唐海靈,郭漢青,張彥亭,閆 媛,莊 坤,張 欣(西安交通大學(xué)附屬西安市中心醫(yī)院消化內(nèi)科,西安 710003;通訊作者,E-mail:zhangxin7798@163.com)

ARHⅠ對胃癌細(xì)胞TRAIL凋亡敏感性的影響

唐海靈,郭漢青,張彥亭,閆 媛,莊 坤,張 欣*
(西安交通大學(xué)附屬西安市中心醫(yī)院消化內(nèi)科,西安 710003;*通訊作者,E-mail:zhangxin7798@163.com)

目的 探討ARHⅠ對TRAIL誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞BGC-823和MKN-28凋亡敏感性的影響。 方法 以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-ARHⅠ質(zhì)粒載體的BGC-823胃癌細(xì)胞系和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pU6、pU6-siARHⅠ質(zhì)粒載體的MKN-28胃癌細(xì)胞系為模型,以200 ng/ml的重組人可溶性TRAIL作用于細(xì)胞24 h,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,Western blot檢測Bax、Bcl-2、活化caspase-3的蛋白表達(dá)。 結(jié)果 過表達(dá)ARHⅠ顯著增強(qiáng)了TRAIL誘導(dǎo)的BGC-823胃癌細(xì)胞凋亡,凋亡率由(6.85±1.77)%增加至(28.14±3.29)%(P<0.01),而下調(diào)ARHⅠ表達(dá)顯著抑制了TRAIL誘導(dǎo)的MKN-28胃癌細(xì)胞凋亡,凋亡率由(35.02±3.89)%降低至(16.27±2.64)%(P<0.01);過表達(dá)ARHⅠ能夠提高Bax表達(dá)2.37±0.18倍(P<0.01)、降低Bcl-2表達(dá)0.54±0.06倍(P<0.01),而下調(diào)ARHⅠ表達(dá)能夠降低Bax表達(dá)0.45±0.08倍(P<0.01)、提高Bcl-2表達(dá)1.92±0.15倍(P<0.01)。 結(jié)論 調(diào)控ARHⅠ表達(dá)能夠影響胃癌細(xì)胞BGC-823和MKN-28對TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性。

胃癌; 抑癌基因; ARHⅠ; TRAIL; 細(xì)胞凋亡

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,在所有惡性腫瘤中胃癌發(fā)病率居第4位、死亡率居第3位。全球腫瘤統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,2012年胃癌患者新發(fā)病例95.2萬,死亡病例70萬,其中約50%的患者來自中國(新發(fā)病例40.5萬,死亡病例32.5萬)。近年來,盡管胃癌發(fā)病率與死亡率有所下降,但胃癌患者的5年生存率依然較低[1]。

ARHⅠ(aplysia ras homolog Ⅰ)是1999年發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因。ARHⅠ屬于Ras/Rap超家族,與該家族其他成員的同源性達(dá)50%-60%。人類ARHⅠ基因定位于染色體1p31,基因長度為8 kb,包括2個外顯子和1個內(nèi)含子,編碼蛋白分子量為26 kDa。ARHⅠ在正常組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá),但在腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)降低或缺失,而外源過表達(dá)ARHⅠ能夠抑制腫瘤細(xì)胞的惡性表型[2]。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)屬于腫瘤壞死因子超家族,人類TRAIL基因定位于染色體3q26,基因長度為20 kb,共包括5個外顯子和4個內(nèi)含子,編碼蛋白為Ⅱ型跨膜蛋白,分子量32.5 kDa。TRAIL也屬于抑癌基因,在正常組織中廣泛表達(dá),在腫瘤組織中低表達(dá),可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。本研究旨在探討ARHⅠ對TRAIL誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡敏感性的影響。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱(Thermo,美國);超凈工作臺(蘇州真田潔凈有限公司);熒光顯微鏡(Olympus,日本);臺式低溫離心機(jī)(Eppendorf,德國);多功能酶標(biāo)儀(Tecan,瑞士);蛋白電泳儀(Bio-Rad,美國);自動三重純水蒸餾器(上海精密儀器儀表有限公司);流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter,美國);凝膠成像分析系統(tǒng)(Alpha Innotech,美國)。

1.2 主要試劑

DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基(上海聯(lián)碩生物科技有限公司);胎牛血清(上海玉博生物科技有限公司);重組人可溶性TRAIL蛋白(PeproTech,美國);細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);Bax抗體、Bcl-2抗體、活化caspase-3抗體、β-actin抗體(Cell Signaling,美國);BCA蛋白定量試劑盒(上海玉博生物科技有限公司);ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce,美國)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

西安市中心醫(yī)院消化內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室已建立過表達(dá)ARHⅠ和下調(diào)ARHⅠ表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系,即穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-ARHⅠ質(zhì)粒的BGC-823細(xì)胞系,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pU6、pU6-siARHⅠ質(zhì)粒的MKN-28細(xì)胞系[4]。細(xì)胞復(fù)蘇后,用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng),胰酶消化法傳代細(xì)胞。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

分別收集上述4種處于對數(shù)生長期的BGC-823、MKN-28穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,接種于6孔板,每孔3×105個細(xì)胞,培養(yǎng)24 h,處理組加入200 ng/ml的重組人可溶性TRAIL,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞,PBS洗滌細(xì)胞2次,加入凋亡染色結(jié)合緩沖液,加入Annexin Ⅴ-FITC/PI染料,混勻后室溫避光孵育15 min,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)

分別收集上述4種處于對數(shù)生長期的BGC-823、MKN-28穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,接種于25 cm2培養(yǎng)瓶,每瓶1×106個細(xì)胞,培養(yǎng)24 h,處理組加入200 ng/ml的重組人可溶性TRAIL,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞,PBS洗滌細(xì)胞2次,提取總蛋白,采用BCA法進(jìn)行蛋白定量,制備電泳樣品,SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜,封閉后依次加入相應(yīng)的一抗、二抗,ECL發(fā)光法顯影并成像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)ARHⅠ對胃癌細(xì)胞TRAIL凋亡敏感性的影響

將穩(wěn)定過表達(dá)ARHⅠ的BGC-823胃癌細(xì)胞采用TRAIL處理后,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡狀況,結(jié)果表明,pIRES2-EGFP組細(xì)胞凋亡率為(1.22±0.34)%,pIRES2-EGFP-ARHⅠ組細(xì)胞凋亡率為(1.57±0.49)%,而TRAIL處理后,pIRES2-EGFP組凋亡率變?yōu)?6.85±1.77)%,pIRES2-EGFP-ARHⅠ組凋亡率變?yōu)?28.14±3.29)%(P<0.01,見圖1)。因此,過表達(dá)ARHⅠ對BGC-823細(xì)胞凋亡沒有影響,但能夠顯著增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡。

與pIRES2-EGFP+TRAIL組比較,**P<0.01圖1 過表達(dá)ARHⅠ對胃癌細(xì)胞TRAIL凋亡敏感性的影響Figure 1 Effects of ARHⅠ overexpression on apoptotic sensitivity of gastric cancer cells to TRAIL

2.2 過表達(dá)ARHⅠ和TRAIL對胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為分析過表達(dá)ARHⅠ和TRAIL刺激對BGC-823胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,通過Western blot檢測了Bax、Bcl-2、活化caspase-3的表達(dá)水平,結(jié)果表明,與pIRES2-EGFP組比較,過表達(dá)ARHⅠ提高了Bax表達(dá)2.37±0.18倍(P<0.01),降低了Bcl-2表達(dá)0.54±0.06倍(P<0.01),對活化caspase-3的表達(dá)水平無影響(見圖2)。TRAIL刺激對Bax、Bcl-2的表達(dá)無影響,但提高了活化caspase-3的表達(dá)水平,過表達(dá)ARHⅠ和TRAIL聯(lián)合作用進(jìn)一步顯著提高了活化caspase-3的表達(dá)水平。

圖2 過表達(dá)ARHⅠ和TRAIL對Bax、Bcl-2及活化caspase-3表達(dá)的影響Figure 2 Effects of ARHⅠ overexpression and TRAIL on Bax, Bcl-2, and activated caspase-3 expression

2.3 下調(diào)ARHⅠ表達(dá)對胃癌細(xì)胞TRAIL凋亡敏感性的影響

將下調(diào)ARHⅠ表達(dá)的MKN-28胃癌細(xì)胞采用TRAIL處理后,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡狀況,結(jié)果表明,pU6組細(xì)胞凋亡率為(12.45±2.18)%,pU6-siARHⅠ組細(xì)胞凋亡率為(7.54±1.86)%,而TRAIL處理后,pU6組凋亡率變?yōu)?35.02±3.89)%,pU6-siARHⅠ組凋亡率變?yōu)?16.27±2.64)%(P<0.01,見圖3)。因此,下調(diào)ARHⅠ表達(dá)能夠抑制MKN-28細(xì)胞凋亡,并且顯著抑制TRAIL誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡。

與pU6+TRAIL組比較,**P<0.01圖3 下調(diào)ARHⅠ表達(dá)對胃癌細(xì)胞TRAIL凋亡敏感性的影響Figure 3 Effects of ARHⅠ down-regulation on apoptotic sensitivity of gastric cancer cells to TRAIL

2.4 下調(diào)ARHⅠ表達(dá)和TRAIL對胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為分析下調(diào)ARHⅠ表達(dá)和TRAIL刺激對MKN-28胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,通過Western blot檢測了Bax、Bcl-2、活化caspase-3的表達(dá)水平,結(jié)果表明,與pU6組比較,下調(diào)ARHⅠ表達(dá)降低了Bax表達(dá)0.45±0.08倍(P<0.01),提高了Bcl-2表達(dá)1.92±0.15倍(P<0.01，見圖4)。

圖4 下調(diào)ARHⅠ表達(dá)和TRAIL對Bax、Bcl-2及活化caspase-3表達(dá)的影響Figure 4 Effects of ARHⅠ down-regulation and TRAIL on expression of Bax, Bcl-2, and activated caspase-3

TRAIL刺激對Bax、Bcl-2的表達(dá)無影響,但明顯提高了活化caspase-3的表達(dá)水平,而下調(diào)ARHⅠ表達(dá)顯著抑制了TRAIL誘導(dǎo)的活化caspase-3表達(dá)。

3 討論

ARHⅠ屬于Ras/Rap超家族成員,與原癌基因Ras同源性高達(dá)54%-59%,但ARHⅠ卻屬于腫瘤抑制基因,也是Ras/Rap超家族中發(fā)現(xiàn)的第一個抑癌基因。體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)ARHⅠ能夠通過多種機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。本研究組前期發(fā)現(xiàn),ARHⅠ在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)明顯降低甚至缺失,與胃癌分化程度及TNM臨床分期密切相關(guān),而外源過表達(dá)ARHⅠ能夠抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移,并提高胃癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶(5-FU)的化療敏感性[4,6]。

TRAIL具有顯著的腫瘤抑制效果,其對正常細(xì)胞沒有明顯毒副作用,卻能夠選擇性地誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,具有十分良好的應(yīng)用前景,目前重組人TRAIL蛋白已進(jìn)入Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)階段[7]。TRAIL能夠通過結(jié)合死亡受體4(death receptor 4,DR4)和死亡受體5(death receptor 5,DR5)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,涉及的凋亡通路包括死亡受體通路和線粒體通路[8]。雖然TRAIL能夠選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,但有些腫瘤細(xì)胞對TRAIL不敏感,即具有一定的耐藥性[9]。

本研究結(jié)果表明,在BGC-823胃癌細(xì)胞中過表達(dá)ARHⅠ能夠增強(qiáng)其對TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性,而在MKN-28胃癌細(xì)胞中下調(diào)ARHⅠ表達(dá)能夠降低其對TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性,即調(diào)控ARHⅠ表達(dá)可影響胃癌細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性,這對于TRAIL應(yīng)用于胃癌的臨床治療具有一定參考價值,可根據(jù)患者的ARHⅠ表達(dá)狀況預(yù)測TRAIL的治療效果。Bcl-2家族與TRAIL的耐藥性密切相關(guān)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ARHⅠ能夠提高促凋亡蛋白Bax的表達(dá)、降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),而下調(diào)ARHⅠ表達(dá)的作用則相反,由此可以推測ARHⅠ影響胃癌細(xì)胞TRAIL凋亡敏感性與Bax、Bcl-2的表達(dá)變化相關(guān)。因此,本研究結(jié)果初步證實(shí)ARHⅠ與胃癌細(xì)胞對TRAIL的凋亡敏感性緊密相關(guān)。

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EffectsofaplysiarashomologⅠontheapoptoticsensitivitytotumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligandingastriccancercells

TANG Hailing,GUO Hanqing,ZHANG Yanting,YAN Yuan,ZHUANG Kun,ZHANG Xin*
(DepartmentofGastroenterology,Xi’anCentralHospital,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710003,China;*Correspondingauthor,E-mail:zhangxin7798@163.com)

ObjectiveTo investigate the effects of aplysia ras homolog Ⅰ(ARHⅠ) on the apoptotic sensitivity to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL) in BGC-823 and MKN-28 gastric cancer cells.MethodsBGC-823 gastric cancer cells were stably transfected with plasmid vector pIRES2-EGFP or pIRES2-EGFP-ARHⅠ, and MKN-28 gastric cancer cells were stably transfected with plasmid vector pU6 or pU6-siARHⅠ. These stable cell lines were stimulated by 200 ng/ml recombinant human soluble TRAIL for 24 h. Flow cytometry was used to detect cell apoptosis and Western blot was used to detect the expression of Bax, Bcl-2 and activated caspase-3 protein.ResultsARHⅠ overexpression significantly enhanced TRAIL-induced BGC-823 gastric cancer cell apoptosis, and the apoptotic rate increased from (6.85±1.77)% to (28.14±3.29)%(P<0.01). ARHⅠ down-regulation significantly inhibited TRAIL-induced MKN-28 gastric cancer cell apoptosis, and the apoptotic rate decreased from (35.02±3.89)% to (16.27±2.64)%(P<0.01). ARHⅠ overexpression increased Bax expression by 2.37±0.18 times(P<0.01) and decreased Bcl-2 expression by 0.54±0.06 times(P<0.01), while ARHⅠ down-regulation decreased Bax expression by 0.45±0.08 times(P<0.01) and increased Bcl-2 expression by 1.92±0.15 times(P<0.01).ConclusionRegulation of ARHⅠ expression can affect the apoptotic sensitivity of BGC-823 and MKN-28 gastric cancer cells to TRAIL.

gastric cancer; tumor suppressor gene; aplysia ras homolog I; tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL); cell apoptosis

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81502084)

唐海靈,男,1980-07生,碩士,主治醫(yī)師,E-mail:xasthl@163.com

2017-10-22

R735.2

A

1007-6611(2017)12-1241-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.12.009