芮冬妹，朱珍，樊燕

(常州市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 常州 213000)

基因芯片技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌對利福平敏感性檢測中的臨床價值

芮冬妹，朱珍，樊燕

(常州市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 常州 213000)

目的探討基因芯片技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌(MTB)對利福平敏感性檢測中的臨床價值。方法同時采用羅氏固體培養(yǎng)法及基因芯片技術(shù)對2015年7月至2016年2月就診于常州市第三人民醫(yī)院的76例疑似耐多藥結(jié)核涂陽患者的痰標(biāo)本進(jìn)行MTB對利福平的敏感性檢測，以羅氏固體培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，對基因芯片技術(shù)的檢測效果進(jìn)行評價。結(jié)果76例標(biāo)本中，經(jīng)羅氏固體培養(yǎng)法常規(guī)培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)初步鑒別，12例為非結(jié)核分枝桿菌，MTB標(biāo)本共64例；經(jīng)基因芯片技術(shù)檢測，其中野生型54例，突變株10例，突變率為15.63%(10/64)，突變株中rpoB526突變5例、rpoB531突變2例、rpoB511突變、rpoB516突變及rpoB511、rpoB516兩者聯(lián)合突變各1例。以羅氏固體培養(yǎng)法的藥敏結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片法藥敏檢測的準(zhǔn)確率為98.44%，敏感度為98.18%，特異度為100.00%，陽性預(yù)測值為100.00%，陰性預(yù)測值為90.00%。結(jié)論采用基因芯片技術(shù)檢測MTB對利福平的敏感性具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

結(jié)核分枝桿菌；基因芯片；利福平；耐藥

目前，我國結(jié)核病的發(fā)病位居全球第二，隨著耐藥結(jié)核病的發(fā)病率日益增加，結(jié)核病診治的難度加大[1-3]?；蛐酒夹g(shù)快速、靈敏、準(zhǔn)確，不僅能檢測標(biāo)本對抗菌藥物的耐藥性，還能判讀發(fā)生耐藥的突變位點(diǎn)，有助于臨床耐藥菌的早發(fā)現(xiàn)及個體化用藥。本研究利用基因芯片技術(shù)及羅氏固體培養(yǎng)法同時對76例疑似耐多藥結(jié)核涂陽患者的痰標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)對利福平敏感性檢測，并以羅氏固體培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，對基因芯片技術(shù)的檢測結(jié)果進(jìn)行評價，以探討基因芯片技術(shù)在MTB對利福平敏感性檢測中的臨床應(yīng)用價值，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 本試驗(yàn)的標(biāo)本來源于2015年7月至2016年2月就診于我院的5類疑似耐多藥涂陽患者的痰標(biāo)本：(1)慢性排菌或復(fù)治失敗患者；(2)密切接觸耐多藥肺結(jié)核患者的涂陽肺結(jié)核患者；(3)初治失敗患者；(4)復(fù)發(fā)與返回的患者；(5)治療3個月后痰涂片仍陽性的初治涂陽患者(初治失敗、復(fù)發(fā)及應(yīng)用過抗結(jié)核藥物治療超過1個月為復(fù)治[4])。共納入76例患者，其痰標(biāo)本MTB涂片及培養(yǎng)均陽性。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)核患者痰標(biāo)本的處理、接種與培養(yǎng) 將收集的痰標(biāo)本加入等量4%氫氧化鈉，消化處理后進(jìn)行菌種培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性的標(biāo)本進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.2.2 MTB的菌種初步鑒別及藥敏試驗(yàn) 采用比例法對1.2.1步驟中的陽性標(biāo)本進(jìn)行菌種初步鑒別及藥敏試驗(yàn)，培養(yǎng)管采用珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供的分枝桿菌藥敏羅氏培養(yǎng)管11支套組(生產(chǎn)批號2015062103和2016092104)，具體操作按照操作說明進(jìn)行。

1.2.3 基因芯片技術(shù)檢測 依據(jù)博奧生物有限公司生產(chǎn)的晶芯?結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測試劑盒(生產(chǎn)批號0107161701)的操作說明進(jìn)行：用博奧生物有限公司生產(chǎn)的晶芯?E-CyclerTM 96快速核酸提取儀提取加入等量10%氫氧化鈉液化好的痰標(biāo)本中的核酸，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雜交緩沖液處理后放入博奧生物有限公司生產(chǎn)的晶芯?BioMixerTMⅡ芯片雜交儀中進(jìn)行雜交，然后在博奧生物有限公司生產(chǎn)的晶芯?SLideWasherTM 8芯片洗干儀中洗滌甩干，最終將處理好的芯片放入博奧生物有限公司生產(chǎn)的晶芯?LuxScanTM10K/B微陣列芯片掃描儀中進(jìn)行掃描和結(jié)果判讀，記錄判讀結(jié)果和芯片信息。

1.2.4 結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn) 對一個位點(diǎn)所包含的所有探針按信號值大小進(jìn)行排序，獲取信號值最大的探針：(1)若該信號值最大的探針為陽性并且為野生型探針，則該位點(diǎn)的基因型結(jié)果判讀為野生型；(2)若該信號值最大的探針為陽性并且為某種突變型探針，則該位點(diǎn)的基因型結(jié)果判讀為該突變型。

1.3 結(jié)果驗(yàn)證 以羅氏固體培養(yǎng)法的藥敏結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證基因芯片技術(shù)的檢測效果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以羅氏固體培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，評價基因芯片技術(shù)的敏感度、特異度等指標(biāo)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 入選患者的基本情況 76例研究對象中男性65例(85.53%)，女性11例(14.47%)，且基因芯片技術(shù)檢測出突變株的10例患者中男性9例(90.00%)，羅氏培養(yǎng)法檢測出耐藥的9例患者中男性8例(88.89%)。年齡21～91歲，平均(59.17±16.72)歲。 64例結(jié)核病患者中男性55例(85.94%)，女性9例(14.06%)。年齡21～91歲，平均(58.30±17.33)歲，其中低齡組(21～40歲)9例(14.09%)，中齡組(41～60歲)22例(34.38%)，高齡組(61～91歲)33例(51.56%)。

2.2 兩種方法的檢測結(jié)果及藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較 76例標(biāo)本中，通過羅氏固體培養(yǎng)法進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)+藥敏試驗(yàn)初步鑒別，12例為非結(jié)核分枝桿菌(nontuberpobculosis mycobacterpobia，NTM)，64 例為MTB。64例MTB中，經(jīng)基因芯片技術(shù)檢測，其中野生型54例，突變株10例，突變率為15.63%(10/64)，突變株中rpoB526突變5例，rpoB531突變2例，rpoB511突變、rpoB516突變，rpoB511、rpoB516兩者聯(lián)合突變各1例。對64例MTB標(biāo)本進(jìn)行利福平藥敏試驗(yàn)，基因芯片技術(shù)檢測結(jié)果共63例與羅氏固體培養(yǎng)法的檢測結(jié)果相符，總符合率為98.44%(63/64)，敏感度為98.18%(54/55)，特異度為100.00%(9/9)，陽性預(yù)測值為 100.00%(54/54)，陰性預(yù)測值 90.00%(9/10)，見表1。基因芯片技術(shù)檢測結(jié)果與羅氏固體培養(yǎng)法結(jié)果不一致的有1例，不符合率為1.56%，不符合的為rpoB526突變，羅氏固體培養(yǎng)法檢測提示對利福平敏感。

表1 基因芯片技術(shù)與羅氏固體培養(yǎng)法的利福平藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較(例)

2.3 初治與復(fù)治患者結(jié)果比較 64例患者中初治患者22例，復(fù)治患者42例(從來未用過抗結(jié)核藥物治療或新發(fā)病經(jīng)抗結(jié)核藥物治療未達(dá)1個月為初治)。初治患者中有3例耐藥，耐藥率為13.64%，復(fù)治患者中有6例耐藥，耐藥率為14.29%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩者耐藥率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.095，P＞0.05)。

3 討 論

MTB感染引起的結(jié)核病是一種慢性呼吸道傳染性疾病，該疾病危害國民健康和公共衛(wèi)生安全。近年來，隨著耐藥結(jié)核病的發(fā)病率日益增加，結(jié)核病診治的難度加大，故臨床急需一種快速、低廉、高效的檢測方法。基因芯片技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種新方法，該法利用MTB耐藥性與基因突變有關(guān)的分子機(jī)制，檢測相關(guān)的突變位點(diǎn)，根據(jù)突變情況判斷MTB耐藥性，并且檢測時間縮短到3～4 h，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，不僅能檢測標(biāo)本對抗菌藥物的耐藥性，還能判讀發(fā)生耐藥的突變位點(diǎn)，有助于臨床耐藥菌的早發(fā)現(xiàn)及個體化用藥。

利福平是抗結(jié)核一線主要藥物，且耐藥分子機(jī)制比較明確，主要由rpoB基因突變引起[5]。本研究中MTB對利福平的耐藥率為14.06%，高于尹力等[6]的報(bào)道結(jié)果，我國利福平耐藥率為9.63%。此外10例突變株中rpoB526突變5例，rpoB531突變2例，rpoB511突變、rpoB516突變及rpoB511、rpoB516兩者聯(lián)合突變各1例，主要突變位點(diǎn)與國內(nèi)報(bào)道[7-8]基本相同，但各位點(diǎn)所占比例有所不同，本研究中主要突變位點(diǎn)為rpoB526，而蘇雯婕等[8]的報(bào)道結(jié)果為rpoB531突變頻率最高，提示耐藥基因突變位點(diǎn)因地區(qū)不同而有所差別，所以開展地區(qū)性MTB耐藥基因的流行特征調(diào)查有利于各地區(qū)結(jié)核病的防治工作。

本研究以羅氏固體培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，評價基因芯片技術(shù)在檢測MTB對利福平中的價值，發(fā)現(xiàn)基因芯片技術(shù)與羅氏固體培養(yǎng)法有較高的符合率(98.44%)，敏感度為98.18%，特異度為100.00%。羅氏固體培養(yǎng)法是目前診斷結(jié)核耐藥的主要方法，雖然經(jīng)濟(jì)，但用時較長，不利于臨床早期發(fā)現(xiàn)MTB感染，常導(dǎo)致經(jīng)驗(yàn)用藥?；蛐酒夹g(shù)作為一種新型檢測方法，不僅能鑒別NTM與MTB，并能檢測出是否發(fā)生耐藥，具體指出耐藥位點(diǎn)，其特點(diǎn)快速、靈敏、準(zhǔn)確，為患者的診治節(jié)省了時間，滿足臨床早發(fā)現(xiàn)有效治療需求，有利于實(shí)行個體化用藥。

本研究結(jié)果顯示結(jié)核病患者兩大特點(diǎn)高齡和男性，與于梅等的報(bào)道結(jié)果相似[9]。本研究中，初治患者藥率為13.64%，復(fù)治患者耐藥率為14.29%，兩者耐藥率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，與吳淵等[10]的報(bào)道結(jié)果有所不同，他們的研究發(fā)現(xiàn)初治患者和復(fù)治患者耐藥率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。分析原因：首先本研究樣本量較小，其次，不同地區(qū)流行菌株有差異，各突變位點(diǎn)的發(fā)生頻率具有地域差異。筆者將在今后的研究中加大樣本量以得到更為準(zhǔn)確的結(jié)果。

綜上所述，本地區(qū)對利福平耐藥的MTB以rpoB526突變?yōu)橹?，基因芯片技術(shù)用于檢測MTB對利福平耐藥性，與羅氏固體培養(yǎng)法有較高的符合率，敏感性和特異性，可用于MTB對利福平耐藥性的快速檢測。

[1]全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組,全國第五次結(jié)核病例性病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[J].中國防癆雜志,2012,34(8):485-508．

[2]黃曙海,藍(lán)如束,劉飛鷹,等.廣西壯族自治區(qū)肺結(jié)核耐藥性調(diào)查及復(fù)治患者耐藥相關(guān)因素分析[J].中國防癆雜志,2013,35(9):711-717.

[3]陳明亭.全球結(jié)核病控制和患者治療耐多藥/廣泛耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家部長級會議在京召開[J].中國防癆雜志,2009,31(5):320.

[4]中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病分會.中國結(jié)核病分類法[J].中華結(jié)核與呼吸雜志,1998,21(12):716-717.

[5]梁亞萍,趙麗麗,高漫.124例耐多藥結(jié)核分枝桿菌基因突變特征分析[J].臨床肺科雜志,2016,21(4):592-594.

[6]尹力,肖東樓,王文杰.全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報(bào)告[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社,2010:48-52.

[7]楊輝,張國良,張明霞,等.某地區(qū)結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥相關(guān)基因突變特征分析[J].重慶醫(yī)學(xué),2012,41(34):3591-3593.

[8]蘇雯婕,蘇政軍,孟繁榮,等.95例耐多藥結(jié)核菌株rpoB基因突變的分子特征[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2012,28(14):2333-2335.

[9]于梅,車洋,平國華,等.2007年至2010年寧波市結(jié)核病耐藥趨勢及影響因素[J].中華傳染病雜志,2012,30(1):48-52.

[10]吳淵,廖雁,歐陽國棟,等.佛山市順德區(qū)肺結(jié)核耐抗結(jié)核藥物分析[J].實(shí)用臨床醫(yī)學(xué),2016,17(2):87-89.

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B

1003—6350（2017）22—3714—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.22.032

江蘇省常州市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(編號：CJ20122011)

朱珍。E-mail：jsczzz_hi@126.com

2017-02-17)