楊盈赤 張忠濤

(首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院普外科，北京 100050)

·消化外科專題·

液體活檢技術在結直腸癌精準醫(yī)療中的應用與挑戰(zhàn)

楊盈赤 張忠濤*

(首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院普外科，北京 100050)

隨著精準醫(yī)療在腫瘤臨床領域中的廣泛開展，對腫瘤分子生物學特性進行實時動態(tài)監(jiān)測的需求越來越高。近年來，液體活檢以簡便快捷、微創(chuàng)、實時、特異性高和克服時空異質(zhì)性等特點在腫瘤臨床診斷與治療中發(fā)揮著越來越重要的價值。本文圍繞液體活檢的兩種主要技術：循環(huán)腫瘤細胞和循環(huán)腫瘤DNA檢測技術的特點，介紹了其在結直腸癌精準醫(yī)療領域的最新研究進展，探討了面臨的挑戰(zhàn)和可行的解決方案。

液體活檢；結直腸癌；循環(huán)腫瘤細胞；循環(huán)腫瘤DNA

隨著生物技術的不斷發(fā)展和精準醫(yī)療的推進，結直腸癌的治療模式也逐漸發(fā)展為以手術治療為主的綜合性治療[1]。在這項系統(tǒng)而精細的“醫(yī)學工程”中，從組織到細胞直至分子層面的關于腫瘤的全方位信息，為早期診斷、用藥指導、術后監(jiān)測和療效評估等臨床診療環(huán)節(jié)提供了保障。液體活檢(liquid biopsy,LB)作為精準醫(yī)療新技術，因其可定性定量檢測腫瘤直接相關的腫瘤細胞和DNA，并具有非入侵性、取樣便捷、實時監(jiān)測等特點，逐步在腫瘤診療中發(fā)揮越來越重要的作用[2]。

其中檢測循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)和循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是液體活檢中最具代表性的兩種技術[3]。本文著重介紹液體活檢技術在結直腸癌診療中的應用進展和面臨的挑戰(zhàn)。

1 CTC和ctDNA技術簡介

CTC是指由腫瘤原發(fā)灶或轉移灶進入血液循環(huán)的腫瘤細胞。1869年首次提出循環(huán)腫瘤細胞的概念[3]。CTC 的分離方法主要有兩類，一是物理學方法，如依據(jù)細胞直徑、密度、電荷及可塑性等，采用密度梯度離心法、膜過濾法、介電電泳等方法加以分選；二是免疫學方法，如基于細胞抗原表達、蛋白分泌及侵襲性等，根據(jù)其表面標志物如 Ep CAM、CK等實現(xiàn)細胞分離富集[4]。分離富集得到的CTC可用于后續(xù)的鑒定分析，根據(jù)不同應用目的而選擇不同的鑒定方法，目前臨床應用較為成熟的是基于免疫熒光、原位雜交等方法[5]。

ctDNA指來自于腫瘤細胞的凋亡、壞死或分泌釋放到外周血的游離DNA(circulating free DNA,cfDNA)，因其攜帶了腫瘤的基因變異特征，如突變、插入、缺失、重排、拷貝數(shù)異常和甲基化等，這是檢測ctDNA的理論基礎。ctDNA的檢測可分為定性和定量兩個方面，前者主要檢測血漿中腫瘤特異性基因變異，后者則檢測血漿中ctDNA總量。這兩種方法均可以反映腫瘤的存在和嚴重程度，但目前ctDNA定性分析在臨床實踐中應用較為成熟，如檢測基因突變、插入、缺失、融合、重排、拷貝數(shù)變異、甲基化、微衛(wèi)星不穩(wěn)定 (microsatellite instability，MSI) 和雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH) 等[6]。

2 CTC檢測在結直腸癌診療中的應用

2.1 輔助診斷

許多研究[7-9]證實CTC可很好地反映結直腸癌患者的臨床病理特點并有助于輔助診斷。在臨床診斷階段可充分利用CTC檢測，聯(lián)合影像學檢查，在傳統(tǒng)TNM分期基礎上，輔助精準分期，及時了解早期微轉移灶存在風險，制定更為合理的個體化治療方案。CTC數(shù)量與淋巴結轉移與否密切相關，不僅淋巴結轉移性結直腸癌患者的CTC數(shù)量明顯高于非轉移性患者，而且與患者是否有腹腔轉移具有明顯相關性[7]。同時CTC同腫瘤侵犯深度、是否血管侵犯及肝轉移等均具有明顯的相關性[8]。目前，美國癌癥聯(lián)合會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)乳腺癌系統(tǒng)分期中[9]，在臨床和(或)影像學未發(fā)現(xiàn)轉移證據(jù)的情況下，如果在骨髓或循環(huán)血中發(fā)現(xiàn)播散腫瘤細胞(即CTC)，可作為一個新的M分期(遠端轉移)-cM0(i+)標準，介于M0和M1之間，這種分期是否適合應用于結直腸癌，將來在更多的循證醫(yī)學證據(jù)支持下會成為指南更新的熱點。

2.2 預后評價和復發(fā)轉移預測

胃腸道腫瘤中結直腸癌是首先被食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準適用于CTC檢測判斷預后[2]，目前關于CTC與結直腸癌患者的預后相關性的研究數(shù)量遠遠多于其他胃腸道腫瘤，多項研究[10-13]證實了CTC可以對結直腸癌患者的長期生存進行很好的預判。術后高CTC數(shù)目明顯升高或持續(xù)升高均提示結直腸癌患者預后不良[10]。對于術前接受過短期放射治療(以下簡稱放療)的直腸癌患者，雖然術前CTC水平不能評價預后，但術后 7 d的CTC濃度是局部轉移的獨立預后因子[11]。另外有Meta分析[12]結果均顯示基線CTC計數(shù)是與結直腸癌患者無進展生存期(progress free survival，PFS) 和總生存期(overall survival，OS)有關的獨立預后因素。目前CTC作為獨立預后因子評價結直腸癌患者生存期已經(jīng)成為一種共識，可以指導其他胃腸道腫瘤的臨床實踐。

結直腸癌伴有轉移的患者外周血中CTC數(shù)量明顯高于未轉移患者和健康志愿者。有研究者[13]發(fā)現(xiàn)術后CTC陽性患者出現(xiàn)復發(fā)的危險高于術后病理淋巴結陽性的患者，而兩者均陽性的患者發(fā)生復發(fā)的概率明顯增加。也有研究者[14]發(fā)現(xiàn)手術前后CTC均陰性的結直腸癌患者無復發(fā)生存期顯著高于術前后均陽性的對照組(P=0.000)。一項更加長期的研究[13]結果顯示，術前檢測到CTC的患者，其術后無轉移復發(fā)生存期明顯低于未檢測出 CTC的患者，而術后數(shù)周內(nèi)患者CTC數(shù)目與無復發(fā)生存期無顯著相關性，但術后 2～3 年內(nèi) CTC數(shù)目與無轉移復發(fā)生存期有相關性，提示不僅可以利用CTC檢測預測患者術后復發(fā)轉移的風險，還可在術后病程中動態(tài)跟蹤監(jiān)測，指導臨床根據(jù)患者情況及早介入診療等。

2.3 治療效果評估

臨床實踐中，除了手術治療方式外，各種治療手段如新輔助放療及化學藥物治療(以下簡稱放化療)、聯(lián)合化療、靶向治療和生物治療等也成為了結直腸癌綜合治療的重要組成部分。但不是所有的放化療等輔助治療都有利于延長生存期，如對于放化療無效的患者來說放化療不良反應反而影響患者的生存質(zhì)量。Barbazán等[14]研究發(fā)現(xiàn)在治療后，通過常規(guī)影像學檢查判定為治療有效的患者中，仍有部分CTC陽性，而這部分患者具有較差的長期生存，該研究指出通過CTC的檢測可以鑒別出常規(guī)影像學檢查無法發(fā)現(xiàn)的對治療抵抗的患者，并且可以及時地給予針對性的治療。

3 ctDNA在胃腸道腫瘤診療中的應用

3.1 早期篩查

ctDNA甲基化與早期結直腸癌腫瘤相關性的研究[15-17]較多。一項大規(guī)模、多中心、前瞻性結直腸癌臨床篩查試驗[15]從定期行結腸鏡檢查的患者中招募了超過7 900例志愿者，其中53例檢查發(fā)現(xiàn)患有結直腸癌，血漿ctDNA中SEPT9基因異常甲基化在無癥狀CRC患者中作為篩查診斷試驗的敏感度為48.2%，特異度為91.5%。雖然兩項研究敏感度差別較大，但兩研究均表明ctDNA中SEPT9基因異常甲基化檢測在結直腸癌篩查或診斷中的價值。但是，目前采用ctDNA檢測技術對早期患者的診斷依然處于科研探索階段,作為一些熱點突變的初篩和腫瘤組織檢測的補充，更加廣泛的臨床應用還需更多循證醫(yī)學證據(jù)的支持。

3.2 靶向治療指導

以ctDNA中基因變異信息為基礎的腫瘤分子分型能夠極大地方便腫瘤個體化治療的靶點選擇，所以目前ctDNA最直接的臨床應用是鑒定特異的基因突變指導靶向治療的選擇。部分對ctDNA的KRAS突變的研究[16-17]表明ctDNA能夠進行相關體細胞突變分析用于腫瘤分子分型，然后選擇個體化靶向治療。Arena等[16]探索性使用一個能結合上皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)胞外區(qū)域(extracellular domain，ECD) 多個位點的寡克隆抗體 MM-151 治療西妥昔單抗和帕尼單抗耐藥的結腸癌患者后，檢測 ctDNA發(fā)現(xiàn)EGFR-ECD突變率降低。

靶向藥物的使用往往會面臨著耐藥的出現(xiàn)，而KRAS、BRAF基因突變往往是轉移性結直腸癌三線治療原發(fā)抵抗的主要原因。Diaz等[17]選取KRAS野生型的轉移性CRC患者，予以帕尼單抗靶向治療，部分患者仍有耐藥發(fā)生，ctDNA檢測發(fā)現(xiàn)，KRAS突變在治療前以低頻亞克隆的形式存在(之前組織未檢出)；隨訪5～6月，該人群中ctDNA中KRAS突變檢出率為38%，同時9例發(fā)生新BRAF突變。研究提示ct DNA檢測可突破組織檢測限制，更好反映腫瘤基因變異全貌。

3.3 預后評價和動態(tài)監(jiān)測

目前已有研究[15-16，18]證實ctDNA的突變頻率與結直腸癌的預后具有相關性。Lecomte等[18]對37例結直腸癌患者生存分析(平均隨訪22個月)，結果顯示KRAS突變及CDKN2A啟動子超甲基化的陽性患者2年整體生存率僅為48%，而無上述基因變異的患者2年整體生存率可達100%。研究提示ctDNA中KRAS突變或CDKN2A啟動子超甲基化可能是結直腸癌的獨立預后因素。

ctDNA半衰期短，僅允許在幾個小時的間隔內(nèi)動態(tài)評估腫瘤狀態(tài)，所以ctDNA檢測可以更加精確地監(jiān)測腫瘤患者治療過程中的腫瘤動態(tài)和負荷變化。

系統(tǒng)性研究[15-16]顯示，肺癌、結腸癌等發(fā)生復發(fā)轉移時，ctDNA含量明顯增高。另外，ctDNA中微衛(wèi)星改變也用作監(jiān)測治療反應的指標和治療后隨訪指標，在患者分類和監(jiān)測腫瘤復發(fā)研究中已體現(xiàn)出潛在價值。

4 CTC和ctDNA在結直腸癌診療中的聯(lián)合應用

ctDNA所攜帶的腫瘤基因變異信息較為全面，能克服腫瘤異質(zhì)性問題，并且檢測方法較為統(tǒng)一;而CTC作為完整的細胞，不僅包含DNA信息，還有RNA、蛋白質(zhì)信息等，而且基于多樣的分析方法，可以在細胞和亞細胞層次作分子功能研究，更能全方位揭示腫瘤特征。目前，CTC在腫瘤的臨床應用多集中于輔助診斷與預后判斷，ctDNA則多集中于靶向藥的使用指導及耐藥情況的監(jiān)測；而兩者都與腫瘤負荷、治療療效、病情進展等相關，因此，兩者相互結合聯(lián)合應用，臨床的指導意義更大，CTC和ctDNA技術對比見表1。2015年美國臨床腫瘤學會(American Society of Clinical Oncology，ASCO)會議提出，腫瘤整個疾病周期中，液體活檢CTC與ctDNA應當聯(lián)合應用的建議，例如，早期CTC檢測到循環(huán)腫瘤細胞，提示人體內(nèi)可能存在腫瘤細胞；進一步結合ctDNA基因測序提示可能患有癌癥，就可以經(jīng)傳統(tǒng)影像學檢測進一步確診；然后，新一代測序技術(new generation of sequencing,NGS)全基因測序提示癌癥特性，并提供對應個性化用藥指導，治療后利用CTC進行定期的監(jiān)測等具體方案。

5 問題與展望

綜合以上臨床應用研究，CTC和ctDNA作為液體活檢的兩個重要組成部分，在結直腸癌的個體化診療的臨床實踐的不同階段和方面發(fā)揮著越來越重要的作用。但就像任何一種新生事物一樣，在發(fā)展的初期同樣要面對很多質(zhì)疑和挑戰(zhàn)，還有很多問題需要解決。

首先，技術層面上，液體活檢檢測技術方法種類眾多，但是缺乏行業(yè)標準；而臨床中對于任何一項面向患者的檢測技術，無論在特異度、敏感度和檢測穩(wěn)定性都有較高要求。第二，現(xiàn)有液體檢測收費相對比較昂貴，如何不斷改進技術，降低成本，減輕腫瘤患者經(jīng)濟負擔，仍需要各方面的共同努力。第三，科研層面上，在將液體活檢全面應用到臨床的過程中，還有一些科學問題值得探究，并加以驗證，例如液體活檢如何能夠敏感特異的應用到腫瘤早期篩查和診斷中；液體活檢在手術、放化療前后檢測時間點如何設置更加合理；CTC本身活性狀態(tài)或基因變異情況與患者預后狀態(tài)的關系等。

表1 CTC和ctDNA技術應用對比Tab.1 Comparison of using of CTC and ctDNA

NGS: new generation of sequencing;FDA:Food and Drug Administration；CFDA：China Food and Drug Administration；CTC：circulating tumor cell；ctDNA:circulating tumor DNA.

最后，期待通過臨床醫(yī)師、技術專家和政府部門三方共同推動液體活檢技術在醫(yī)療臨床實踐中的應用，使每一位腫瘤患者能夠真正在精準醫(yī)療的時代中享受到個體化診療的益處。

[1] Ryuk J P,Choi G S,Park J S,et al.Predictive factors and the prognosis of recurrence of colorectal cancer within 2 years after curative resection [J].Ann Surg Treat Res,2014,86(3): 143-151.

[2] Ignatiadis M,Lee M,Jeffrey S.Circulating tumor cells and circulating tumor DNA: challenges and opportunities on the path to clinical utility [J].Clin Cancer Res,2015,21(21): 4786-4800.

[3] Lowes L E,Bratman S V,Dittamore R,et al.Circulating tumor cells (CTC) and Cell-free DNA (cfDNA) Work Shop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation [J].Int J Mol Sci,2016,17(9): pii: E1505.

[4] Galatea K,Eleni P,Saad A,et al.Evaluation of isolation methods for circulating tumor cells (CTCs) [J].Cell Physiol Biochem,2016,40: 411-419.

[5] Dive C,Brady G.Snap shot: circulating tumor cells [J].Cell,2017,169(1):176.

[6] Newman A M,Bratman S V,To J,et al.An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage [J].Nat Med,2014,20(5): 548-554.

[7] Wong S C,Chan C M,Mab B,et al.Clinical significance of cytokeratin 20-positive circulating tumor cells detected by a refined immunomagnetic enrichment assay in colorectal cancer patients [J].Clin Cancer Res,2009,15(3): 1005-1012.

[8] Sastre J,Maestro M L,Puente J,et al.Circulating tumor cells in colorectal cancer: correlation with clinical and pathological variables [J].Ann Oncol,2008,19(5): 935-938.

[9] Amin M B,Edge S,Greene F,et al.AJCC cancer staging manual[M].8th.New York: Springer,2017.

[10] Galizia G,Gemei M,Orditura M,et al.Postoperative detection of circulating tumor cells predicts tumor recurrence in colorectal cancer patients [J].J Gastrointest Surg,2013,17 (10): 1809-1818.

[11] Nesteruk D,Rutkowski A,Fabisiewicz S,et al．Evaluation of prognostic significance of circulating tumor cells detection in rectal cancer patients treated with preoperative radiotherapy:prospectively collected material data [J].Biomed Res Int,2014,2014:712827.

[12] Rahbari N N,Aigner M,Thorlund K,et al.Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer [J].Gastroenterology,2010,138(5): 1714-1726.

[13] Van Dalum G,Stam G J,Scholten L F,et al.Importance of circulating tumor cells in newly diagnosed colorectal cancer [J].Int J Oncol,2015,46(3):1361-1368.

[14] Barbazán J,Muinelo-Romay L,Vieito M,et al.A multimarker panel for circulating tumor cells detection predicts patient outcome and therapy response in metastatic colorectal cancer [J].Int J Cancer,2014,135(11): 2633-2643.

[15] Church T R,Wandell M,Lofton-Day C,et al.Prospective evaluation of methylated SEPT9 in plasma for detection of asymptomatic colorectal cancer [J].Gut,2014,63(2): 317-325.

[16] Arena S,Siravegna G,Mussolin B,et al.MM-151 overcomes acquired resistance to cetuximab and panitumumab in colorectal cancers harboring EGFR extracellular domain mutations [J].Sci Translat Med,2016,8(324): 314-324.

[17] Diaz L J,Williams R T,Wu J,et al.The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers [J].Nature,2012,486(7404) : 537-540.

[18] Lecomte T,Berger A,Zinzindohou F,et al.Detection of free-circulating tumor-associated DNA in plasma of colorectal cancer patients and its association with prognosis [J].Int J Cancer,2002,100(5): 542-548.

Clinicalapplicationandchallengeofliquidbiopsyintheprecisionmedicineofcolorectalcancer

Yang Yingchi,Zhang Zhongtao*

(DepartmentofGeneralSurgery,BeijingFriendshipHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China)

With the rapid development of precision medicine in cancer，the demand for dynamic monitoring of tumor molecular characteristic has been increased.In recent years,liquid biopsy is currently playing a more and more important role in diagnosis and treatment of cancer in clinical practice due to its convenience,non-invasiveness,high specificity and overcoming temporal-spatial heterogeneity.This review introduces circulating tumor cell (CTC) and circulating tumor DNA (ctDNA) as the most important technique in liquid biopsy,mainly focusing on their technological feature,especially recent research progress in colorectal cancer.Further,the challenge and possible solution are discussed in the clinic application of liquid biopsy.

liquid biopsy;colorectal cancer；circulating tumor cells;circulating tumor DNA

國家科技支撐計劃課題(2015BAI13B)，北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術人才培養(yǎng)計劃資助項目(2015-3-005)。This study was supported by National Science and Technology Support Program(2015BAI13B),Beijing Municipal Health System High-level Health Technician Training Program(2015-3-005).

*Corresponding author，E-mail：zhongtaozt@hotmail.com.

時間：2017-12-13 21∶09

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2109.028.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.001]

R735.3

2017-10-16)

編輯 慕 萌