陳 敏 于文嬌 李 昕,4,5 楊巍巍,4,5 李旭冉 于 順,4,5*

(1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學研究室 北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053；2.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)科學實驗室，廣西桂林 541001；3.首都醫(yī)科大學帕金森病臨床診療與研究中心，北京 100053；4.帕金森病北京市重點實驗室和教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京 100053；5.國家老年疾病臨床醫(yī)學研究中心，北京 100053)

·Alpha-突觸核蛋白的致病機制·

α-突觸核蛋白通過上調(diào)內(nèi)吞蛋白Rab5B促進海馬神經(jīng)元膜表面NMDA受體內(nèi)在化

陳 敏1,2于文嬌1,3李 昕1,3,4,5楊巍巍1,3,4,5李旭冉1,3于 順1,3,4,5*

(1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學研究室 北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053；2.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)科學實驗室，廣西桂林 541001；3.首都醫(yī)科大學帕金森病臨床診療與研究中心，北京 100053；4.帕金森病北京市重點實驗室和教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京 100053；5.國家老年疾病臨床醫(yī)學研究中心，北京 100053)

目的研究α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)對N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptors，NMDA)受體的調(diào)控及機制。方法在原代海馬神經(jīng)元，通過細胞外添加基因重組α-Syn和基因過表達α-Syn方法實現(xiàn)細胞內(nèi)α-Syn含量增高，基因敲減技術抑制Rab5B，Western blotting法分析NMDA 受體NR1亞單位和Rab5B表達。結果神經(jīng)元內(nèi)α-Syn含量增高可以使Rab5B表達上調(diào)，并降低膜表面NR1的水平；抑制Rab5B表達可有效反轉α-Syn所致的膜表面NR1水平下降。結論α-Syn通過上調(diào)Rab5B促進NMDA受體的內(nèi)在化。

α-突觸核蛋白；NMDA受體；內(nèi)在化；Rab5B；海馬神經(jīng)元

α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)是由140個氨基酸構成的小分子蛋白質(zhì)，在正常情況下主要以可溶性的單體形式存在于神經(jīng)元[1]。然而，α-Syn的代謝發(fā)生障礙，使其在神經(jīng)細胞內(nèi)異常積聚，進而聚集成纖維而以包涵體的形式沉積在神經(jīng)細胞內(nèi)[2]，形成突觸核蛋白病(α-synucleinopathy)包括帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、路易體癡呆(dementia with Lewy bodies,DLB)及多系統(tǒng)萎縮(multiple system atrophy,MSA)的標志性病理改變。研究[3-6]表明，異常表達的α-Syn參與突觸核蛋白病所共有的海馬相關記憶功能異常及認知功能下降，而記憶與認知障礙被認為與海馬神經(jīng)元N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受體功能異常密切相關[7-8]。但是，α-Syn在病理情況下的異常高表達是否影響海馬神經(jīng)元NMDA受體的表達進而導致認知下降尚未明確。

研究[9]表明，分泌到細胞外的α-Syn可以被一種被稱為Rab的GTP酶介導快速攝入細胞，且Rab5B被證明通過網(wǎng)格蛋白(clathrin)介導的內(nèi)吞機制促進NMDA受體的內(nèi)在化[10]。因此，本研究將利用大鼠海馬原代神經(jīng)元，通過基因過表達及敲減技術，研究α-Syn對NMDA受體的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康出生12 h內(nèi)新生Wistar大鼠(30只，分為6組，n=5)，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK-2014-004。杜恩斯組織勻漿器(Wheaton Kimble公司，美國)。Neurobasal A培養(yǎng)基、B27、L-谷氨酰胺、DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)；胎牛血清(Berlin公司，美國)；NMDA、MK-801(Sigma公司，美國)；Rab5B反義寡核苷酸(百恩維公司，中國)；NMDAR NR1抗體、Calnexin抗體、β-tubulin抗體(Abcam公司，美國)；Rab5B抗體(Santa Cruz公司，美國)；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(Pierce Biotech公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 重組人源α-Syn制備與純化

將人源α-Syn cDNA分別插入表達載體pET(3a)，然后轉化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞，在含氨芐西林的2%(質(zhì)量分數(shù))YTA 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導重組蛋白表達后，采用離子交換層析和反向層析法純化。純化后的蛋白分別用SDS-PAGE法和蛋白免疫印跡(Western blotting)法鑒定，BCA法測定蛋白濃度。部分純化α-Syn委托公司標記綠色熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)。

1.2.2 海馬原代神經(jīng)元培養(yǎng)

將出生12 h內(nèi)新生Wistar大鼠分離得到的海馬組織置于預冷解剖液中，剪碎加入0.25%(質(zhì)量分數(shù))胰酶消化40 min后終止消化；拋光滴管輕輕吹打成單細胞懸液；用200目尼龍網(wǎng)過濾后按2×105個/cm2的密度接種至多聚-L-賴氨酸預處理35 mm培養(yǎng)皿或75 cm2塑料培養(yǎng)瓶中。置于37 ℃，含5%(體積分數(shù)) CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待神經(jīng)元貼壁后改用Neurobasal A培養(yǎng)，后每隔3 d換半液。海馬原代神經(jīng)元培養(yǎng)至9 d時，向培養(yǎng)基中加入表達綠色熒光蛋白的慢病毒(lentivirus-green fluorescent protein,LV-GFP)或過表達α-Syn的慢病毒(LV-GFP-α-Syn)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；海馬原代神經(jīng)元培養(yǎng)至12 d時，分別向培養(yǎng)基中加入過濾除菌的PBS、溶菌酶(lysozyme)、純化的α-Syn或FITC-α-Syn(終濃度為10 μmol/L)，孵育24 h。

1.2.3 Rab5B反義寡核苷酸的制備

Rab5B反義寡核苷酸(antisense sequence，AS)及擾亂順序的寡核苷酸(scramble sequence，SS)其序列分別是：5′-GCTGTGCTTCTGCTAGTCATTTCAAGAGA ATGACTAGCAGAAGCACAGCTTTTTTCTCGAGG-3′和5′-GATCCCTCGAGAAAAAAGCTGTGCTTCTGCTAGT CATTCTCTTGAAATGACTAGCAGAAGCACAGC-3′。

1.2.4 細胞總蛋白及膜蛋白提取

向收集好的細胞里加入全細胞裂解液(或細胞膜裂解液)，充分懸浮細胞沉淀，冰上靜置裂解30 min，離心30 min(4 ℃，12 000 g)，上清即全細胞蛋白(或膜蛋白)，BCA法測定蛋白濃度。

1.2.5 Western blotting分析

采用7.5%(質(zhì)量分數(shù))SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，經(jīng)半干法將蛋白質(zhì)轉印至PVDF膜；PVDF膜與NMDAR NR1抗體(1∶1 000)、α-Syn抗體(3D5,1∶5 000)、Rab5B抗體(1∶1 000)、抗GFP單克隆抗體 (1∶1 000)、calnexin抗體(1：1 000)或抗β-tubulin抗體(1∶5 000)，4 ℃反應過夜，后與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗小鼠IgG(1∶5 000)室溫反應1 h，ECL試劑盒檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 α-Syn下調(diào)海馬神經(jīng)元細胞膜NMDARNR1濃度

Western blotting分析結果顯示，各組細胞總蛋白中的NMDAR NR1水平無差異；在PBS、對照蛋白Lysozyme及LV-GFP處理組，細胞膜上NMDAR NR1亞基水平較高；而用外加α-Syn和FITC-α-Syn及LV-GFP-α-Syn轉染處理的神經(jīng)元，細胞膜組分內(nèi)的NR1水平顯著下降(n=5,P<0.05)(圖1)。

2.2 α-Syn通過上調(diào)Rab5B促進海馬神經(jīng)元細胞膜NMDARNR1內(nèi)在化

Western blotting結果顯示，與對照組相比，α-Syn處理細胞(外加人重組α-Syn組、FITC-α-Syn及LV-GFP-α-Syn)中的Rab5B蛋白表達水平增高顯著(n=5,P<0.05)(圖2)。利用Rab5 siRNA抑制Rab5B表達后，Rab5B表達水平下降，同時α-Syn所致的膜表面NR1降低效應被反轉(圖3)。

圖2 α-Syn上調(diào)Rab5B蛋白的表達Fig.2 α-Syn up-regulates the expression of Rab5B protein

圖3 抑制Rab5B蛋白表達可反轉α-Syn降低的神經(jīng)元膜表面NR1的效應Fig.3 Inhibition of Rab5B expression reverses the effect of α-Syn on internalization of surface NR1

2 討論

本研究利用原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元研究了α-Syn對海馬神經(jīng)元膜表面NMDARs的影響。除了通過基因轉染方法實現(xiàn)細胞內(nèi)α-Syn過表達外，筆者還利用α-Syn可以迅速通過細胞膜的特性，通過細胞外添加α-Syn造成細胞內(nèi)α-Syn含量的增加。這種方法已在本課題組以往的研究中[11]得到論證。本研究發(fā)現(xiàn)，無論在α-Syn基因轉染神經(jīng)元還是細胞外添加α-Syn處理的神經(jīng)元，膜表面NR1的水平都發(fā)生明顯的下調(diào)，而細胞總NR1不變，由此推測，NR1發(fā)生了內(nèi)在化。鑒于NR1是構成功能性NMDARs的必須亞單位[8]，其在膜表面的減少意味著功能性NMDARs的減少。已知，Rab5B是一種調(diào)節(jié)內(nèi)吞機制的蛋白質(zhì)，以往在多巴胺神經(jīng)細胞證明該蛋白參與了α-Syn對NMDA受體內(nèi)在化的調(diào)控[12]。因此，在本研究進一步觀察了Rab5B在α-Syn調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元內(nèi)在化過程中的作用。結果顯示，海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)α-Syn含量增加伴隨Rab5B表達的增加，而抑制Rab5B的表達則顯著緩解過α-Syn所致的細胞膜表面NR1下調(diào)。這些結果提示Rab5B參與了α-Syn對海馬神經(jīng)神經(jīng)元膜表面NMDA受體內(nèi)在化的調(diào)控。

NMDA受體豐富表達于海馬神經(jīng)元，通過介導海馬神經(jīng)元長時程增強電位形成而參與學習和記憶活動，該受體在海馬神經(jīng)元膜表面減少將影響動物的學習和記憶功能[8]。研究[13-14]顯示，在阿爾茨海默病、PD和DLB患者以及模型動物的海馬神經(jīng)元膜表面的NMDA受體的密度降低，且這一改變與認知功能下降具有相關性。本研究探究了突觸核蛋白病的關鍵致病蛋白α-Syn與NMDA受體內(nèi)在化的相關機制，對揭示PD及DLB等與α-Syn相關的神經(jīng)退行性疾病的認知功能障礙的機制提供了線索。

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α-SynucleinpromotesNMDAreceptorinternalizationbyupregulationofendocytosisproteinRab5B

Chen Min1,2,Yu Wenjiao1,3,Li Xin1,3,4,5,Yang Weiwei1,3,4,5,Li Xuran1,3,Yu Shun1,3,4,5*

(1.DepartmentofNeurobiology,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingInstituteofGeriatrics,Beijing100053,China;2.LaboratoryofNeuroscience,AffliliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541001,GuangxiZhuangAutomousRegion,China;3.ClinicalCenterforParkinson’sDisease,CapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China;4.BeijingKeyLaboratoryforParkinson’sDiseaseandKeyLaboratoryofNeurodegenerativeDiseases,MinistryofEducation,Beijing100053,China;5.NationalClinicalResearchCenterforGeriatricDisorders,Beijing100053,China)

ObjectiveTo investigate the effect of α-synuclein (α-Syn) on surface N-methyl-D-aspartic acid receptors (NMDARs) in cultured rat hippocampal neurons.MethodsIncreased intracellular α-Syn was realized by extracellular addition of recombinant human α-Syn to the culture medium or transfection of human α-Syn gene to the neurons.Western blotting analysis was applied to observe the effects of α-Syn on levels of NMDA receptor NR1 subunit and Rab5B under conditions with or without Rab5B knockdown.ResultsIntracellular elevation of α-Syn decreased the surface expression of NMDA NR1 and cytoplasmic levels of Rab5B;Inhibition of Rab5B expression reversed the effects of α-Syn.ConclusionThe accumulation of α-Syn in hippocampal neurons can promote the internalization of surface NMDARs through an endocytic mechanism that requires participation of Rab5B.

α-synuclein;NMDA receptor;internalization;Rab5B;hippocampal neurons

國家自然科學基金(81371200,81071014,81401042)，北京市醫(yī)院管理局“使命”計劃專項經(jīng)費資助(SML20150803)，北京市科學技術委員會資助(Z161100005116011，Z171100000117013)，北京市衛(wèi)生和計劃生育委員會項目(PXM2017_026283_000002)，廣西自然科學基金(2014GXNSFAA118197)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81371200,81071014,81401042),Beijing Municipal Administration of Hospitals’ Mission Plan (SML20150803),Beijing Municipal Science &Technology Commission (Z161100005116011，Z171100000117013),Beijing Municipal Commission of Health and Family Planning (PXM2017_026283_000002),Natural Science Foundation of Guangxi (2014GXNSFAA118197).

*Corresponding author，E-mail：yushun103@163.com

時間：2017-12-13 20∶53

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2053.018.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.017]

Q 189

2017-10-23)

編輯 慕 萌