切下約600 bp的凝膠條帶，用DNA小片段膠回收試劑盒回收、純化BPI600的改組片段。

1.4 重組質(zhì)粒文庫的構(gòu)建和鑒定

1.4.1 重組質(zhì)粒文庫的構(gòu)建

BPI600改組基因片段和質(zhì)粒載體pYD1分別用HindⅢ/XhoⅠ酶切，產(chǎn)物分別經(jīng)1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳分離后，在紫外燈下切下含目的基因片段的凝膠，用DNA小片段膠回收試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物并進行連接，反應(yīng)體系為：質(zhì)粒載體pYD1的酶切產(chǎn)物0.5 μL，BPI600改組基因的酶切產(chǎn)物7.5 μL，10×連接緩沖液1 μL，T4 DNA連接酶1 μL，總體積10 μL；16 ℃孵育12 h。用預(yù)冷槍頭取大腸桿菌XL10-Gold超級感受態(tài)細胞100 μL、β-ME 4 μL放入預(yù)冷的Falcon聚丙烯離心管中，輕輕混勻后冰浴10 min；再加入1 μL上述連接產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)使感受態(tài)細胞與連接產(chǎn)物混勻，冰浴30 min；將聚丙烯離心管置于 42 ℃水浴中作用30 s后，立即放入冰浴中作用2 min；再加入預(yù)熱的NZY+肉湯900 μL，37 ℃、225 r/min培養(yǎng)1 h后，取100 μL菌液涂布于Amp抗性LB固體培養(yǎng)基上；37 ℃培養(yǎng)12～16 h，獲得Amp抗性陽性克隆菌，計數(shù)菌落數(shù)。

1.4.2 重組質(zhì)粒文庫的鑒定

從Amp抗性LB固體培養(yǎng)基上隨機挑取10個單菌落，增菌、提取質(zhì)粒后進行酶切鑒定；再從經(jīng)鑒定含有插入片段的陽性轉(zhuǎn)化菌落所提質(zhì)粒中隨機選取5個，在pYD1測序引物P3和P4的引導(dǎo)下進行測序分析。測序結(jié)果與GenBank中的野生型BPI600序列進行DNA比對，分析pYD1-shuffledBPI600重組質(zhì)粒中目的基因的突變情況。

2 結(jié)果

2.1 易錯PCR結(jié)果

1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳證實兩輪易錯PCR均成功擴增出大小約為600 bp的基因片段(圖1)。

圖1 易錯PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 The product of EP-PCR

1：product of the first EP-PCR;2：product of the second EP-PCR;3：DL 2 000 marker;EP: error prone;PCR: polymerase chain reaction

從Amp抗性LB固體培養(yǎng)基篩選出的BPI600的隨機突變基因庫中，隨機挑選經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性的5個菌落進行測序，測序結(jié)果與野生型BPI600基因進行比對(圖2)，經(jīng)過計算，BPI600隨機突變庫的隨機突變率達2.3%(68/3 000)。

2.2 DNA改組結(jié)果

對易錯PCR產(chǎn)物進行碎片化處理后，獲得50～100 bp左右的隨機片段，經(jīng)50個循環(huán)的無引物PCR，小片段DNA被拼接成許多大小不一的改組分子，再經(jīng)過35個循環(huán)的有引物PCR，重聚到與原基因分子大小相同的BPI600改組分子(圖3)。

2.3 pYD1-shuffled BPI600重組質(zhì)粒文庫的構(gòu)建與鑒定結(jié)果

將有引物PCR產(chǎn)物克隆至pYD1載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pYD1-shuffledBPI600，并用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL10-Gold，在Amp抗性LB固體培養(yǎng)平板上獲得Amp抗性陽性克隆菌，計數(shù)菌落數(shù)，獲得了2×105個轉(zhuǎn)化子。

從上述平板上隨機選取10個單菌落，增菌后提取質(zhì)粒，用HindⅢ和XhoⅠ酶切，在10個質(zhì)粒中，6個被酶切為大小約為4 841 bp和600 bp的兩個條帶，表明重組質(zhì)粒中插入了BPI600片段(圖4)。

將酶切鑒定后的5個陽性克隆進行測序分析，與NCBI GenBank中野生型BPI編碼序列比對，其中第1、2、4、5號質(zhì)粒分別發(fā)生9、14、6、11個堿基突變(圖5)；第3號質(zhì)粒不僅有10個堿基突變，還存在一個堿基的缺失(圖6)。氨基酸序列比對結(jié)果(圖7)表明，在5個克隆中，第2、4號質(zhì)粒具有正確的讀碼框，能夠翻譯完整的BPI23，且分別存在14和4個氨基酸突變；第1、3、5號質(zhì)粒因含終止密碼子而不能表達完整的目的蛋白。

圖2 5個易錯PCR陽性克隆的基因序列與野生型的比對結(jié)果Fig.2 Genetic comparison of 5 positive clones (after EP-PCR) with wild type

圖3 BPI600 DNA改組結(jié)果Fig.3 The product of BPI600 shuffling

1：fragmented fragments;2，3：product of primerless PCR;4：100 bp Ladder marker;5：product of PCR with primers;PCR:polymerase chain reaction.

圖4 pYD1-shuffled BPI600重組質(zhì)粒的酶切鑒定 Fig.4 Double digestion of recombinant plasmid pYD1-shuffled BPI600 by HindⅢ/XhoⅠ

1，3，4，5，7，8：positive clones;2，6，9，10：negative clones;M：100 bp Ladder marker

圖5 1、2、4、5號克隆的基因序列與野生型的比對結(jié)果Fig.5 Genetic comparison of the number 1,2,4,5 clone with wild type

圖6 3號克隆的基因序列與野生型的比對結(jié)果Fig.6 Genetic comparison of the number 3 clone with wild type

3 討論

蛋白質(zhì)的體外定向進化又稱實驗分子進化，因無需事先了解蛋白的空間結(jié)構(gòu)和作用機制，所以幾乎適用于任何蛋白質(zhì)分子的改造和優(yōu)選，為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系提供了一種更方便、更快捷的新途徑[2]。定向進化是否成功主要受以下3個方面的影響：①合理的進化策略；②合適的表達系統(tǒng)；③高通量的篩選方法。

在前期的實驗中，研究組已成功構(gòu)建了BPI23的釀酒酵母細胞表面展示系統(tǒng)，該系統(tǒng)能表達功能性BPI23，并可用流式細胞儀進行快速鑒定和高通量分選[5]，適合于大容量突變體庫的篩選和BPI23的進化研究。但有了合適的表達系統(tǒng)和高通量的篩選方法，還必須在有足夠大的突變體庫構(gòu)建成功的基礎(chǔ)上才能發(fā)揮作用。

易錯PCR是一種簡便易行的蛋白質(zhì)定向進化策略，已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的體外進化，如酶活性的提高[6-8]、酶熱穩(wěn)定性的改良[9]等。在本實驗中，通過控制Mg2+或Mn2+的濃度進行連續(xù)易錯PCR的方法[10]，成功進行了BPI600的隨機突變，突變率在2.3%，較為適于后續(xù)優(yōu)勢株的篩選[11]。到目前為止，尚未見到BPI亞型的報道，因此選擇易錯PCR產(chǎn)生的隨機突變庫作為進化的出發(fā)點，可能是避免異源基因?qū)氲囊粋€有效的方法。DNA改組是用DNaseI消化或超聲處理多條具有同源序列的基因(一般同源性>70%)或基因家族[12]。

圖7 2、4號改組克隆的氨基酸序列與野生型的比對結(jié)果Fig.7 Amino acid comparison of the number 2,4 clone with wild type

產(chǎn)生基因隨機裂解片段后，先用無引物PCR進行基因重排，然后再進行有引物PCR擴增全長基因可獲得大容量基因突變體庫，目前DNA改組技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因突變體庫的構(gòu)建，大容量的突變庫再結(jié)合高通量的篩選方法，便于優(yōu)勢突變體的篩選[13-15]。本實驗在易錯PCR產(chǎn)生隨機突變的基礎(chǔ)上進行DNA改組，與采用單純的隨機突變或定點突變方法構(gòu)建的突變庫相比，產(chǎn)生的庫容量大、多樣性好，可有效積累更多的有益突變，同時也可實現(xiàn)同源序列間的大片段交換，從而達到目的蛋白多種特性共進化的目的。實驗結(jié)果表明，構(gòu)建的pYD1-shuffledBPI600重組質(zhì)粒中含有能夠翻譯為完整BPI23突變體的DNA片段，但文庫中也存在一些突變克隆，因含終止密碼子，最終只能翻譯BPI23的部分氨基酸片段。本實驗成功構(gòu)建了庫容量達2×105的BPI600突變體庫和pYD1-shuffledBPI600重組質(zhì)粒文庫，為下一步篩選優(yōu)勢突變體的研究提供了新途徑。

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ConstructionandidentificationofgenemutationlibraryoftheN-terminalfragmentsofhumanbactericidal/permeabilityincreasingproteins

Li Jingqin1,Kong Qingli2,An Yunqing2*

(1.DepartmentofMedicalLaboratoryScience,YanjingMedicalCollege，CapitalMedicalUniversity，Beijing101300,China;2.DepartmentofImmunology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

ObjectiveTo construct and identify a gene mutation library of the N-terminal fragments of human bactericidal/permeability increasing proteins (BPI23) for enhancing its activity binding lipopolysaccharides (LPS) by error-prone polymerase chain reaction (PCR) and DNA shuffling method.MethodsError-prone PCR was used to obtain random mutant fragments ofBPI600by adding different concentrations of Mg2+and Mn2+.Random mutation rate was calculated by DNA sequencing and genetic comparison with wild-typeBPI600.The product of error-prone PCR was further mutated via DNA shuffling.The reassembled product was cloned into pYD1 vector and transformed intoE.coliXL10-Gold.Ten clones were randomly picked out,digested and identified by restriction enzymeHindⅢ andXhoⅠ.The positive clones were identified by DNA sequencing.ResultsDNA sequencing result showed that the random mutation rate was 2.3% by error-prone PCR.After DNA shuffling,6 positive clones includingBPI600were identified in the 10 random clones selected from LB culture medium with ampicillin.Among them,4 had 6,9,11 and 14 mutations,respectively;1 had 10 mutations and 1 deletion determined by DNA sequencing.By amino acid comparison,only 2 DNA mutants were able to encode a full-length mutant BPI23protein,with 4 and 14 amino acid mutations respectively.ConclusionA library of BPI23mutants was constructed with a size of 2×105.The results laid the foundation for the study of its activity binding LPS.

human bactericidal/permeability increasing protein;directed evolution;error-prone polymerase chain reaction(PCR);DNA shuffling

*Corresponding author，E-mail：anyunq@ccmu.edu.cn

時間：2017-12-13 21∶09

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2109.026.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.024]

Q78

2017-10-16)

編輯 陳瑞芳