賈婉萍,梁立碩,馮凱悅,周秋娟,梁永強(華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科,唐山 063000;通訊作者,E-mail:lych810@foxmail.com)

摻鎂透鈣磷石對骨質(zhì)疏松兔骨缺損的成骨效果

賈婉萍,梁立碩,馮凱悅,周秋娟,梁永強*
(華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科,唐山 063000;*通訊作者,E-mail:lych810@foxmail.com)

目的 探討摻鎂6.67%透鈣磷石骨水泥修復(fù)家兔骨質(zhì)疏松的橈骨骨缺損的成骨效果。 方法 27只雌性新西蘭白兔進行骨質(zhì)疏松造模,之后隨機分為對照組、透鈣磷石組、摻鎂6.67%透鈣磷石組(摻鎂6.67%組),每組9只。在雙側(cè)橈骨中段制作長15 mm的骨缺損,缺損處對照組不充填任何材料,透鈣磷石組植入透鈣磷石骨水泥,摻鎂6.67%組植入摻鎂6.67%透鈣磷石骨水泥。于術(shù)后4,8,12周,通過肉眼觀察、拍攝X線片觀察缺損區(qū)影像學(xué)變化和免疫組化觀察血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)在缺損區(qū)的表達與分布判斷骨缺損的修復(fù)情況。 結(jié)果 12周時摻鎂6.67%組骨缺損修復(fù)基本完成,其余組缺損仍成凹形,摻鎂6.67%組成骨效果最佳;免疫組化顯示,PDGF在第4周表達最高,8周、12周時逐步降低,4周、8周時,摻鎂6.67%組表達比透鈣磷石組高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 摻鎂6.67%透鈣磷石可促進骨質(zhì)疏松骨缺損的愈合,修復(fù)早期可促進PDGF的表達。

橈骨骨缺損; 骨質(zhì)疏松; 摻鎂透鈣磷石; 血小板源性生長因子; 兔

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種全身性骨代謝性疾病,具有骨量降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨質(zhì)脆性增加的特點,老年人和絕經(jīng)后女性比較多發(fā),易發(fā)生骨折且愈合緩慢。隨著中國進入老齡化社會,患有骨質(zhì)疏松癥的患者越來越多。外傷、畸形、腫瘤等諸多因素都會造成骨組織損傷,近年來骨組織工程學(xué)飛快發(fā)展,骨替代生物材料研究成為熱點。透鈣磷石與動物硬組織中礦物質(zhì)成分相似,可作為支架材料植入骨缺損,自身降解的同時能引導(dǎo)周圍骨組織的生長。骨骼中鍶(Sr)、鎂(Mg)等微量元素參與骨的新陳代謝。目前關(guān)于摻鍶透鈣磷石的研究多有報道[1,2],國內(nèi)尚無透鈣磷石中摻入Mg離子的研究,國內(nèi)外尚無摻鎂透鈣磷石修復(fù)骨質(zhì)疏松骨缺損的研究。鎂(magneium,Mg)是人體內(nèi)重要的元素,參與細胞的增殖分化,影響骨基質(zhì)和骨礦物質(zhì)的代謝,在骨生長中起著重要作用。透鈣磷石分子結(jié)構(gòu)中的鈣元素比較活潑,容易被別的元素取代,本實驗將鎂離子引入透鈣磷石中修復(fù)骨質(zhì)疏松家兔橈骨骨缺損,以期能促進骨質(zhì)疏松骨缺損的愈合,縮短修復(fù)時間。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

磷酸氫鈣二水合物(CaHPO4·2H2O),碳酸鈣(CaCO3),三水合磷酸氫鎂(MgHPO4·3H2O,Sigma-Aldrich,Spain),一水磷酸二氫鈣(Ca(H2PO4)2·H2O),焦磷酸鈉(Na4P2O7),一水檸檬酸,以上材料均購于天津光復(fù)精細化工有限公司,分析純。

1.2 骨水泥的制備

將CaHPO4·2H2O和CaCO3以2 ∶1的摩爾比均勻混合后置于馬沸爐,1 000 ℃下燒結(jié)12 h制備β-TCP[3]。用摩爾比2 ∶1的(MgHPO4·3H2O+CaHPO4·2H2O)和CaCO3燒結(jié)制備β-TCMP。Mg/(Mg+Ca)的摩爾分數(shù)為6.67%,(Mg+Ca)/P摩爾比恒定為1.5。燒結(jié)后充分研磨,β-TCP和β-TCMP粉末分別與Ca(H2PO4)2·H2O、焦磷酸鈉、和3 g/ml固化液調(diào)拌30 s,裝入高10 mm,直徑5 mm的圓柱形模具中,37 ℃恒溫箱固化24 h后脫模。

1.3 建立骨質(zhì)疏松模型

采用肌注地塞米松+去勢的方法建立兔骨質(zhì)疏松模型[4,5]。麻醉,取仰臥位,備皮消毒,鋪無菌洞巾。沿腹白線切開2 cm打開腹腔,將卵巢兩端的血管和組織結(jié)扎,切除雙側(cè)卵巢后縫合。術(shù)后肌注地塞米松0.5 mg/kg,每周2次,持續(xù)8周。

術(shù)后8周進行腰椎的骨密度(bone mineral density,BMD)檢測。結(jié)果顯示術(shù)后BMD均值小于術(shù)前均值減去2倍標準差[6],提示造模成功。

1.4 實驗動物與分組

4月齡雌性新西蘭大耳白兔27只,2.0-2.5 kg,同一種源,清潔級。由華北理工大學(xué)實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(京)2007-0001。骨質(zhì)疏松造模后隨機分為對照組、透鈣磷石組和摻鎂6.67%組,每組9只。本實驗操作均遵循實驗動物倫理委員和管理委員會規(guī)定。

1.5 骨缺損的制備及骨水泥的植入

10%水合氯醛3 ml/kg經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉,取仰臥位,備皮消毒,鋪無菌洞巾。前臂橈側(cè)處作切口,分離筋膜,暴露橈骨。用無菌不銹鋼尺測量15 mm,用手術(shù)刀切開兩截骨點骨膜,齒科低速渦輪機和砂輪垂直截取15 mm橈骨,同時用無菌生理鹽水沖洗降溫[7]。缺損處置入消毒好的水泥塊后縫合。術(shù)后連續(xù)肌注青霉素3 d,每次20萬單位,每日兩次。

1.6 觀察指標

術(shù)后觀察家兔狀態(tài)、進食進水情況,及有無感染。于4,8,12周處死動物每組各3只,肉眼觀察后將其固定于4%多聚甲醛溶液中48 h,骨缺損處拍攝X線片觀察缺損區(qū)修復(fù)的影像學(xué)變化。免疫組化觀察PDGF的表達情況,用Image-Pro Plus6.0軟件測量BMP-2的平均光密度值(MOD值)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

骨水泥周圍軟組織均未出現(xiàn)變性壞死,無化膿感染。4周時,對照組大量纖維組織充填缺損區(qū),未見骨痂;透鈣磷石組骨水泥邊緣溶解,骨水泥溶解部分被纖維性骨痂代替;摻鎂6.67%組骨水泥大部分溶解,骨痂生成較多。8周時,對照組可見少量新生骨;透鈣磷石組缺損呈凹形;摻鎂6.67%組有大量新生骨但連接不全。12周時,對照組缺損面積較大;透鈣磷石組缺損端新骨呈淺凹形相接;摻鎂6.67%組缺損區(qū)基本修復(fù)(見圖1)。

2.2 X線表現(xiàn)

4周時,對照組低密度透射影像,邊緣規(guī)則;透鈣磷石組骨水泥邊緣少量溶解;摻鎂6.67%組有新生骨沉積,骨水泥大部分溶解。8周時,對照組未見新骨影像;透鈣磷石組缺損斷端和底部的骨沉積形成楔形;摻鎂6.67%組骨水泥大部分溶解,新生骨呈楔形沉積在骨缺損兩端段,尚有部分缺損未修復(fù)。12周時,對照組骨缺損仍有大面積未修復(fù),斷端硬化,未出現(xiàn)骨性聯(lián)接;透鈣磷石組缺損未完全修復(fù);摻鎂6.67%組缺損完成修復(fù),但骨髓腔未見明顯再通影像(見圖2)。

圖1 各組骨缺損大體觀察Figure 1 Gross observation of bone defects in each group

圖2 各組骨缺損X線觀察Figure 2 X-ray of bone defects in each group

2.3 免疫組化結(jié)果

PDGF是與創(chuàng)傷修復(fù)過程相關(guān)的因子,本實驗主要表達在骨痂中的破骨細胞、成骨細胞、骨髓中未分化的間充質(zhì)細胞的胞質(zhì)內(nèi)。細胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒即為陽性表達,深棕為強陽性,淺黃為弱陽性。4周時,三組PDGF均為強陽性表達,其中對照組表達最少,摻鎂6.67%組最多。8周、12周時,PDGF陽性表達逐步減少,組間區(qū)別同第4周(見圖3)。

2.4 各組PDGF表達的平均光密度值比較

用Image-Pro Plus 6.0測得每組PDGF表達的MOD值,比較各組之間的差異。單因素方法分析結(jié)果顯示,同組不同時間PDGF表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。4周和8周時,三組間兩兩比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

組別 4周8周12周FP 對照組0 1470±0 01290 1266±0 01450 1244±0 01474．710<0．05 透鈣磷石組0 1745±0 0140?0 1478±0 0160?0 1304±0 020510．168<0．05 摻鎂6 67%組0 2020±0 0182?#0 1781±0 0150?#0 1421±0 013721．931<0．05

與對照組比較,*P<0.05;與透鈣磷石組比較,#P<0.05

3 討論

研究表明[8]，骨質(zhì)疏松發(fā)生的主要原因是由于人體大量增加的哈弗氏重構(gòu),家兔具有完整的哈弗氏重構(gòu)系統(tǒng),可以模擬該病理過程。兔前肢承重小,橈骨和頜骨具備相似的骨環(huán)境,且骨缺損實驗易于制備和得到滿意的實驗結(jié)果,因此許多頜面外科研究用橈骨進行實驗。實驗通過去勢降低雌激素使骨代謝異常和注射地塞米松在基因和分子水平降低骨細胞的活性,制造骨質(zhì)疏松動物模型。缺損為切除橈骨中段15 mm,對照組12周時未愈合,符合極限缺損要求。

骨質(zhì)疏松癥患者由于骨再生能力缺乏,骨修復(fù)常常發(fā)生延遲愈合和愈合障礙等癥狀。中國慢慢進入人口老齡化社會,患骨質(zhì)疏松癥的人群也日益增長,骨質(zhì)疏松骨的愈合治療逐漸成為研究熱點。鎂元素參與骨生長和骨代謝,對于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥有重要的意義。Mutlu等[9]研究表明,正常血清中鎂的濃度顯著高于骨質(zhì)疏松癥患者,骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生可能與鎂的缺乏有關(guān)。Aydin等[10]每日給絕經(jīng)后患骨質(zhì)疏松癥的婦女補充檸檬酸鎂1 830 mg,1個月后骨鈣素水平顯著升高,提示補充適量的鎂對治療骨質(zhì)疏松癥有一定的作用。本實驗將鎂離子引入透鈣磷石中,Mg/Mg+Ca摩爾百分數(shù)為6.67%,含鎂量約為2%。鎂離子置換鈣離子后,透鈣磷石的孔隙率增加,為成骨細胞的黏附增殖提供空間,利于新骨的長入。Cabrejosazama等[11]細胞實驗顯示摻鎂透鈣磷石具有較好的生物相容性。12周時,摻鎂6.67%透鈣磷石組基本修復(fù)完成,而對照組仍有大面積骨缺損,透鈣磷石組缺損呈淺凹形,未完全修復(fù)。鎂的加入縮短了骨缺損的修復(fù)時間,增強了骨修復(fù)的成骨效果。鎂的加入增加了骨水泥的吸收速度,同時加快了新骨的形成,降解時間與骨修復(fù)平衡比透鈣磷石有所改善。

PDGF是一類具有有絲分裂和趨化作用的多功能陽離子糖蛋白,主要由血小板產(chǎn)生。能夠促進成骨和軟骨細胞增殖,從而刺激骨修復(fù)和發(fā)揮成骨作用,在骨愈合中起重要的作用[12]。當血清中其濃度較低時,骨缺損可能會延期愈合[13]。Chang等[14]通過大鼠牙槽骨缺損研究發(fā)現(xiàn),在骨修復(fù)過程中都有PDGF的參與,早期作用較大。在各組PDGF均在4周時表達最高,未分化間充質(zhì)細胞、成纖維細胞和成骨增殖活躍,大量充填在缺損區(qū)。8周、12周時表達逐步下降,新骨趨于成熟,細胞活動減少。提示PDGF主要作用于骨缺損修復(fù)早期。不同時間段,摻鎂6.67%組PDGF表達最高,對照組最低,表明鎂的加入促進了PDGF的形成,刺激了成骨細胞的活性與增殖,促進了骨的沉積鈣化,從而加快了形成新骨和骨缺損修復(fù)的速度。

摻鎂6.67%透鈣磷石骨水泥具有良好的生物相容性和明顯的成骨效果,鎂的摻入促進了PDGF的表達,縮短了骨缺損修復(fù)時間。作為骨替代材料,對臨床骨修復(fù)方面的應(yīng)用提供參考和理論依據(jù)。

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Effectofmagnesium-dopedcalciumhydrogenphosphatedehydrateonosteogenesisinosteoporoticbonedefectrabbits

JIA Wanping,LIANG Lishuo,FENG Kaiyue,ZHOU Qiujuan,LIANG Yongqiang*
(DepartmentofOrthodontics,CollegeofStomatology,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China;*Correspondingauthor,E-mail:lych810@foxmail.com)

ObjectiveTo evaluate the effect of 6.67% magnesium-doped calcium hydrogenphosphate dehydrate on the repair of osteoporotic radius bone defect in rabbits.MethodsTwenty-seven female New Zealand rabbits were used to establish osteoporotic bone defect model, and then randomly divided into 3 groups(n=9 in each group): control group, calcium hydrogenphosphate dehydrate group and 6.67% magnesium-doped calcium hydrogenphosphate dehydrate group(6.67% magnesium-doped group).All rabbits were defected 15 mm long in bilateral radius. The defect was not filled in blank group,while the defect was filled with 6.67% magnesium-doped calcium hydrogenphosphate dehydrate and calcium hydrogenphosphate dehydrate in the other two groups,respectively. The repair of bone defect was observed by naked eyes, the image changes of bone defect was observed by X-ray, and the expression and distribution of platelet-derived growth factor(PDGF) were observed by immunohistochemistry at 4,8,12 week after operation.ResultsThe repair of bone defect was basically completed at 12 week in 6.67% magnesium-doped group, but remained concave in the other two groups. The effect in 6.67% magnesium-doped group was the best among three groups. The immunohistochemistry showed that the expression of PDGF was the highest at 4 week, and then decreased gradually. The expression of PDGF in 6.67% magnesium-doped group was higher than that of calcium hydrogenphosphate dehydrate group at 4, 8 week(P<0.05).ConclusionThe 6.67% magnesium-doped calcium hydrogenphosphate dehydrate can not only promote the healing of bone defect in osteoporosis but also promote the expression of PDGF in the early stage of repair.

radial bone defect; osteoporosis; magnesium-doped calcium hydrogenphosphate dehydrate; platelet-derived growth factor; rabbits

國家自然科學(xué)基金資助項目(81270965);河北省教育廳重點項目(ZD2015016)

賈婉萍,女,1989-10生,碩士,住院醫(yī)師，E-mail:1198728614@qq.com

2017-08-26

R783

A

1007-6611(2017)12-1260-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.12.013